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Résumé

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Résumé

Les intestins des nématodes sauvages Caenorhabditis sont habités par une variété de micro-organismes, y compris les bactéries du microbiome intestinal et les agents pathogènes, tels que les microsporidies et les virus. En raison des similitudes entre Caenorhabditis elegans et les cellules intestinales de mammifères, ainsi que de la puissance du système C. elegans , cet hôte est devenu un système modèle pour étudier les interactions intestin-microbe hôte in vivo. Bien qu’il soit possible d’observer certains aspects de ces interactions avec la microscopie à fond clair, il est difficile de classer avec précision les microbes et de caractériser l’étendue de la colonisation ou de l’infection sans outils plus précis. L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) peut être utilisée comme outil pour identifier et visualiser les microbes chez les nématodes sauvages ou pour caractériser et quantifier expérimentalement l’infection chez les nématodes infectés par des microbes en laboratoire. Les sondes FISH, marquant l’ARN ribosomique de la petite sous-unité très abondante, produisent un signal lumineux pour les bactéries et les cellules microsporidiennes. Les sondes conçues pour cibler les régions conservées d’ARN ribosomique commun à de nombreuses espèces peuvent détecter un large éventail de microbes, tandis que cibler des régions divergentes de l’ARN ribosomique est utile pour une détection plus étroite. De même, les sondes peuvent être conçues pour marquer l’ARN viral. Un protocole de coloration de l’ARN FISH avec fixation de paraformaldéhyde (PFA) ou d’acétone est présenté. La fixation de PFA est idéale pour les nématodes associés aux bactéries, aux microsporidies et aux virus, tandis que la fixation de l’acétone est nécessaire pour la visualisation des spores de microsporida. Les animaux ont d’abord été lavés et fixés dans du paraformaldéhyde ou de l’acétone. Après fixation, les sondes FISH ont été incubées avec des échantillons pour permettre l’hybridation des sondes à la cible souhaitée. Les animaux ont de nouveau été lavés puis examinés sur des lames de microscope ou à l’aide d’approches automatisées. Dans l’ensemble, ce protocole FISH permet la détection, l’identification et la quantification des microbes qui habitent l’intestin de C. elegans , y compris les microbes pour lesquels il n’existe aucun outil génétique.

Introduction

Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système modèle pour étudier l’immunité innée et les interactions hôte-microbe dans les cellules épithéliales intestinales 1,2. En raison d’un corps transparent et de seulement 20 cellules intestinales, C. elegans représente un système pratique pour surveiller les processus de colonisation et d’infection intestinale microbienne dans le contexte d’un organisme intact. Les cellules intestinales des nématodes partagent de multiples similitudes morphologiques et fonctionnelles avec les cellules épithéliales intestinales des mammifères, ce qui en fait un modèle in vivo traitable pour la dissection des processus qui régissent la colonisation du microbiome et l’infection pathogène 3,4,5,6.

Les C. elegans sauvages se nourrissent d’une variété de microbes qui colonisent et infectent l’intestin, et l’échantillonnage de ces nématodes a permis de découvrir des virus, des eucaryotes (champignons, oomycètes) et des bactéries qui s’associent naturellement à cet hôte 7,8,9,10. Le virus d’Orsay a été trouvé infectant l’intestin et est actuellement le seul virus naturel connu de C. elegans9. Les microsporidies sont des agents pathogènes intracellulaires obligatoires liés aux champignons qui sont l’infection la plus fréquente chez les Caenorhabditis, plusieurs espèces ayant été découvertes infectant C. elegans et les nématodes apparentés 8,11. De nombreuses bactéries habitent couramment la lumière intestinale de C. elegans capturé dans la nature et plusieurs espèces ont été établies comme modèle naturel pour le microbiome de C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. La découverte et la caractérisation des microbes qui colonisent et/ou infectent naturellement C. elegans sont essentielles pour comprendre les mécanismes génétiques qui régissent ces interactions hôte-microbe, ainsi que pour visualiser de nouveaux processus microbiens qui ne se produisent que dans le contexte d’un animal hôte intact.

Après l’échantillonnage, les nématodes sauvages sont examinés par microscopie à contraste interférentiel différentiel (CIVD) pour rechercher des phénotypes indiquant une infection ou une colonisation. Par exemple, des modifications de l’aspect granulé stéréotypé des cellules intestinales peuvent être associées à la présence d’une infection parasitaire intracellulaire8. Plus précisément, la perte des granules intestinaux et la diminution de la viscosité cytosolique sont des signes d’infection virale, tandis que la réorganisation des granules intestinaux en « rainures » peut indiquer une infection par des microsporidies dans le genre Nematocida 8,9. Étant donné qu’il existe une grande variété de microbes présents dans les échantillons sauvages de C. elegans, il peut être difficile de distinguer les microbes par microscopie DIC. L’information concernant la distribution spatiale des microbes au sein de l’hôte peut également être difficile à détecter en raison de la petite taille de nombreux microbes15. De plus, la culture in vitro de microbes particuliers d’intérêt n’est pas toujours possible, ce qui entraîne des difficultés de détection et/ou de quantification.

L’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) fournit une méthode pour marquer des microbes par fluorescence en utilisant des sondes fluorescentes qui se lient à l’ARN de la petite sous-unité ribosomique (SSU) dans les cellules fixes. Si l’analyse des caractéristiques morphologiques suggère une classe particulière de microbes, des sondes FISH qui ciblent des classes spécifiques ou larges de ces microbes peuvent être utilisées. Par exemple, EUB338 est considéré comme une sonde universelle pour la SSU bactérienne et est couramment utilisée pour détecter un large éventail de bactéries16. Le protocole décrit ici utilise des sondes d’ADN simple brin qui sont marquées à l’extrémité avec un fluorophore et spécifiquement conçues pour être complémentaires à la SSU cible du microbe d’intérêt, bien qu’il existe des sondes précédemment conçues disponibles16. Le principal avantage du ciblage de la SSU des microbes est l’abondance relativement importante de cet ARN, qui comprend généralement 80% à 90% de tout l’ARN dans la cellule, conduisant à une coloration avec un rapport signal sur bruit très élevé17. Les sondes peuvent également être conçues pour cibler l’ARN afin de détecter les virus, comme le virus d’Orsay 9,18, qui sont souvent présents en très gros exemplaires dans les cellules infectées si le virus se réplique activement.

Selon les résultats obtenus avec des sondes connues, il peut être nécessaire d’obtenir d’autres informations de séquence pour concevoir des sondes plus spécifiques pour la confirmation des espèces in situ. Une approche courante consiste à utiliser des amorces universelles contre les régions conservées de l’USS (16S pour les bactéries et 18S pour les eucaryotes) pour amplifier (via PCR) les régions plus divergentes8. En utilisant ces informations de séquence, des sondes avec plus de spécificité d’espèce peuvent être conçues. Ces sondes FISH peuvent ensuite permettre l’identification des microbes de manière indépendante de la culture8. De plus, ARN FISH peut donner un aperçu des caractéristiques morphologiques uniques de colonisation et d’infection, y compris les modèles de filamentation ou de localisation tissulaire19,20. Des sondes FISH de différentes couleurs peuvent être utilisées simultanément, ce qui permet une distinction visuelle entre les microbes dans des échantillons de nématodes sauvages, ainsi que l’observation de la dynamique microbe-microbe à l’intérieur d’un hôte15,20. En outre, la coloration ARN FISH peut être appliquée aux études d’interaction hôte-pathogène où l’infection et la colonisation d’une espèce connue peuvent être facilement quantifiées manuellement ou par des approches automatisées pour fournir des informations sur la charge pathogène, par exemple, en comparant les mutants de C. elegans qui ont augmenté ou diminué la résistance à l’infection21.

Protocole

REMARQUE : Les nématodes peuvent être fixés avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) ou de l’acétone. Le PFA permet une meilleure visualisation de la morphologie que l’acétone et peut préserver les signaux de la protéine fluorescente verte transgénique (GFP), qui est détruite par l’acétone. Cependant, la fixation de l’acétone est nécessaire pour perméabiliser les spores microsporidiennes afin de permettre le marquage de ce stade de vie. De plus, l’acétone peut être plus pratique que le PFA car elle est moins toxique et les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs jours dans de l’acétone dans un congélateur à -20 °C sans qu’il soit nécessaire de retirer le fixateur. Vous trouverez ci-dessous deux protocoles distincts, utilisant une solution de PFA ou de l’acétone comme fixateur. Pour une visualisation des étapes du protocole, reportez-vous à la figure 1.

1. Coloration FISH avec fixation PFA

  1. Préparer les nématodes avec les microbes associés
    1. Cultiver des nématodes contenant le microbe d’intérêt désiré sur des plaques standard de milieux de croissance de nématodes (NGM) ensemencées avec la source de nourriture appropriée. Incuber les nématodes à 20 °C jusqu’à ce que le stade de vie désiré soit atteint.
    2. Ajouter 2 mL de milieu de sels minim9 M9 (42 mMNa2 HPO 4, 22 mM KH2PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4 Cl) + 0,1% Tween20 aux plaques NGM contenant la souche Caenorhabditis infectée ou colonisée par le microbe désiré à visualiser.
      REMARQUE : L’ajout de détergent vise à empêcher les nématodes de coller aux pipettes et aux tubes à microfuge et à aider les nématodes des stades L1-L2 à granuler. 0,1% Triton-X peut être utilisé à la place de Tween 20.
    3. Pipeter les nématodes des plaques à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et d’une ampoule, et les transférer dans des tubes à microfuge marqués de 1,5 mL.
      REMARQUE: Les pipettes en verre sont préférées parce que les nématodes peuvent coller aux pipettes en plastique, mais l’ajout de détergent (Tween 20 ou Triton-X) peut minimiser ce problème.
    4. À l’aide d’une microcentrifugeuse, faire tourner les échantillons contenant les nématodes colonisés ou infectés à 2 000 x g pendant 60 s pour les animaux L1, ou à 500 x g pendant 60 s pour les animaux L4 ou adultes. Toutes les étapes de centrifugation suivantes seront effectuées à la vitesse sélectionnée.
    5. Retirer le surnageant des tubes de microfuge à l’aide d’une pipette. Évitez de déranger la pastille de nématode en retirant soigneusement le surnageant jusqu’à 100 μL au-dessus du granulé. Cela peut être estimé à l’aide de tubes à microfuge marqués de 1,5 mL.
  2. Laver les nématodes pour éliminer la contamination externe
    1. Ajouter 1 mL de 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8mM KH2PO4) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) aux tubes de microfuge.
    2. Faire tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). À l’aide d’une pipette, retirer tout le surnageant, sauf 100 μL. Cela peut être estimé à l’aide de tubes à microfuge marqués de 1,5 mL.
    3. Répétez les deux étapes ci-dessus 2-3x.
      REMARQUE: Trois lavages au total sont généralement suffisants; Cependant, des lavages supplémentaires peuvent être effectués pour éliminer tout excès de contamination externe.
  3. Fixer les nématodes avec PFA
    1. Dans la hotte, ajouter 33 μL de PFA à 16 % dans le tube de microfugeuse contenant 100 μL de surnageant au-dessus de la pastille de nématode obtenue à l’étape 1.2.3 pour une concentration finale de 4 % de PFA.
      ATTENTION : Le PFA est cancérigène. Le contact avec le PFA peut entraîner une sensibilisation et une irritation de la peau et des lésions oculaires. Le PFA dégage des vapeurs toxiques qui peuvent entraîner une irritation ou une sensibilisation respiratoire. Lorsque vous utilisez le PFA, travaillez dans une hotte avec un équipement de protection individuelle approprié et reportez-vous aux fiches de données de sécurité appropriées avant utilisation.
    2. Incuber les échantillons contenant les nématodes colonisés ou infectés par le microbe d’intérêt pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Après l’incubation, conserver les échantillons dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C jusqu’à ce que le protocole soit prêt à être poursuivi.
      REMARQUE : Une période d’incubation plus courte est préférable pour maintenir le signal GFP dans les souches transgéniques en raison de la dégradation de la GFP par le PFA au fil du temps. Des temps d’incubation plus longs permettent au fixateur de mieux perméabiliser dans les échantillons. Il est préférable de déterminer le temps d’incubation empiriquement en fonction de l’échantillon.
  4. Retirez la solution de PFA
    1. Faire tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). À l’aide d’une pipette, retirer autant de surnageant que possible sans déranger la pastille.
      ATTENTION : Le surnageant contient du PFA, qui est toxique. Jetez le surnageant et au moins les deux premiers lavages comme déchets toxiques dans une hotte.
    2. Ajouter 0,5 mL de PBS-T aux échantillons dans les tubes à microfuge.
    3. Suivez et répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2 2-3x avec PBS-T.
      REMARQUE: Effectuer plus de lavages aidera à réduire le signal de fond. Au moins quatre lavages au total sont recommandés.
    4. Après le dernier lavage, faites tourner les échantillons vers le bas et retirez le surnageant, en laissant la pastille intacte.
  5. Préparer un tampon d’hybridation (HB) et laver les nématodes
    1. Préparer 1 mL de HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) par échantillon.
      REMARQUE : L’HB doit être préparé frais avant chaque utilisation pour éviter les précipitations. Cependant, un tampon général (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) peut être fabriqué à l’avance et stocké à température ambiante jusqu’à ce que HB soit nécessaire. Avant utilisation, préparer 1 mL par échantillon du tampon général et ajouter la FDS jusqu’à une concentration finale de 0,01 %.
    2. Ajouter 800 μL de HB aux tubes de microfuge contenant la pastille de nématode. Enduire les échantillons dans la microcentrifugeuse (voir étape 1.1.4). Retirer le surnageant sans déranger la pastille.
  6. Hybrider la sonde FISH à la séquence cible souhaitée
    1. Mélanger 100 μL par échantillon de HB préparé avec la sonde FISH désirée jusqu’à une concentration finale de 5-10 ng/μL de sonde.
      REMARQUE: Les sondes FISH sont des oligos 15-23-mer, antisens au SSU du microbe d’intérêt, et marquées avec un fluorophore coloré attaché à l’extrémité 5' ou 3' (voir le tableau 1 pour les sondes utilisées ici). En général, les sondes FISH de stock sont stockées à 1 mg/mL.
    2. Ajouter 100 μL de sonde HB contenant du FISH à chaque échantillon. Mélanger en effleurant ou en retournant doucement les tubes.
      REMARQUE : Des sondes FISH de différentes couleurs peuvent être ajoutées simultanément pour visualiser plusieurs signaux fluorescents dans le même échantillon (voir la figure 1B).
    3. Incuber les échantillons pendant une nuit (6-24 h) dans un bain sec à 46-54 °C ou un mélangeur thermique à 46-54 °C à 1 200 rpm.
      NOTE: L’incubation à 46-48 °C est généralement utilisée pour l’hybridation. Cependant, cette température peut devoir être ajustée en fonction de la température de fusion de la sonde FISH. En général, la température d’hybridation est inférieure de 4 °C à la température de fusion.
  7. Retirez la sonde FISH et lavez les nématodes
    1. Préparer 3 mL de tampon de lavage (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) par échantillon.
      NOTE: WB doit être préparé frais avant chaque utilisation pour éviter les précipitations. Cependant, un tampon général (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) peut être fabriqué à l’avance et stocké à température ambiante jusqu’à ce que le tampon de lavage soit nécessaire. Avant utilisation, préparer 3 mL par échantillon du tampon général et ajouter de l’EDTA à une concentration finale de 5 mM et une FDS à une concentration finale de 0,01 %.
    2. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). Retirer le HB à l’aide d’une pipette, tout en prenant soin de ne pas être dérangé par la pastille de nématode.
    3. Ajouter 1 mL de WB préparé à chaque échantillon.
    4. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). Retirez la WB à l’aide d’une pipette, tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    5. Ajouter 1 mL de WB préparé à chaque échantillon.
    6. Incuber les échantillons pendant 1 h à 48-56 °C dans un bain sec (ou un mélangeur thermique à 48-56 °C à 1200 rpm). En cas d’incubation dans un bain sec, retourner doucement les tubes toutes les 15-20 minutes.
      NOTE: En général, 48 ° C est utilisé comme température de lavage standard; Cependant, cette température peut devoir être ajustée s’il y a un signal de fond élevé. La température de lavage est souvent supérieure de 2 °C à la température d’hybridation. Le temps d’incubation dans WB peut être réduit à 30 minutes pour réduire davantage le bruit de fond, après quoi les étapes 1.7.4 et 1.7.5 doivent être répétées. Suivront une (pour les bactéries) ou deux (pour les sporoplasmes de microsporidies) des périodes d’incubation de 30 min à 48 °C.
    7. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). À l’aide d’une pipette, retirez le tampon de lavage tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    8. Ajouter 100 à 500 μL de PBS-T à chacun des échantillons. À ce stade, les échantillons peuvent être stockés dans PBS-T à 4 °C jusqu’à une semaine jusqu’à ce que le protocole soit prêt à être poursuivi.
  8. Montez les nématodes
    1. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). Retirez autant de PBS-T que possible sans déranger la pastille de nématode.
    2. (Facultatif) Ajouter 20 μL de support de montage antidécoloration avec DAPI (Table of Materials) aux échantillons.
    3. Chargez une pipette de 20 μL avec une pointe de pipette de 200 μL et utilisez des ciseaux pour couper l’extrémité de la pipette afin de permettre aux plus gros nématodes d’être pipetés.
    4. Avec l’embout de la pipette coupée, transférer 5-10 μL de la pastille sur une lame de microscope. Couvrir avec un bordereau de couverture 22 x 22. Pour ranger les lames, scellez les bords de la lamelle de couverture avec du vernis à ongles et conservez-les dans une boîte sombre à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées ultérieurement.

2. Coloration FISH avec fixation à l’acétone

  1. Préparer les nématodes avec les microbes associés comme décrit à l’étape 1.1.
  2. Lavez les nématodes pour éliminer la contamination externe comme décrit à l’étape 1.2.
  3. Fixer les nématodes avec de l’acétone
    1. Retirer le surnageant sans déranger la pastille et ajouter 1 mL d’acétone de qualité laboratoire à l’échantillon.
      ATTENTION : L’acétone est un liquide et une vapeur hautement inflammables. Bien qu’il puisse être acheté en vente libre comme dissolvant de vernis à ongles, il est important de se rappeler que l’acétone provoque une irritation oculaire grave et peut causer de la somnolence ou des étourdissements.
    2. Incuber les échantillons contenant des nématodes colonisés ou infectés par le microbe d’intérêt pendant 15 min à température ambiante. Après l’incubation, les échantillons peuvent être conservés dans de l’acétone à -20 °C jusqu’à 2 semaines jusqu’à ce que le protocole soit prêt à être poursuivi.
      NOTE: Ne pas utiliser ce protocole avec des souches transgéniques de C. elegans exprimant la GFP (ou ses formes alléliques mutées) si l’on souhaite maintenir la fluorescence, car l’acétone détruit ce signal.
  4. Enlever l’acétone
    1. Faire tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). À l’aide d’une pipette, retirer le surnageant sans déranger la pastille.
      ATTENTION : Le surnageant contient de l’acétone. Jetez le surnageant et au moins les deux premiers lavages comme déchets toxiques dans une hotte.
    2. Ajouter 0,5 mL de PBS-T aux échantillons dans les tubes à microfuge.
    3. Suivez et répétez les étapes 2.4.1 et 2.4.2 2-4x avec PBS-T.
      REMARQUE: Effectuer plus de lavages aidera à réduire le signal de fond. Il est recommandé d’effectuer quatre lavages au total.
    4. Après le dernier lavage, faites tourner les échantillons vers le bas et retirez le surnageant, en veillant à ce que la pastille ne soit pas perturbée.
  5. Préparer un tampon d’hybridation (HB) et laver les nématodes comme décrit à l’étape 1.5.
  6. Hybrider la sonde FISH à la séquence cible souhaitée comme décrit à l’étape 1.6.
  7. Retirez la sonde FISH et lavez les nématodes
    1. Préparer 1,1 mL de tampon de lavage (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) par échantillon.
      NOTE: WB doit être préparé frais avant chaque utilisation pour éviter les précipitations. Cependant, un tampon général (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) peut être fabriqué à l’avance et stocké à température ambiante jusqu’à ce qu’un tampon de lavage soit nécessaire. Avant utilisation, préparer 1,1 mL par échantillon du tampon général et ajouter de l’EDTA à une concentration finale de 5 mM et une FDS à une concentration finale de 0,01 %.
    2. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir 1.1.4). Retirer le HB à l’aide d’une pipette, tout en prenant soin de ne pas être dérangé par la pastille de nématode.
    3. Ajouter 100 μL de WB préparé à chaque échantillon.
    4. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir 1.1.4). Retirez la WB à l’aide d’une pipette, tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    5. Ajouter 1 mL de WB préparé à chaque échantillon.
    6. Incuber les échantillons pendant 1 h à 48-56 °C dans un bain sec (ou un mélangeur thermique à 48-56 °C à 1 200 tr/min). En cas d’incubation dans un bain sec, retourner doucement les tubes toutes les 15-20 minutes.
      NOTE: En général, 48 ° C est utilisé comme température de lavage standard; Cependant, cette température peut devoir être ajustée s’il y a un signal de fond élevé. La température de lavage est souvent supérieure de 2 °C à la température d’hybridation.
    7. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée (voir étape 1.1.4). À l’aide d’une pipette, retirez le tampon de lavage tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    8. Ajouter 100 à 500 μL de PBS-T à chacun des échantillons. À ce stade, les échantillons peuvent être stockés dans PBS-T à 4 °C jusqu’à une semaine jusqu’à ce que le protocole soit prêt à être poursuivi.
  8. Montez les nématodes comme décrit à l’étape 1.8.

Résultats

Pour analyser les bactéries du microbiome, des sondes FISH spécifiques et universelles à la bactérie 16S ont été utilisées sur des animaux isolés dans la nature. La souche sauvage Caenorhabditis tropicalis (JU1848) a été échantillonnée dans la forêt des Nouragues près d’une petite rivière de la Guyane Français à partir de fruits de palmiers en décomposition22. Au microscope à contraste interférentiel différentiel (CIVD), on a découvert que cette souche de nématode était colonisée par une bactérie qui semble adhérer de façon directionnelle à l’épithélium intestinal (figure 2A). JU1848 a ensuite été nettoyé sélectivement pour éliminer d’autres contaminants microbiens et enrichir la bactérieadhérente 23 souhaitée. En utilisant la méthode de PCR universelle, la bactérie a été identifiée comme une nouvelle espèce dans la classe des alphaprotéobactéries. Une sonde FISH marquée avec Cal Fluor Red 610 a ensuite été conçue spécifiquement pour la séquence d’ARNr 16S de cette bactérie afin de permettre une visualisation fluorescente de la colonisation au sein de C. tropicalis (Figure 2B). Une sonde universelle 16S ARNr FISH capable de lier de nombreuses espèces de bactéries (EUB338) a été marquée avec de la 6-carboxyfluorescine (FAM) et a également été ajoutée à cet échantillon. Les signaux fluorescents verts et rouges se chevauchent complètement, ce qui suggère que la plupart des bactéries colonisant les intestins sont la bactérie Alphaproteobacteria adhérente. Ces animaux ont été fixés dans du PFA avant coloration.

Pour analyser l’infection expérimentale en laboratoire avec des agents pathogènes intracellulaires d’identité connue, le virus d’Orsay et les sondes FISH spécifiques aux microsporidiens ont été utilisés sur C. elegans avec un fond de type sauvage. Le virus d’Orsay est un virus à ARN à brin positif de la famille des Nodaviridae, et le seul pathogène viral naturel trouvé chez C. elegans. Le génome bipartite de l’ARN du virus d’Orsay est constitué de segments ARN1 et ARN2, et des sondes FISH ciblant ces deux segments ont été développées (Figure 3A,B)9,18. Dans l’intestin, l’ARN viral est détecté par l’homologue RIG-I DRH-124, qui est nécessaire à l’activation du programme de défense transcriptionnelle appelé Intracellular Pathogen Response (IPR)25,26,27. La transcription des gènes antiviraux IPR est au moins partiellement contrôlée par le facteur de transcription ZIP-121. Ici, l’expression de ZIP-1::GFP est localisée dans les noyaux intestinaux des cellules qui montrent une coloration FISH positive du virus d’Orsay dans le cytoplasme (Figure 3A)21. Plusieurs animaux colorés avec des FISH spécifiques à Orsay indiquent la force de ce signal pour faciliter la quantification (Figure 3B). Les animaux représentés à la figure 3A,B étaient fixés dans la PFA.

Le parasite microsporidien nommé Nematocida parisii, qui signifie tueur de nématodes de Paris, est un agent pathogène intracellulaire obligatoire de l’intestin. Plusieurs sondes FISH qui marquent l’ARNr 18S de N. parisii ont été utilisées, y compris des sondes MicroA et MicroB marquées par fluorescence. Plusieurs animaux colorés avec MicroB FISH indiquent la force de ce signal pour faciliter la quantification (Figure 3C). De plus, C. elegans est infecté par d’autres microsporidies étroitement apparentées. La co-infection de N2 avec N. parisii et le N. ausubeli apparenté peut être distinguée à l’aide de ce protocole FISH en concevant des sondes FISH spécifiques à l’espèce qui se font concurrence pour se lier à une région divergente sur l’ARNr 18S (Figure 3D)28. Dans cet exemple, la sonde FISH de N. parisii a un appariement de base parfait avec l’ARNr 18S de N. parisii, mais une incompatibilité de 7 pb avec l’ARNr N. ausubeli 18S. L’inverse est vrai pour la sonde N. ausubeli. En tant que tel, chaque sonde FISH spécifique à l’espèce sera en concurrence pour la liaison à l’espèce apparentée 18S par rapport à l’espèce non apparentée. De plus, l’utilisation de DAPI pour colorer les noyaux permet une meilleure localisation de l’infection dans le contexte de l’animal entier, en particulier pour l’intestin qui a de gros noyaux facilement identifiables. La figure 3C,D contient les animaux qui ont été fixés dans la PFA. Des infections ultérieures à N. parisii entraînent le développement de mérons en spores. Pour visualiser les spores de N. parisii, les animaux doivent être fixés dans l’acétone car elle pénètre mieux dans la paroi des spores que le PFA (figure 3E,F)8. La coloration FISH qui en résulte démontre les petites et grandes structures en forme de bâtonnet, qui correspondent probablement aux spores de N. parisii, qui sont colorées avec des sondes spécifiques à N. parisii en rouge.

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Figure 1 : Représentation visuelle du protocole FISH. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Coloration FISH de la souche sauvage C. tropicalis JU1848 colonisée par des bactéries adhérentes dans les intestins. (A) Image de Nomarski représentant des milliers de bactéries bacilles minces (bac) se liant directionnellement à l’intestin (in) de JU1848, créant un phénotype ressemblant à un cheveu dans la lumière (lu). Ce panneau de figures est adapté de Morgan, E. et al. (2021)23. (B) Coloration FISH de JU1848, fixée dans PFA, à l’aide d’une sonde marquée rouge (b002_16S_A-CF610) conçue pour cibler la séquence d’ARNr 16S de la bactérie adhérente (en haut) et d’une sonde FISH universelle marquée en vert (EUB338-FAM) conçue pour cibler les bactéries 16S (en bas). La coloration DAPI des noyaux hôtes est représentée en bleu. Voir le tableau 1 pour les séquences de sondes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Coloration FISH de C. elegans infecté par des agents pathogènes intracellulaires. (A,B) Coloration FISH de C. elegans exprimant ZIP-1::GFP et infecté par le virus d’Orsay, qui ont été corrigés avec PFA avant coloration pour préserver le signal GFP. Les sondes Orsay 1 Red et Orsay 2 Red ont été utilisées pour la coloration des agents pathogènes. (A) L’image composite est constituée de canaux fluorescents rouges et verts fusionnés. L’expression nucléaire ZIP-1::GFP est induite lors de l’infection par le virus d’Orsay et est indiquée en vert. L’autofluorescence des granules intestinaux est représentée en jaune et indiquée par des flèches jaunes. Des lignes pointillées délimitent le corps du nématode. Barre d’échelle = 25 μm. (B) L’image composite se compose de canaux fluorescents rouges fusionnés et DIC. Barre d’échelle = 200 μm. (C,D) Coloration FISH de C. elegans de type sauvage infecté par des microsporidies fixées dans la PFA. (C) Coloration FISH de C. elegans de type sauvage infecté par N. parisii et fixé dans PFA. La sonde MicroB-CF610 a été utilisée pour la coloration des agents pathogènes. L’image composite se compose de canaux fluorescents rouges et DIC fusionnés. Barre d’échelle = 100 μm. (D) Coloration FISH de C. elegans de type sauvage co-infecté par N. parisii et N. ausubeli dans l’intestin. Les deux agents pathogènes ont été co-colorés à l’aide d’une paire de sondes FISH spécifiques qui rivalisent pour se lier à la même région de l’ARNr 18S. N. parisii a été coloré à l’aide de MicroF-CF610 (rouge) et N. ausubeli a été coloré à l’aide de MicroSp1A-FAM (vert). La coloration DAPI des noyaux de l’hôte est visible en bleu. Barre d’échelle = 25 μm. (E) Coloration FISH avec de l’acétone de type sauvage de type C. elegans infecté par des spores de N. parisii. MicroA-CF610 (rouge) a été utilisé pour la coloration (rouge). Barre d’échelle = 15 μm. (F) Image de Nomarski représentant des spores de N. parisii vues en (E). Barre d’échelle = 15 μm. En (E) et (F), les petites et grandes structures en forme de tige sont marquées avec de petites et de grandes flèches, respectivement, qui correspondent aux spores de N. parisii. Voir le tableau 1 pour les séquences de sondes. L’image montrée en (A) est adaptée de Lažetić, V. et al. (2022)21. Les images présentées aux points (B) et (C) sont adaptées de Reddy, K. C. et al. (2019)26. Les images présentées aux points (E) et (F) sont adaptées de Troemel, E. R. et al. (2008)8. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de la sondeSpécificité de la sondeSonde fluorophoreSéquence de sonde
EUB338-FAMBactérie 16S (universelle)5' 6-fluorescéine (FAM)GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610Alphaprotéobactéries 16SCal Fluor Rouge 610 (CF610)TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 RougeARN1 du virus d’OrsayCal Fluor Rouge 610 (CF610)GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 RougeARN2 du virus d’OrsayCal Fluor Rouge 610 (CF610)GTAGTGTCATTGTAGGCAGGCAGC
MicroA-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rouge 610 (CF610)CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rouge 610 (CF610)CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610Nematocida parisii 18SCal Fluor Rouge 610 (CF610)AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAMNematocida ausubeli 18S5' 6-fluorescéine (FAM)CAGGTCACCCCACGTGCT

Tableau 1 : Liste des séquences de sondes FISH. Toutes les sondes FISH ont été achetées commercialement avec le fluorophore fixé à l’extrémité 5' (via une synthèse personnalisée d’oligonucléotides; voir le tableau des matériaux) et les oligonucléotides ont été purifiés par HPLC en phase inverse.

Discussion

Wild C. elegans est naturellement associé à une variété de microbes. Les chercheurs peuvent utiliser ARN FISH pour détecter et identifier ces microbes ainsi que pour mieux comprendre leur localisation dans le contexte d’un animal entier. Les microbes ayant des phénotypes souhaitables ou intéressants peuvent être identifiés grâce à cette méthode, puis isolés pour une caractérisation et un séquençage plus approfondis. L’abondance de nombreux isolats bactériens de C. elegans sauvage peut également être quantifiée par ARN FISH29. En utilisant le protocole décrit ici, il est également possible d’observer des micro-organismes connus à l’intérieur de leurs hôtes et d’en apprendre davantage sur leurs interactions. Il est important de noter que le virus d’Orsay et les microsporidies sont des parasites obligatoires et ne peuvent pas être cultivés indépendamment de l’hôte, de sorte que FISH est l’outil de visualisation standard. La colonisation ou l’infection peut également être quantifiée par ARN FISH en utilisant des nématodes cultivés sur des plaques ensemencées avec une bactérie cultivable d’intérêt désirée. En plus de colorer les micro-organismes dans l’intestin de C. elegans, ce protocole peut être utilisé pour d’autres souches de nématodes comme C. tropicalis ou Oscheius tipulae 19,23.

Le principal avantage du protocole FISH est qu’il offre une méthode simple, rapide et robuste pour colorer les microbes associés à C. elegans. Les images produites à partir de la coloration FISH ont un rapport signal sur bruit élevé, obtenu en utilisant des sondes FISH qui ciblent l’ARN abondant du SSU dans l’échantillon. Parce qu’il y a généralement des niveaux 30x ou plus d’ARNr que d’ADNr, la plupart du signal de la coloration FISH avec des sondes qui ciblent l’ARNr est dû à l’ARNr plutôt qu’à l’ADNr30. De plus, ARN FISH permet de voir l’infection ou la colonisation dans le contexte de l’animal entier. Cette visualisation est facilitée par la co-coloration des noyaux hôtes avec le DAPI et/ou l’utilisation de souches fluorescentes de C. elegans pour mieux mettre en évidence la localisation de l’infection ou de la colonisation dans l’échantillon. Par exemple, le FISH spécifique au microsporidien a été utilisé pour déterminer le tropisme tissulaire de Nematocida displodere en utilisant un panel de souches de C. elegans avec expression GFP dans différents tissus20. De plus, ce protocole se prête à des changements qui permettent aux chercheurs de déterminer les conditions idéales adaptées à leurs besoins spécifiques (p. ex., ajustement de la période de fixation, augmentation de la température d’hybridation).

Une étape critique du protocole FISH consiste à fixer les échantillons. La période d’incubation suivant l’ajout du fixateur est nécessaire pour laisser le temps à l’agent de perméabiliser l’échantillon. Des temps d’incubation plus longs ne sont pas idéaux pour les échantillons contenant des protéines fluorescentes transgéniques en raison de la dégradation des protéines par le PFA au fil du temps. Pour les échantillons contenant de la GFP, il est impératif de déterminer le temps de fixation optimal pour permettre la perméabilisation, tout en maintenant le signal GFP.

FISH peut être utilisé pour colorer les bactéries, les virus ou les microsporidies chez C. elegans. Cependant, le meilleur type d’agent fixateur utilisé pour FISH dépend de l’échantillon et des exigences en aval. Ce protocole présente une solution de PFA comme principal agent fixateur pour colorer les bactéries et les virus. Cependant, le PFA n’est pas suffisant pour la visualisation des spores microsporidiennes car il ne peut pas pénétrer la paroi des spores. Pour la visualisation des spores, l’acétone doit être utilisée à la place. Cependant, la fixation du PFA est efficace pour le marquage FISH d’autres stades de vie des microsporidies, y compris les sporoplasmes, les mérons et les sporontes. D’autres différences majeures sont observées entre la fixation de l’acétone et la fixation par PFA; L’acétone est plus pratique car les échantillons peuvent être rapidement conservés au congélateur après avoir été ajoutés, sans avoir besoin de les laver. Cependant, l’acétone tue rapidement toute GFP existante chez un hôte transgénique. Le PFA est le fixateur préféré s’il est important de préserver certaines structures physiologiques chez l’hôte, car les animaux fixés à l’acétone semblent être plus dégradés, ce qui rend l’identification de certains tissus plus difficile. Étant donné que les échantillons sont fixes, ce protocole FISH ne permet pas l’imagerie en direct des interactions hôte-microbe in vivo. Cependant, un cours temporel d’infection par la chasse au pouls suivi d’une coloration FISH des échantillons à divers moments peut permettre de voir une certaine dynamique de l’infection microbienne 19,20,31.

Une autre étape critique tout au long du protocole est le lavage complet des échantillons avant et après l’hybridation. Avant l’hybridation, lors de la collecte des vers dans les tubes de microfuge, les bactéries en excès ou d’autres microbes des plaques NGM peuvent être transportés avec l’échantillon de ver. Trois lavages avec PBS-T sont standard; cependant, d’autres lavages peuvent être nécessaires pour éliminer suffisamment les microorganismes externes, en particulier lors de l’utilisation de C. elegans isolé dans la nature fortement contaminé. Lors de l’observation des échantillons montés après FISH, il peut y avoir une sonde FISH résiduelle qui produit de grandes quantités de signal en arrière-plan de l’échantillon. La température de lavage et le nombre de lavages sont importants pour éliminer l’excès et la sonde non spécifiquement liée. Pour réduire la fluorescence de fond, il est possible d’effectuer deux ou trois lavages avec 1 mL de WB toutes les 30 min, au lieu d’un lavage avec 1 mL de WB pendant une heure. Différentes sondes FISH peuvent nécessiter des températures de lavage différentes. En règle générale, la température de lavage est supérieure de 2 °C à la température d’hybridation, mais elle peut être augmentée s’il y a trop de fluorescence de fond (bruit élevé).

Le protocole FISH utilise des sondes fluorescentes conçues pour cibler l’ARN microbien spécifique à l’espèce, mais les sondes FISH peuvent être conçues pour d’autres transcrits à copie élevée. D’autres sondes FISH peuvent avoir des températures de fusion différentes, de sorte que les étapes d’incubation peuvent devoir être effectuées à une température plus élevée ou plus basse que celle décrite. La coloration FISH peut identifier la distribution spatiale de la colonisation microbienne ou de l’infection au sein de l’hôte, ce qui permet de caractériser les interactions hôte-microbe et microbe-microbe. L’une des limites est que seuls quelques fluorophores conventionnels peuvent être utilisés simultanément, ce qui réduit le nombre de micro-organismes différents pouvant être détectés via FISH en même temps. Cela limite son utilisation pour les études complexes du microbiome chez C. elegans. Cependant, FISH multicolore ciblant l’ARNr utilise des sondes marquées avec des fluorophores non canoniques qui peuvent augmenter le nombre de marqueurs de groupes microbiens distincts15. Une autre limite est qu’il est difficile de distinguer les espèces étroitement apparentées, en particulier les bactéries, qui ont des séquences SSU très similaires. Cependant, la divergence extrême des séquences entre les espèces de microsporidies contribue à faciliter leur différenciation avec ce protocole (Figure 3)32,33.

Dans l’ensemble, ce protocole FISH décrit une technique de détection des micro-organismes chez C. elegans. Il permet aux chercheurs d’utiliser un système modèle transparent et génétiquement traitable pour détecter et quantifier la colonisation et l’infection dans le contexte d’un animal intact, ainsi que pour identifier le comportement microbien ou la morphologie unique de l’hôte. Une version préimprimée de ce manuscrit a été publiée lors de la revue34.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Merci à la Dre Marie-Anne Félix de nous avoir fourni des souches de nématodes sauvages. Ce travail a été soutenu par la NSF dans le cadre de la subvention CAREER 2143718 et la California State University dans le cadre d’une bourse CSUPERB New Investigator à RJL, NIH sous R01 AG052622 et R01 GM114139 à ERT, et par une bourse de l’American Heart Association à VL.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDSInvitrogenAM9822
AcetoneFisher ScientificA-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield)VectalabNC9524612
EDTAFisher ScientificS311-500
FISH probes (see Table 1)LGC Biosearch TechnologiesFISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KClFisher ScientificP217
KH2PO4Fisher ScientificP-286
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500
NaClFisher ScientificS-671
NH4ClFisher ScientificA-661
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science50-980-487CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixerEppendorf5384000020
Tris baseFisher ScientificBP152
Triton X-100Fisher ScientificBP-151
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

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