Détection et quantification de nanotubes à effet tunnel à l’aide d’images 3D Volume View

Résumé

Les nanotubes à effet tunnel (TNT) sont principalement des nanotubes à membrane F-actine ouverts qui relient les cellules voisines, facilitant ainsi la communication intercellulaire. La caractéristique notable qui distingue les TNT des autres protubérances cellulaires est la nature planante des nanotubes entre les cellules. Ici, nous caractérisons les TNT en construisant une vue de volume 3D d’images confocales z-stack.

Résumé

Des découvertes récentes ont révélé que les cellules effectuent un transfert intercellulaire direct à longue portée via des conduits actine-membrane à l’échelle nanométrique, à savoir des « nanotubes tunneling » (TNT). Les TNT sont définis comme des extensions membranaires ouvertes et entourées de bicouches lipidiques qui assurent la continuité entre les cellules voisines de diamètres compris entre 50 nm et 1 μm. Les TNT ont été initialement démontrés dans les cellules neuronales, mais des études successives ont révélé l’existence de TNT dans plusieurs types de cellules et maladies, telles que les maladies neurodégénératives, les infections virales et le cancer. Plusieurs études ont fait référence à des nanostructures membranaires à couplage électrique rapproché entre des cellules voisines en tant que TNT ou structures de type TNT.

L’élucidation de l’ultrastructure en termes de continuité membranaire à l’extrémité est techniquement difficile. En outre, les études sur la communication cellule-cellule sont difficiles en termes de caractérisation des TNT à l’aide de méthodes conventionnelles en raison de l’absence de marqueurs spécifiques. Les TNT sont principalement définis comme des protubérances membranaires ouvertes à base de F-actine. Cependant, une limitation majeure est que la F-actine est présente dans tous les types de protubérances, ce qui rend difficile la différenciation des TNT des autres protubérances. L’une des caractéristiques notables des TNT à base de F-actine est que ces structures oscillent entre deux cellules sans toucher le substrat. Par conséquent, les TNT distincts colorés à la F-actine peuvent être distingués d’autres protubérances telles que les filopodies et les neurites en fonction de leur vol stationnaire entre les cellules.

Nous avons récemment montré que l’internalisation de l’amyloïde-β_{oligomère 1-42} (oAβ) via l’endocytose actine-dépendante stimule la kinase-1 activée par p21 (PAK1), qui intervient dans la formation de TNT contenant de la F-actine coexprimée avec phospho-PAK1 entre les cellules neuronales SH-SY5Y. Ce protocole décrit une méthode d’analyse de volume 3D pour identifier et caractériser les TNT à partir des images z-stack capturées des protubérances membranaires immunocolorées F-actine et phospho-PAK1 dans les cellules neuronales traitées oAβ. De plus, les TNT se distinguent du développement de neurites et d’excroissances neuronales basées sur des conduits membranaires immunocolorés par la tubuline F-actine et β-III.

Introduction

Les nanotubes tunneliers (TNT) sont des conduits à membrane à base de F-actine, principalement ouverts, et jouent un rôle essentiel dans le transfert intercellulaire de cargaison et d’organites¹. La caractéristique unique des TNT est qu’ils connectent des cellules voisines sans aucun contact avec le substrat; Ils mesurent plus de 10 à 300 μm de long et leur diamètre varie entre 50 nm et 1 μm ^2,3. Les TNT sont des structures transitoires et leur durée de vie dure de quelques minutes à plusieurs heures. Les TNT ont d’abord été démontrés dans les cellules neuronales PC12¹; Plus tard, de nombreuses études ont montré leur existence dans plusieurs types cellulaires in vitro et in vivo ^4,5. Plusieurs études ont révélé l’importance pathologique des TNT dans divers modèles de maladies, telles que les maladies neurodégénératives, le cancer et les infections virales ^6,7,8.

Les hétérogénéités structurelles des TNT ont été démontrées par plusieurs études dans divers systèmes cellulaires⁹. Les différences sont basées sur la composition du cytosquelette, le mécanisme de formation et les types de cargaison transférés¹⁰. Principalement, la continuité membranaire ouverte et F-actine positive qui plane entre deux cellules voisines et transfère des organites est considérée comme constituée de TNT¹¹. Cependant, le manque de clarté ou de diversité observé dans la formation des TNT ajoute à la difficulté de développer des marqueurs spécifiques au TNT. Ainsi, il est difficile d’identifier les structures TNT par des méthodes de détection conventionnelles et de distinguer les nanotubes membranaires en termes de protubérances ouvertes et fermées¹². Cependant, la caractéristique des TNT de planer sous forme de protubérances de la membrane F-actine entre deux cellules est relativement plus facile et plus réalisable à identifier à l’aide de techniques d’imagerie conventionnelles. D’autres protubérances cellulaires à base d’actine telles que les filopodia et les filopodia dorsales ne peuvent pas planer entre deux cellules éloignées, en particulier lorsque les cellules sont fixes. Il convient de noter que les neurites en développement à extrémité fermée, couplées électriquement, sont souvent appelées structures de type TNT¹³.

On sait que la F-actine joue un rôle important dans la formation de TNT, et plusieurs études ont montré que l’inhibiteur de la F-actine cytochalasine D inhibe la formation de TNT^14,15. En revanche, les inhibiteurs des microtubules n’ont aucun effet sur la formation de TNT¹⁶. Les 2 dernières décennies ont vu plusieurs rapports sur le rôle important que jouent les TNT dans la propagation de la pathologie et de la résistance tumorale et de la thérapie¹⁷. Par conséquent, il existe une demande sans fin pour de meilleures techniques de caractérisation du TNT.

L’absence de marqueurs spécifiques des TNT et la diversité de la morphologie et de la composition du cytosquelette rendent difficile le développement d’une méthode unique de caractérisation. Certaines études ont utilisé des techniques automatisées de détection d’images et de quantification TNT^18,19. Cependant, la méthode actuelle d’analyse manuelle de volume 3D présente plusieurs avantages par rapport à l’analyse automatique d’images pour la détection et la quantification des TNT. Souvent, des yeux humains entraînés peuvent repérer ces nanostructures en vol stationnaire plus facilement qu’une méthode de détection d’images automatisée. De plus, les méthodes de détection automatique pourraient être difficiles à mettre en œuvre dans des laboratoires dépourvus d’expertise en algorithmes. La méthode actuelle pourrait être largement adoptée par les chercheurs en raison de sa précision et de sa reproductibilité.

Dans une étude récente, nous avons montré que l’oAβ favorise la biogenèse des TNT dans les cellules neuronales via un mécanisme d’endocytose médié par PAK1, dépendant de l’actine¹². Les TNT induits par oAβ expriment également PAK1 activé (ou phospho-PAK1). Nous avons développé une méthode de reconstruction d’images en vue de volume 3D pour distinguer les TNT immunocolorés par oAβ, F-actine et phospho-PAK1. Les neurones en développement positifs à la tubuline β-III ressemblent souvent à des structures planantes de type TNT²⁰. Par conséquent, nous avons en outre distingué les TNT à base de F-actine des neurites positifs à la tubuline β-III et d’autres protubérances de type TNT. Les images de volume 3D ont été utilisées pour identifier les TNT sur la base de leurs caractéristiques de vol stationnaire au-dessus du substrat et de rester connectés entre deux cellules voisines. Cet article décrit l’identification et la détection de conduits membranaires contenant de l’actine ou de TNT à l’aide d’images confocales z-stack et, enfin, la quantification manuelle des structures identifiées à partir d’images de reconstruction de vue de volume 3D. La méthode présentée ne permet pas de distinguer les TNT propres ouverts des structures fermées de type TNT; cette méthode permet d’identifier les TNT en culture cellulaire 2D in vitro sur un substrat plat. Cependant, la méthode est facile à mettre en œuvre et à reproduire et peut être largement utilisée pour la quantification précise des TNT à base d’actine et pour les distinguer des neurites et des structures de type TNT positives à la β-tubuline.

Protocole

REMARQUE : Les cellules SH-SY5Y cultivées en milieu DMEM/F-12 ont été différenciées avec de l’acide rétinoïque 10 μM pendant 7 jours et traitées avec des oligomères oAβ de 1 μM pendant 2 h à 37 °C (5 % de CO₂). Après traitement, les cellules ont été fixées avec la solution fixatrice de Karnovsky et double-immunocolorées avec des anticorps phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) et une phalloïdine liant la F-actine. Plus tard, des images confocales z-stack ont été prises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les TNT ont été quantifiés par comptage manuel et distingués des autres neurites / protubérances cellulaires en construisant des images de vue de volume 3D et en identifiant les structures à partir de leur caractéristique de vol stationnaire entre deux cellules sans toucher le substrat (Figure 1).

1. Culture cellulaire et différenciation

1. Culture des cellules neuronales SH-SY5Y dans un milieu DMEM/F12 (Ham’s) 1:1 avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de mélange pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN). Ensemencez les cellules dans une boîte d’imagerie de 35 mm avec un puits de 14 mm composé d’une lamelle de couverture #1.5 au centre de la capsule fixée au fond. Ensemencer les cellules sur la boîte d’imagerie à une concentration de 12 000 cellules/^cm2 et effectuer les expériences à 60%-70% de confluence.
2. Différencier partiellement les cellules avec 10 μM d’acide rétinoïque (PR) d’une solution mère de 100 mM (5 mg de PR dans 15 mL de diméthylsulfoxyde [DMSO]). Ensuite, incuber les cellules pendant 7 jours à 37 °C (5% CO 2) pour la différenciation avec changement de milieu tous les₂ jours.
   REMARQUE: Soyez prudent quant au maintien de la confluence (60% -70%) des cellules (cellules indifférenciées et partiellement différenciées). La densité cellulaire peut influencer la formation de TNT entre les cellules.

2. Préparation d’oligomères d’amyloïde-β_1-42 (oAβ) pour traiter les cellules neuronales

1. Dissoudre Aβ _1-42 (1 mg) dans 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol et diviser la solution en 20 aliquotes, contenant chacune 0,05 mg de peptides. Lyophiliser et conserver les aliquotes à −20 °C pour une utilisation ultérieure.
2. Préparer la solution mère (5 mM) de l’Aβ _1-42 lyophilisé dans le DMSO en ajoutant 2,2 μL de DMSO à 0,05 mg de peptide lyophilisé. Pour dissoudre soigneusement les peptides, vortex la solution et sonicate pendant 2 minutes dans un sonicateur au bain-marie.
3. Diluer la solution mère à une concentration de 100 μM dans le DMEM, pH 7,4, et vortex pour convertir les peptides en monomères, suivi d’une incubation à 4 °C pendant 24 h pour obtenir des oligomères de Aβ _1-42 (oAβ)^12,21,22.
4. Caractériser oAβ avant les expériences comme rapporté précédemment^21,22 par imagerie par microscopie électronique à transmission.
5. Traiter les cellules SH-SY5Y partiellement différenciées avec 1 μM oAβ. Retirez le milieu avant les traitements et ajoutez du DMEM frais sans FBS. Après le changement de milieu, ajouter de l’oAβ préalablement préparé (100 μM) au milieu jusqu’à une concentration finale de 1 μM. Incuber les cellules avec 1 μM oAβ pendant 2 h à 37 °C (5% CO₂). Inclure un contrôle négatif sous la forme de cellules non traitées.

3. Immunocoloration de la F-actine et de la PAK1 activée pour la caractérisation des TNT

1. Effectuer une immunomarquation différentielle en utilisant l’anticorps phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) et la phallotoxine de liaison à la F-actine phalloïdine.
2. Laver les cellules témoins et les cellules traitées à l’oAβ avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 x 2 min avant la fixation. Préparer la solution fixatrice de Karnovsky en utilisant un fixateur de formol à 2% et 2,5% de glutaraldéhyde dissous dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2. Ensuite, fixez les cellules dans la boîte d’imagerie en ajoutant la solution fixatrice de Karnovsky (juste assez pour couvrir les cellules) pendant 45 minutes à température ambiante.
3. Lavez les cellules fixes 2 x 2 min à l’aide d’un tampon d’incubation. Préparer le tampon d’incubation (20x) en dissolvant 0,1 g de saponine dans 5 mL de FBS et diluer à 1x en ajoutant 95 mL de 1x PBS.
4. Après fixation, ajouter le premier anticorps contre le phopho-PAK1 à une dilution de 1:250 dans le tampon d’incubation et incuber pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humide et sombre.
5. Le lendemain, après 24 h d’incubation, laver les cellules 2 x 2 min avec le tampon d’incubation ; Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (dilution 1:1 000) et Phalloïdine 555 (dilution 1:1 000). Incuber les cellules dans la chambre humide foncée pendant 1,5 h à température ambiante.
6. Après l’incubation, laver les cellules 2 x 2 min avec un tampon d’incubation. Colorer le noyau en ajoutant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans une dilution 1:2 000 et incuber pendant 5 min à 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
7. Préparer le support de montage DABCO en utilisant 25 mg de DABCO dans 90% de glycérol et 10% 1x PBS. Pour dissoudre correctement, ajuster le pH à 8,6 en utilisant le grade spectrophotométrique, diluer HCl (dilué 1:20 avec de l’eau) et conserver la solution sur une bascule pour le mélange.
8. En tant qu’agent antiblanchissant, ajoutez le support de montage DABCO directement sur l’antenne d’imagerie contenant la lamelle de couverture en bas. Attendez au moins 1-2 h et procédez directement à l’imagerie confocale.
   REMARQUE: Aucun adhésif n’est nécessaire pour fixer les lamelles de couverture.

4. Immunomarquage de la F-actine et de la tubuline β-III pour distinguer les TNT des neurites

1. Effectuer une immunocoloration différentielle avec l’anticorps β-III tubuline et la phallotoxine de liaison à la F-actine phalloïdine.
2. Lavez les cellules traitées à l’oAβ 2x avec 1x PBS avant d’ajouter la solution fixatrice de Karnovsky. Incuber les cellules pendant 45 min à température ambiante et laver les cellules 2 x 2 min avec un tampon d’incubation.
3. Après fixation, ajouter l’anticorps contre la tubuline β-III (TUBb3) à une dilution de 1:250 dans le tampon d’incubation et incuber à 4 °C pendant une nuit dans la chambre humide et sombre.
4. Le lendemain, laver les cellules avec un tampon d’incubation (2 x 2 min) et ajouter l’anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 488 (dilution 1:1 000) et Phalloïdine 555 (dilution 1:1 000) ensemble dans la même boîte. Ensuite, incuber les cellules pendant 1,5 h à température ambiante dans la chambre humide sombre.
5. Lavez les cellules 2x avec un tampon d’incubation et ajoutez du DAPI à coloration nucléaire dans une dilution 1:2 000 pendant 5 à 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
6. Ajouter l’agent anti-blanchiment DABCO dans le support de montage comme mentionné ci-dessus et attendre 2 h avant l’imagerie.

5. Imagerie par microscopie confocale

1. Pour identifier les TNT, capturez des images z-stack de cellules immunocolorées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Prenez les images à l’aide de l’objectif DIC d’huile 40x/1.40 avec des ensembles de filtres DAPI, isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et tétraméthylrhodamine (TRITC).
2. Tout d’abord, sélectionnez les canaux en cliquant séquentiellement sur les lasers requis dans les fenêtres Piste 1, Piste 2 et Piste 3 dans le logiciel confocale. Cliquez sur l’option T-PMT sous la fenêtre Piste 1 pour prendre les images de contraste d’interférence différentielle (DIC) avec des canaux de fluorescence.
   REMARQUE: Les images DIC sont capturées par un détecteur différent étiqueté T-PMT.
3. Sélectionnez l’onglet acquisition du logiciel, cliquez sur l’onglet Z-stack et attendez qu’une fenêtre s’ouvre. Ensuite, cliquez sur Live Scan pour concentrer les cellules au bas de la boîte. Sélectionnez cette image focalisée comme première pile. Ensuite, concentrez-vous vers le haut pour voir la partie supérieure de la cellule et sélectionnez-la comme dernière pile. Arrêtez l’analyse en direct et cliquez sur le numéro à côté de l’onglet optimal pour fixer la taille des pas des piles. La taille des pas détermine le nombre de tranches et les intervalles en fonction de l’épaisseur des cellules.
   REMARQUE: La taille des pas sera sélectionnée en fonction de l’échantillonnage de Nyquist pour prendre suffisamment de tranches et s’assurer qu’il n’y a pas d’espace entre les deux piles. L’échantillonnage de Nyquist est déterminé sur la base de l’objectif et des longueurs d’onde des lumières²³.
4. Prenez des images séquentielles de trois canaux de DAPI, FITC et TRITC avec des lasers de 405 nm, 488 nm et 561 nm et capturez avec un temps de séjour de pixel de 1,02 μs. Capturez des images dans le canal DIC avec des canaux de fluorescence pour observer la limite cellulaire.
5. Capturez une pile d’images avec les dimensions de x: 224,92 μm et y: 224,92 μm, avec chaque pixel de taille²²⁰ nm 2 et z-scaling de 415 nm.
6. Prenez des images en capturant plusieurs piles z (15-22 piles) du bas vers le haut des cellules. Acquérir au moins 10 images du champ aléatoire de la boîte de culture pour obtenir un total de ~200-300 cellules.
7. Analyser les images capturées hors ligne pour identifier les TNT par analyse de volume 3D

6. Analyse d’images confocales z-stack pour identifier et quantifier les TNT

1. Ouvrez les images confocales enregistrées au format de données .czi dans le logiciel Fiji pour analyse.
2. Sélectionnez l’option Hyperstack pour voir chaque z-stack et canal de l’image. Recherchez les hyperpiles des piles z et des canaux, qui s’ouvrent dans une seule fenêtre, comme illustré à la figure 2. Faites défiler les barres de défilement du canal (indiqué par des flèches rouges et vertes) et de la pile z (indiqué par des flèches bleues) pour sélectionner la pile exacte d’un canal d’intérêt particulier.
   REMARQUE: Dans les cellules fixes, comme les TNT en vol stationnaire ou les conduits membranaires restent au-dessus de la surface, les structures ne sont pas visibles dans les parties inférieures des piles z. Cependant, dans les cellules fixes, les neurites se trouvent à la surface et sont détectables dans les parties inférieures des piles z (z = 0 à 2). Voir la figure 2 pour les étapes d’identification.
3. Comme illustré à la figure 2, sélectionnez d’abord le canal coloré F-actine (indiqué par des flèches rouges) en faisant défiler la barre de couche. Ensuite, faites défiler manuellement les z-stacks (indiquées par des flèches bleues) pour voir chaque pile une par une. Identifiez les structures colorées par la F-actine qui semblent relier les cellules, sont visibles dans les parties inférieures des piles z et sont proches de la surface de l’antenne d’imagerie (z = 2) sous forme de neurites (indiquées par des flèches blanches).
   REMARQUE: La majorité des neurites sont faciles à identifier car ils apparaissent comme des protubérances étendues (indiquées par des flèches roses).
4. Identifiez les TNT, les conduits de cellule à cellule en vol stationnaire F-actine positifs, en faisant défiler les piles z vers le haut (de z = 4 dans la figure 2; indiqué par des flèches jaunes). Recherchez les neurites près des parties inférieures des piles z vers la surface et observez qu’elles commencent à disparaître avec le défilement des piles z vers le haut (à z = 6 sur la figure 2; les neurites ne sont pas clairement visibles).
5. Identifier les TNT phospho-PAK1-positifs de la même manière que les TNT F-actine positives en analysant la nature planante des conduits des piles z. Comme la coloration phospho-PAK1 est plus faible que la coloration F-actine, recherchez les TNT colorés au phopho-PAK1 à z = 4 (faiblement visible) et à z = 6 (proéminent).
6. De plus, observez les images DIC pour vérifier que les structures TNT colorées par F-actine et phospho-PAK1 sont des conduits membranaires entre les cellules (Figure 3). De plus, fusionner les canaux F-actine (rouge) et phospho-PAK1 (vert) pour vérifier que les TNT identifiées sont des structures cocolorées F-actine et phospho-PAK1 (Figure 3).
7. Pour quantifier les TNT, comptez manuellement le nombre total de cellules et les TNT identifiées et représentez les nombres en pourcentages.
8. Pour distinguer les TNT F-actine positives et la tubuline β-III positive (TUBb3) des conduits stationnaires de type TNT des images z-stack, fusionnez les canaux F-actine (rouge) et TUBb3 (vert) (Figure 4). Ensuite, analysez les z-stacks des images fusionnées.
   1. Recherchez exclusivement des TNT colorés à la F-actine qui sont faiblement visibles à z = 3 et proéminents à z = 6 et z = 9 (flèches jaunes). De même, identifiez les conduits stationnaires de type TNT de type TNT de la F-actine et de la tubuline β-III (TUBb3) à z = 6 et z = 9 (flèches cyan). Identifier d’autres protubérances non stationnaires colorées par la tubuline F-actine et β-III provenant des parties inférieures des piles z (flèches blanches).
9. Mesurer le diamètre des TNT à l’aide de l’outil de ligne aux Fidji. Vérifiez l’échelle de mesure en cliquant sur Analyser | Réglez l’échelle de sorte que la « distance en pixels » soit définie automatiquement à partir des images .czi. Mesurez les diamètres des TNT au niveau du plan xy.
   REMARQUE: La plupart des diamètres sont compris entre 1 pixel et 4 pixels (c .-à-d. 220-880 nm); Chaque pixel est de 220 nm. Voir la figure 5 pour un résumé du protocole d’analyse des images confocales z-stack.

7.3D reconstruction d’images z-stack pour caractériser les TNT

1. Utilisez le plug-in de visualisation de volume aux Fidji, qui permet le redécoupage 3D et la visualisation 3D à seuil (Figure 6).
2. Divisez les images z-stack en canaux individuels. Ensuite, rognez les images z-stack monocanal (canal F-actine) pour utiliser la vue de reconstruction 3D afin de mettre en évidence un ou deux TNT ou neurites à la fois. Activez le plug-in de vue de volume pour visualiser les vues xy, yz et xz.
3. Épinglez un seul TNT ou neurite dans le plan xy (les flèches blanches représentent les neurites de la figure 6A ; les flèches jaunes représentent les TNT de la figure 6B) et marquez les coupes transversales des axes xz (rouge) et yz (vert). Observez les neurites au bas du plan xz dans les plans xz et yz (flèches blanches, Figure 6A) et les TNT dans les piles z supérieures (flèches jaunes, Figure 6B).
4. Sélectionnez le TNT ou le neurite individuel pour reconstruire la vue du volume 3D dans le plan xz (Figure 6C, D). Dans la reconstruction 3D, observez les neurites au bas du plan z (flèches blanches, Figure 6C) et les TNT apparaissant comme des structures planantes reliant deux cellules sans toucher le plan z inférieur (flèches jaunes, Figure 6D).

Résultats

Ici, nous identifions et caractérisons les TNT induits par oAβ dans les cellules neuronales SH-SY5Y en construisant des vues de volume 3D à partir d’images confocales z-stack (Figure 1). Les cellules ont été doublement immunocolorées avec F-actine et phospho-PAK1. Des images confocales de cellules immunocolorées ont été analysées pour identifier les TNT (Figure 2). De plus, les images DIC ont été analysées pour vérifier que les structures TNT col...

Discussion

Plusieurs chercheurs au cours des 2 dernières décennies ont essayé de comprendre et de caractériser la structure des TNT¹⁸. L’absence de marqueurs spécifiques entrave les progrès, et il existe une demande croissante pour une méthode pratique et normalisée qui peut être utilisée pour identifier, caractériser et quantifier les TNT. Les TNT sont définis comme des conduits membranaires à base de F-actine qui planent entre deux cellules. Des études ont montré que les β-tubuline positi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation