Fabrication de microsphères poreuses hautement ouvertes (HOPM) via la technologie microfluidique

Résumé

Le présent protocole décrit la fabrication de microsphères poreuses hautement ouvertes (HOPM) à base de poly(acide lactique-co-glycolique) au moyen de la technologie microfluidique facile basée sur la formulation à émulsion unique. Ces microsphères ont des applications potentielles dans l’ingénierie tissulaire et le criblage de médicaments.

Résumé

Par rapport aux échafaudages en vrac et à l’injection directe de cellules seules, les unités modulaires injectables ont suscité un énorme intérêt pour la réparation des tissus défectueux en raison de la commodité de l’emballage des cellules, de l’amélioration de la rétention cellulaire et du caractère invasif minimal. De plus, la conformation poreuse de ces transporteurs microscopiques pourrait améliorer l’échange de milieu et améliorer le niveau de nutriments et d’oxygène. La présente étude illustre la fabrication pratique de microsphères poreuses hautement ouvertes à base de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA-HOPM) par la technologie microfluidique facile pour les applications d’administration cellulaire. Les PLGA-HOPM monodispersés qui en résultaient possédaient des tailles de particules de ~400 μm et des pores ouverts de ~50 μm avec des fenêtres interconnectées. En bref, les gouttelettes d’huile émulsionnées (solution PLGA dans le dichlorométhane, DCM), enveloppées avec la phase aqueuse de gélatine à 7,5% (p / v), ont été introduites dans la solution aqueuse de poly(alcool vinylique) (PVA) à flux continu à 1% (p/v) à travers la buse coaxiale dans la configuration microfluidique personnalisée. Par la suite, les microsphères ont été soumises à des procédures d’extraction par solvant et de lyophilisation, ce qui a entraîné la production de HOPM. Notamment, diverses formulations (concentrations de PLGA et de porogène) et paramètres de traitement (pouvoir émulsifiant, jauge d’aiguille et débit de phase dispersée) jouent un rôle crucial dans les qualités et les caractéristiques des HOPM PLGA résultants. De plus, ces architectures pourraient potentiellement encapsuler divers autres indices biochimiques, tels que les facteurs de croissance, pour des applications étendues de découverte de médicaments et de régénération tissulaire.

Introduction

Les microsphères chargées de cellules offrent des avantages favorables, tels qu’une capacité de rétention cellulaire accrue in situ, une livraison efficace des cellules et une capacité ultérieure de prolifération cellulaire in vivo¹. À ce jour, de nombreuses recherches ont été avancées pour développer une structure d’échafaudage efficace afin de soutenir un environnement propice aux cellules pour la régénération tissulaire ou les applications de criblage^{de médicaments 2}. Cependant, l’environnement hypoxique est souvent inévitable à l’intérieur en raison d’un apport insuffisant de nutriments / oxygène et d’une accumulation de déchets métaboliques³. Pour pallier ces problèmes, des microsphères (PM) hautement poreuses ont été développées à partir de divers biomatériaux ^4,5,6. De plus, dans la culture dynamique, les échafaudages souffrent d’une contrainte de cisaillement excessive⁷, et l’état instable du milieu de culture peut briser la fidélité des particules. Alternativement, l’acide poly(lactique-co-glycolique) (PLGA) pourrait être utilisé pour traiter les particules ayant une bonne résistance mécanique pour la culture dynamique¹. Par exemple, nous avons démontré la co-injection de myoblastes de souris (C2C12) chargés de particules hautement ouvertes (HOPM) PLGA et de microtiges creuses en poly(éthylène glycol) chargées de cellules endothéliales ombilicales humaines (HUVEC) pour guérir la perte musculaire volumétrique, obtenant une amélioration remarquable de la régénération des muscles squelettiques in situ ⁸.

Notamment, les particules sont caractérisées par de grandes surfaces et des porosités élevées, ce qui présente un intérêt particulier pour l’adhésion cellulaire et la croissance vers une livraison cellulaire mini-invasive⁹. Compte tenu de ces aspects, divers matériaux biocompatibles ont été utilisés pour fabriquer les particules^10,11. Ces particules concevables cocultivées avec des cellules offrent une excellente adhérence, une résistance mécanique considérable et des fenêtres hautement interconnectées, ce qui pourrait améliorer la prolifération cellulaire pour réparer les tissus endommagés¹². À cet égard, diverses technologies ont également été développées pour fabriquer des sphères poreuses^13,14. D’une part, les particules ont été produites à l’aide d’agents formant des gaz, tels que NH₄HCO₃, qui ont été limités en raison d’une interconnectivité insuffisante^15,16,17. D’autre part, les particules ont été directement cisaillées après émulsification, ce qui a conduit à des particules polydispersées¹⁸. En fin de compte, la technologie microfluidique des gouttelettes basée sur l’approche de l’émulsion-templation est peut-être une méthode efficace pour construire des particules, car elle aboutit souvent à des particules de taille uniforme¹⁹. Notamment, les attributs morphologiques des microsphères dépendent souvent de la qualité des gouttelettes d’émulsion générées (c.-à-d. eau dans l’huile, E/S, ou huile dans eau, H/E), ce qui peut affecter de manière significative les attributs des biomatériaux²⁰. Il convient de noter que la plate-forme microfluidique préconçue peut être appliquée pour générer les microfibres ou les microsphères. Dans un cas, Yu et al. ont démontré la production de structures microfibreuses chargées de cellules basées sur des plateformes microfluidiques capillaires, qui pourraient être utilisées pour assembler des réseaux cellulaires pour imiter les tissus naturels²¹. Dans un autre cas, Ye et al. ont fabriqué des microcapsules de cristaux photoniques par la reproduction matricielle de billes de cristal colloïdal de silice grâce à des technologies microfluidiques, ce qui pourrait surmonter de nombreuses limites des techniques actuelles qui nécessitent un étiquetage complexe et des appareils spécifiques²².

En effet, la raison d’être de l’utilisation de cette technique est due à divers avantages, tels que la facilité de nature, l’absence d’équipement sophistiqué et sa commodité dans la synthèse de particules de taille uniforme pour l’administration cellulaire et les applications de médecine régénérative. Dans ce contexte, avec des composants préconçus de modèle d’émulsion, les particules à haute porosité et interconnectivité peuvent être facilement obtenues à partir d’un dispositif microfluidique assemblé à partir de tubes en poly(chlorure de vinyle) (PVC), d’un capillaire en verre et d’une aiguille. Un précurseur d’émulsion W/O est préparé en homogénéisant une solution aqueuse de gélatine et une solution organique de PLGA. En injectant sélectivement la partie applicable de l’émulsion dans la plate-forme microfluidique, les particules avec des tailles de particules uniformes et des pores interconnectés de toute la surface vers l’intérieur sont fabriquées. Le présent protocole vise à fabriquer les PLGA-HOPM par émulsion-templation dans la plate-forme microfluidique. On pense que ce protocole permet la production reproductible de PLGA-HOPM et sera potentiellement applicable dans leurs domaines connexes de l’ingénierie tissulaire et du criblage de médicaments.

Protocole

1. Préparation des solutions

1. Préparer la solution mère de PVA à l’avance en chauffant la solution de PVA dans un bain-marie à 80 °C et en la plaçant ensuite au réfrigérateur à 4 °C. Refroidir à température ambiante (RT) pour une utilisation expérimentale.
2. Préparer le précurseur de l’émulsion en ajoutant la solution aqueuse de gélatine (1 mL, 7,5 %, p/v) à la phase organique de PLGA (2 mL, 2 %, p/v dans le dichlorométhane, DCM) (voir le tableau des matières).
   NOTE: Généralement, la technologie microfluidique implique différentes phases pour former les microsphères. La phase continue ou collectrice comprend un poly(alcool vinylique) aqueux (PVA, 600 mL, 1%, p/v).

2. Assemblage de dispositifs microfluidiques par gouttelettes et fabrication de PLGA-HOPM

REMARQUE : Les consommables requis pour cet assemblage sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Personnalisez l’assemblage du générateur de gouttelettes.
   1. Construire un générateur microfluidique à coflux à l’aide d’un capillaire en verre (OD, 1 mm), de tubes en PVC (ID, 1 mm) et d’une aiguille de distribution de 26 G.
   2. Connectez le capillaire en verre à l’extrémité du tube en PVC, puis percez avec une aiguille à la connexion de la structure ci-dessus.
   3. Placez l’autre extrémité du tube en PVC dans la phase continue pendant la génération de gouttelettes. À l’aide de colle UV, scellez les espaces au niveau du joint après le durcissement.
      REMARQUE: L’aiguille doit être pliée incurvée d’environ 45 ° pour un perçage pratique au niveau du tube en PVC, et la pointe de l’aiguille doit être étirée dans le tube capillaire pour former la structure coaxiale.
2. Préparer la plate-forme microfluidique de gouttelettes.
   1. Utilisez deux pompes à seringue, comme illustré à la figure 1. Utilisez une seringue de 50 mL pour charger la phase continue et une seringue de 5 mL pour la formation d’émulsion.
   2. Régler les débits des phases continue et de dispersion à 2 mL/min et 0,08 mL/min, respectivement.
   3. Placez un bécher de 500 ml dans un bain de glace et remplissez-le d’une solution aqueuse de PVA prérefroidie (étape 1.1).
      REMARQUE: L’extrémité du capillaire en verre doit être immergée dans la phase de collecte. Il est suggéré d’agiter (1 h, 60 tr/min) le surnageant de la phase de collecte avec la tige de verre après formation de gouttelettes-émulsions dans la plate-forme. Les gouttelettes d’émulsion sont produites à l’extrémité de la pointe de l’aiguille. En général, la jauge de l’aiguille influence la taille des MP, dans laquelle la moindre jauge correspond à la plus petite taille des MP. De plus, le diamètre des pores est principalement corrélé à la concentration en porogène, capable d’augmenter avec une concentration appropriée^en gélatine 1.
3. Effectuer l’émulsification et la génération de gouttelettes.
   1. Préparez l’émulsion en suivant les étapes ci-dessous.
      1. Préparer l’émulsion en décantant immédiatement la solution aqueuse de gélatine dans la solution DCM de PLGA (étape 1.2) et en émulsionnant à l’aide du dispositif à ultrasons (voir Tableau des matériaux).
      2. Ajustez la puissance ultrasonore à 400 W et réglez le temps de traitement total sur 90 s (intervalle 2 s, traitement par ultrasons 1 s), tout en changeant constamment la position de la sonde manuellement.
      3. Stabiliser l’émulsion résultante pour l’aspiration de la seringue et la génération de gouttelettes en 20 minutes environ.
         REMARQUE: Placez la sonde du disjoncteur de cellules à ultrasons dans l’interface huile-eau. Il est suggéré de ne pas laisser la sonde à ultrasons entrer en contact avec le conteneur.
   2. Effectuez la génération de gouttelettes.
      1. Charger rapidement l’émulsion préparée (étape 2.3.1) dans la seringue de 5 mL de la plateforme microfluidique après traitement par ultrasons.
      2. Introduire l’émulsion instable W/O (qui est en cours de séparation de phase) dans le dispositif microfluidique en tant que phase discontinue. Dans le même temps, utilisez la solution aqueuse de PVA comme phase continue.
      3. Recueillir les microsphères contenant l’émulsion au fond du bécher collecteur (PVA, 1%, p/v) après avoir injecté des portions appropriées de l’émulsion dans le dispositif microfluidique.
      4. Placer l’échantillon à 4 °C pendant une nuit pour une stabilisation supplémentaire.
   3. Rincer et lyophiliser les microsphères préparées (PLGA-HOPMs) en suivant les étapes ci-dessous.
      REMARQUE: Les PLGA-HOPM générés contiennent des pores arbitraires à l’intérieur et à la surface.
      1. Stocker les microsphères à 4 °C avant de les normaliser en RT et remuer par une tige de verre (1 h, 60 tr/min) pour éliminer le DCM résiduel.
      2. Filtrer soigneusement la phase de collecte dans le bécher de 500 ml et laver les microsphères collectées trois fois avec de l’eau désionisée pour éliminer le PVA résiduel à la surface des particules.
      3. Placer les microsphères PLGA dans le bain-marie à 37 °C pendant 30 min pour dissoudre la gélatine enveloppée dans le squelette PLGA.
      4. Rincer deux fois les PLGA-HOPM obtenus avec de l’eau désionisée pour éliminer la gélatine résiduelle et prérefroidir pour la lyophilisation à -80 °C pendant 24 h.
      5. Conservez les PLGA-HOPM secs à -20 °C pour d’autres expériences.

3. Imagerie au microscope électronique à balayage (MEB)

1. Déposer les PLGA-HOPM sur l’étage d’échantillonnage du MEB (voir le tableau des matériaux) à RT et placer l’étage d’échantillon dans la cellule de pulvérisation du magnétron. Allumez le transformateur et le magnétron un par un. Introduire l’échantillon dans le MEB après avoir été recouvert d’or pendant 1 min.
2. Obtenez les images MEB en réglant la tension d’accélération à 5 kV.
3. De plus, quantifier la taille des particules des PLGA-HOPM en utilisant 100 PM au champ variable de l’imagerie SEM. Mesurer le résultat représentatif pour quantifier la distribution de la taille des pores.
   1. Ouvrez les graphiques avec l’image J et utilisez la « ligne droite » pour faire correspondre la barre d’échelle de l’image SEM, ce qui permet au logiciel d’identifier les pixels à la longueur.
   2. Cliquez sur analyser > définir l’échelle, définissez la « distance connue » sur la barre d’échelle de l’image SEM, puis cliquez sur global > OK.
   3. Cliquez sur analyser > Outils > gestionnaire de retour sur investissement... pour mesurer la taille des pores ou des particules des PM PLGA et cliquez sur ajouter. Mesurez le nombre d’échantillons en fonction de l’exigence.
   4. Cliquez sur Mesure pour obtenir les données quantitatives des graphiques pour un calcul plus approfondi.

4. Culture cellulaire et imagerie par fluorescence

REMARQUE : Des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat (CSMO) ont été utilisées pour le présent travail. Les cellules ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Culture des cellules dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco supplémentée en L-glutamine (DMEM/F-12), 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO₂.
2. Passez les BMSC de rats dans un rapport de 1:2 après avoir atteint 90% de confluence.
3. Effectuez l’adhésion cellulaire en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Incuber les PLGA-HOPM avec de l’alcool éthylique (5 mL, 70%, v/v) et centrifuger à 500 x g pendant 10 min à TA pour stériliser.
   2. Lavez les PLGA-HOPM stérilisés deux fois avec une solution tampon phosphate.
   3. Incuber les HOPM (au nombre de cinq) avec la suspension cellulaire (5 mL, 1 x 10⁵ cellules/mL) dans un tube centrifuge stérile (50 mL) sous culture dynamique pour l’adhésion des BMSC aux PLGA-HOPM.
   4. Effectuer la culture dynamique dans un agitateur aseptique thermostatique (37 °C, 90 tr/min) en plaçant un tube centrifuge scellé de 50 ml dans l’agitateur (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : La culture dynamique vise à améliorer le taux d’adhérence des CSMO sur les échafaudages, plutôt que d’incuber directement les particules et les cellules sur la plaque en plastique. Les cellules et les PM PLGA sont ajoutés dans un tube centrifuge stérile de 50 mL, incubant le tube dans un agitateur aseptique thermostatique (37 °C, 90 tr/min) et changeant le média tous les 2 jours.
4. Effectuez le test de double coloration en direct et mort.
   1. Rincer trois fois les PM chargés de cellules pour éluer les BMSC sans fixation aux PLGA-HOPM.
   2. Placez les particules chargées de cellules sur la plaque de fond de verre de 35 mm. Ajouter 1 mL de tampon de coloration (voir le tableau des matières), y compris 1 μL de calcéine-AM et d’iodure de propidium (PI), respectivement, à l’échantillon prélavé au PBS.
   3. Évaluer les échantillons par microscopie confocale à balayage laser (voir le tableau des matériaux). Allumez la lumière d’excitation de 488 nm et 552 nm au détecteur correspondant. Pour l’analyse par superposition z, réglez le z-wide pour capturer les différentes couches de l’échantillon par mouvement de l’axe z du microscope.
      NOTE: Il convient de noter que les autres taches peuvent être utilisées de manière appropriée pour l’analyse.

Résultats

Sur la base de travaux antérieurs qui ont optimisé les principaux paramètres¹, la PLGA a été dissoute dans le solvant DCM évaporable. L’émulsion primaire E/S a été préparée par homogénéisation avec de la gélatine sous traitement par sonde ultrasonique. La structure fluidique de coflux personnalisée a été assemblée de manière simpliste, dans laquelle une seringue a été utilisée pour introduire les flux en permanence. De plus, des procédures de rinçage suffisantes ont été...

Discussion

Cet article décrit une stratégie efficace pour fabriquer des architectures basées sur PLGA, à savoir les PLGA-HOPM. Il est à noter que plusieurs étapes critiques doivent être prises avec soin, notamment éviter la volatilisation par solvant de la PLGA et ajuster en douceur la puissance ultrasonore à la position cible lors de la préparation de l’émulsion. De plus, la sortie liquide de la seringue de 20 mL peut être ajustée dans une certaine mesure pour résoudre la séparation de phase des précurseurs émul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100