Construction de vecteurs adénoviraux à l’aide de la technologie d’assemblage de l’ADN

Résumé

Dans cette étude, un clone infectieux de l’adénovirus humain de type 7 (HAdV-7) a été construit, et un système de vecteur HAdV-7 délélé E3 a été établi en modifiant le clone infectieux. Cette stratégie utilisée ici peut être généralisée pour fabriquer des vecteurs de transfert de gènes à partir d’autres adénovirus de type sauvage.

Résumé

Les vecteurs adénoviraux sont utilisés comme outil de transfert de gènes en thérapie génique depuis plus de trois décennies. Ici, nous introduisons un protocole pour construire un vecteur adénoviral en manipulant l’ADN génomique de HAdV-7 de type sauvage en utilisant une méthode d’assemblage d’ADN. Tout d’abord, un clone infectieux de HAdV-7, pKan-Ad7, a été généré par fusion de l’ADN génomique viral avec un produit PCR à partir du squelette plasmidique, comprenant le gène résistant à la kanamycine et l’origine de la réplication (Kan-Ori), par assemblage de l’ADN. Cela a été fait en concevant une paire d’amorces PCR, qui contenaient ~25 nucléotides de la séquence terminale de la répétition terminale inversée (ITR) de HAdV-7 à l’extrémité 5', un site d’enzyme de restriction non cutter pour le génome HAdV-7 au milieu et une séquence spécifique à la matrice pour l’amorçage de la PCR à l’extrémité 3'. Deuxièmement, une stratégie intermédiaire basée sur le plasmide a été employée pour remplacer la région E3 par des éléments exprimant le transgène dans le clone infectieux afin de générer un vecteur adénoviral. Brièvement, pKan-Ad7 a été digéré avec l’enzyme de restriction à double coupure Hpa I, et le fragment contenant la région E3 a été ligaturé à un autre produit PCR du squelette plasmidique par assemblage Gibson pour construire un plasmide intermédiaire pKan-Ad7HpaI. Pour plus de commodité, le terme restriction-assemblage a été utilisé pour désigner la méthode de clonage plasmidique de digestion et d’assemblage par restriction combinée. En utilisant l’assemblage-restriction, les gènes E3 de pKan-Ad7HpaI ont été remplacés par une cassette d’expression de protéine fluorescente verte (GFP), et la région E3 modifiée a été libérée du plasmide intermédiaire et restaurée dans le clone infectieux pour générer un plasmide adénoviral pKAd7-E3GFP. Enfin, pKAd7-E3GFP a été linéarisé par digestion Pme I et utilisé pour transfecter les cellules d’emballage HEK293 afin de sauver le virus recombinant HAdV-7. Pour conclure, une stratégie basée sur l’assemblage de l’ADN a été introduite ici pour construire des vecteurs adénoviraux dans les laboratoires généraux de biologie moléculaire sans avoir besoin de matériaux et d’instruments spécialisés.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, les vecteurs adénoviraux recombinants ont été largement utilisés dans le développement de vaccins et la thérapie génique 1,2,3,4 ainsi que dans la recherche fondamentale en raison de leurs propriétés biologiques exceptionnelles, telles que l’efficacité élevée de la transduction génique, la non-intégration au génome de l’hôte, le génome viral manipulateur et la facilité de production à grande échelle.

À l’heure actuelle, les vecteurs adénoviraux les plus couramment utilisés sont construits à partir de l’adénovirus humain 5 (HAdV-5)^5,6. Bien que la transduction médiée par le vecteur HAdV-5 donne des résultats encourageants, les applications précliniques et cliniques ont révélé plusieurs inconvénients (par exemple, une immunité antivectorielle préexistante élevée au sein de la population humaine et une faible efficacité de transduction dans les cellules dépourvues du récepteur du virus coxsackie et de l’adénovirus (CAR)). Pour contourner ces problèmes, il y a eu un grand intérêt pour la construction de vecteurs basés sur d’autres types d’adénovirus humains ou mammifères^{3, 7, 8}.

Jusqu’à présent, la méthode la plus populaire pour construire un vecteur adénoviral est la recombinaison homologue chez les bactéries⁵. Ces souches bactériennes doivent exprimer des recombinases, ce qui peut affecter la stabilité ou l’amplification des plasmides qu’elles portent. Certaines souches sont même indisponibles dans le commerce. Récemment, des méthodes basées sur d’autres principes, notamment les chromosomes artificiels bactériens, le clonage direct ou l’assemblage direct de l’ADN, ont été employées pour générer des clones infectieux d’adénovirus ou des vecteurs adénoviraux recombinants 9,10,11,12. Cependant, ces méthodes sont quelque peu hostiles aux chercheurs peu expérimentés dans ce domaine.

En 2018, le processus de construction d’un clone infectieux d’adénovirus est simplifié en laboratoire en ligaturant directement le génome du virus avec un produit PCR porteur d’un squelette plasmidique via l’assemblage Gibson¹³. Après cela, les méthodes de digestion de restriction et d’assemblage de Gibson sont combinées pour charger les transgènes sur les plasmides adénoviraux existants 14,15,16,17,18. Pour des raisons de commodité, le terme « assemblage de restriction » est utilisé ci-après pour désigner la méthode de digestion combinée par enzyme de restriction et d’assemblage de Gibson. Des stratégies ont été développées pour construire des vecteurs adénoviraux à partir de clones infectieux en utilisant l’assemblage-restriction¹⁹. L’essence de l’assemblage-restriction est d’inclure autant que possible des fragments excisés des plasmides dans une réaction d’assemblage de l’ADN, tandis que les produits PCR courts servent de liants ou de patchs pour la modification du plasmide. Dans le même temps, le nombre de fragments inclus est maintenu aussi bas que possible. De tels efforts reflètent les fruits de l’action ; la possibilité de mutations indésirables causées par la PCR ou l’assemblage de l’ADN peut être minimisée et le taux de réussite peut être amélioré. De manière concluante, un pipeline d’un adénovirus de type sauvage à un vecteur adénoviral a été mis en place dans le laboratoire 13,14,15,16,17,18,19.

Ici, nous tentons d’introduire ces méthodes en fournissant des exemples de construction d’un clone infectieux HAdV-7 et d’un vecteur HAdV-7 compétent pour la réplication supprimée E3.

Protocole

REMARQUE : Les adénovirus sont classés au niveau de biosécurité 2 (BSL-2) ; Toutes les étapes d’utilisation des virus ont été réalisées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2. Le HAdV-7 de type sauvage a été isolé en 2017 à partir de l’échantillon d’aspiration nasopharyngée d’un nourrisson de 10 mois hospitalisé pour une infection aiguë des voies respiratoires à l’hôpital pour enfants^{de Pékin 20}. Les stocks de virus ont été stockés à -80 °C.

1. Extraction de l’ADN génomique du HAdV-7

1. Semez 2,0 x 10⁶ cellules HEK293 dans une fiole T-25 contenant 5 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et cultivez à 37 °C dans une atmosphère humidifiée additionnée de 5 % de CO₂. Les cellules doivent être confluentes à 80 % à 90 % et prêtes à être infectées en 18 à 24 heures.
2. Inoculer les cellules avec le HAdV-7 de type sauvage pendant 2 h. Retirer le milieu contenant le virus par aspiration et ajouter 5 mL de DMEM frais contenant 2 % de FBS dans les cellules.
3. Extraire l’ADN génomique viral avec la méthode de Hirt modifiée²¹
   1. Dans les 2 ou 3 jours suivant l’infection, lorsque l’effet cytopathique (EPC) est observé sur 50 à 90 % des cellules, jeter le surnageant de culture et rincer les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      REMARQUE : L’effet cytopathique (EPC) est défini comme un phénomène dans lequel les cellules infectées par le virus se rassemblent, gonflent et se fixent ou se détachent lâchement du flacon de culture en grappes ressemblant à des grappes de raisin²².
   2. Lyser les cellules dans le ballon dans 1,0 mL de tampon de lyse contenant 25 mM de Tris-HCl, 0,5 mM d’EDTA, 50 μg/mL de protéase K et 0,8 % de SDS (pH 7,6) pendant 5 min sur glace. Transférez le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et incubez le tube dans un bain-marie à 50 °C pendant 30 min.
   3. Ajouter 120 μL de tampon de précipitation dans le tube. Placez le tube sur de la glace pendant encore 30 minutes après avoir mélangé délicatement.
      REMARQUE : Le tampon de précipitation est composé de 3 M CsCl, 1 M d’acétate de potassium et 0,67 M d’acide acétique. Il aidera à précipiter les débris cellulaires et l’ADN des chromosomes cellulaires après la centrifugation tout en conservant le génome du virus dans le surnageant.
   4. Centrifugez le tube pendant 25 min à 15 000 x g à 4 °C, puis transférez le surnageant (environ 1,1 ml) dans un tube en polypropylène de 15 ml.
   5. Ajoutez 2,2 ml d’éthanol absolu glacé dans le tube. Mélangez délicatement et laissez reposer le tube sur de la glace pendant 15 min. Centrifugeuse pendant 5 min à 2000 x g à température ambiante.
   6. Aspirez soigneusement le surnageant et lavez le précipité (ADN génomique du virus) une fois avec 800 μL d’éthanol à 70 %. Centrifugez le tube pendant 6 min à 15 000 x g à température ambiante. Jetez le surnageant et séchez à l’air libre la pastille d’ADN au fond. Ne séchez pas trop la pastille d’ADN car elle pourrait causer des difficultés à se dissoudre.
   7. Dissoudre la pastille dans 200 μL de tampon TE (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM d’EDTA), ajouter 1 μL de RNase A (10 mg/mL) et incuber le tube à 37 °C pendant 15 min. Purifiez l’ADN dissous à l’aide d’un kit commercial de nettoyage et de concentration d’ADN génomique (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Quantifiez l’ADN génomique viral à l’aide de la méthode couramment utilisée en laboratoire. En général, 1 à 5 μg d’ADN génomique peuvent être obtenus dans une fiole T-25 de cellules HEK293 infectées par l’adénovirus.

2. Construction d’un clone infectieux de HAdV-7 par assemblage d’ADN

1. Concevoir des amorces PCR pour amplifier le squelette plasmidique (Figure 1). Ajoutez les séquences de chevauchement nécessaires à l’assemblage de l’ADN aux extrémités 5' des amorces de PCR. De plus, inclure des sites de restriction non coupants (p. ex., site Pme I) aux deux extrémités du génome HAdV-7 pour aider à libérer le génome viral du clone infectieux.
   REMARQUE : Le squelette plasmidique contenant le gène de résistance aux antibiotiques et l’origine de la réplication est amplifié par PCR et fusionné avec le génome HAdV-7. Les adénovirus peuvent être sauvés des cellules d’emballage avec une plus grande efficacité lorsque le génome du virus linéarisé est utilisé au lieu d’un plasmide adénoviral circulaire. Après avoir pris en compte les facteurs mentionnés ci-dessus, les amorces sont conçues comme indiqué sur la figure 1.
2. Effectuer une PCR pour amplifier un fragment (Kan-Ori) contenant le gène de résistance à la kanamycine (Kan) et l’origine pBR322 (Ori) en utilisant pShuttle-CMV comme matrice avec des amorces d’Ad7KanF1 et d’Ad7KanR1 (tableau S1). Réglez la réaction PCR comme suit : un cycle à 98 °C pendant 30 s, puis cinq cycles de dénaturation à 98 °C pendant 8 s, de recuit à 68 °C pendant 30 s, d’extension à 72 °C pendant 90 s, et enfin de 25 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 8 s, de recuit et d’extension à 72 °C pendant 2 min.
3. Exécutez le produit PCR dans un gel d’agarose à 1 % par électrophorèse et purifiez le fragment à l’aide d’un kit de récupération de gel d’ADN commercial.
4. Ajoutez l’ADN génomique Kan-Ori et viral récupéré de HAdV-7 au Master Mix d’assemblage d’ADN commercial. Mettre en place la réaction d’assemblage dans un volume total de 20 μL et un rapport molaire entre le vecteur et l’ADN génomique viral de 1:2. Incuber à 50 °C pendant 1 h.
   REMARQUE : Réglez la réaction dans un volume total de 20 μL avec 1-3 μL de vecteur, 7-9 μL d’ADN génomique viral et 10 μL de DNA Assembly Master Mix.
5. Transformez les cellules de la souche TOP10 d’E. coli chimiquement compétentes avec 10 μL du produit d’assemblage par choc thermique. Étaler le mélange de transformation sur des plaques de Luria-Bertani (LB-Kan) contenant de la kanamycine (50 μg/mL). Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 12 h.
6. Inoculer au moins trois clones chacun dans 5 mL de milieu LB-Kan à 37 °C pendant 12 h en agitant doucement (200-250 tr/min). Extrayez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide commercial.
7. Digérer le plasmide à l’aide d’une endonucléase de restriction, puis vérifier la taille des fragments d’ADN à l’aide d’une électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 2A). De plus, confirmez les sites de fusion par séquençage. Le plasmide d’assemblage correct est nommé pKan-Ad7.
8. Cultivez une culture de 100 ml de bactéries à partir du bon clone. Extrayez une préparation de maxi-plasmide à l’aide d’un kit commercial Plasmid Maxprep.

3. Construction in silico et modification d’un plasmide intermédiaire

REMARQUE : En général, un plasmide intermédiaire doit être construit, et la façon de construire un plasmide intermédiaire idéal est l’étape clé. Un logiciel d’analyse d’ADN doté d’un module d’enzymes de restriction, tel que pDRAW32 (un logiciel gratuit, disponible sur www.acaclone.com), est nécessaire pour la conception d’un plasmide intermédiaire.

1. Importez la séquence d’ADN de pKan-Ad7 dans pDRAW32 pour dessiner une carte plasmidique. Annotez les régions d’intérêt sur la carte. Pour pKan-Ad7, les régions E1, E3 et le squelette plasmidique (Kan-Ori) ont été annotés.
2. Utiliser le programme pDRAW32. Cliquez d’abord sur Paramètres > Sélection d’enzymes , puis sur Coupes min/max. Entrez 1 dans la zone Min et 2 dans la case Max, puis cochez la case avant dans toute la séquence. Enfin, cliquez sur OK pour afficher les sites uniques et doubles de l’enzyme de restriction de coupe sur la carte.
   REMARQUE : Généralement, seules les enzymes de restriction qui reconnaissent une séquence de 6 pb ou plus sont sélectionnées. Comme le montre la figure 3A, 17 enzymes correspondent aux critères de sélection des enzymes.
3. Prenons l’exemple du premier site de restriction qui borde la région E3 puisque la modification de l’E3 est prévue. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I et Spe I satisfaisaient à cette exigence.
   REMARQUE : Pour cette expérience, Hpa I est sélectionné car la digestion de pKan-Ad7 avec celui-ci générerait le fragment le plus court portant la région E3, et un plasmide intermédiaire plus petit faciliterait la modification future. La sélection des sites Sal I présente également des avantages - un tel plasmide intermédiaire convient à la modification des régions E1 et E3 (Figure S1).
4. Créez un fichier de séquence final affichant les deux brins d’ADN du plasmide intermédiaire pKan-Ad7HpaI. Cette séquence virtuelle peut être utilisée comme modèle pour concevoir des amorces qui se chevauchent.
   1. Copiez la séquence entre les deux sites de restriction Hpa I, y compris la région E3. Pour l’assemblage ultérieur, il est nécessaire de copier chaque séquence de ~20 pb (Tm égale ou supérieure à 48 °C) en dehors du site de restriction Hpa I (Figure 3C, chevauchement-Final 1 et chevauchement-Final2).
   2. Ajoutez la séquence de reconnaissance de Pme I (Figure 3C, gtttaaac) aux deux extrémités de la séquence ci-dessus.
   3. Ajouter la séquence du plasmide squelaire contenant le gène de résistance aux antibiotiques et l’origine de la réplication (Figure 3C, Kan-Ori) à l’extérieur du site de restriction de Pme I.
   4. Importez la séquence finale dans pDRAW32 pour dessiner une carte plasmidique. Annotez la région E3 sur la carte.
   5. Utiliser le programme pDRAW32. Cliquez d’abord sur Paramètres > Sélection d’enzymes , puis sur Coupes Min/Max. Entrez 1 dans les cases Min et Max, et cochez la case avant dans toute la séquence. Cliquez enfin sur OK pour afficher les sites uniques de l’enzyme de restriction sur la carte. On peut voir que de nombreux cutters uniques sont disponibles pour la modification E3.
      REMARQUE : Pour cette expérience, BstZ17 I et Mlu I sont sélectionnés pour le remplacement de E3 partiel. Un double cutter peut également être utile. Par exemple, la fraise double Ssp I et la fraise unique BssH II peuvent être sélectionnées pour le remplacement de l’ensemble de la région E3 en utilisant la PCR d’extension de chevauchement.
5. Concevez des amorces en utilisant la séquence virtuelle comme modèle pour la construction d’un plasmide intermédiaire (Figure 3C).
   REMARQUE : Pour raccourcir la longueur de chaque amorce, quatre amorces ont été conçues. Le produit de PCR, qui est amplifié avec des amorces d’Ad7HpaIF1 et d’Ad7HpaIR1, serait utilisé comme matrice pour obtenir le fragment final de PCR avec des amorces d’Ad7HpaIF2 et d’Ad7HpaIR2 (Figure 3C).

4. Sauvetage d’un adénovirus recombinant infectieux dans des cellules HEK293

REMARQUE : Les trois adénovirus générés dans cet article sont tous sauvés selon le protocole suivant.

1. Digérer 10 μg de plasmide adénoviral recombinant avec 2 μL de Pme I pendant 5 h à 37 °C dans un volume total de 100 μL pour linéariser le plasmide. Vérifiez 1 μL de l’ADN digéré sur un gel d’agarose à 0,8 %. La digestion devrait produire un fragment de ~34 kb du génome adénoviral et un squelette plasmidique de ~2,5 kb de Kan-Ori.
2. Purifiez le plasmide adénoviral linéarisé restant à l’aide du kit de nettoyage et de concentration d’ADN génomique.
3. Cultivez des cellules HEK293 dans du DMEM plus 10 % de FBS. Semez les cellules HEK293 (2 x 10⁶ cellules) dans une fiole T-25 1 jour avant la transfection afin qu’elles atteignent une confluence de 70 à 80 % le lendemain. Utilisez 5 μg de plasmide adénoviral digéré par Pme I pour transfecter les cellules HEK293 en utilisant des réactifs de transfection disponibles dans le commerce.
   REMARQUE : Le milieu des cellules transfectées doit être remplacé tous les 3 jours.
4. Vérifiez les cellules tous les jours, prélevez les cellules et le milieu de culture dans un tube en polypropylène de 15 ml lorsque les foyers de comète se forment (figure 2B, indiquant la réplication du virus).
5. Lyser les cellules selon trois cycles de congélation-décongélation. Après une centrifugation de 12 min à 1200 x g à température ambiante, recueillir le surnageant et le stocker à -80 °C pour la propagation ultérieure du virus.
   REMARQUE : Lorsque l’adénovirus recombinant exprime la GFP ou d’autres protéines fluorescentes, il est plus facile d’identifier si le virus est sauvé avec succès, car les foyers formés par les cellules positives aux protéines fluorescentes peuvent être observés intuitivement au microscope à fluorescence.

5. Construction du plasmide du génome HAdV-7 délétisé par E3

REMARQUE : Le génome de HAdV-7 a une longueur de 35 239 pb et la région E3 est située entre 27 354 pb et 31 057 pb du génome. Pour construire un plasmide intermédiaire, trouvez une endonucléase avec deux sites de coupe sur le plasmide du clone infectieux, ou deux endonucléases avec un seul site de coupe sur le plasmide. Il existe des Hpa I, Sal I ou Avr II et Mlu I. La séquence entre BstZ17 I (28 312 pb) et Mlu I (30 757 pb) doit être supprimée et remplacée par la cassette CMV-GFP-PA ou la cassette CMV-mCherry-PA.

1. Digérer 600 ng de pKan-Ad7 avec Hpa I. Purifier le grand fragment pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) et le petit fragment pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) respectivement, à l’aide d’un kit de récupération de gel d’ADN après électrophorèse sur gel. Stockez le pKAd7-HpaI-FL à -20 °C.
2. Amplifier le fragment contenant Kan et Ori en utilisant pShuttle-CMV comme modèle avec les amorces d’Ad7HpaIF1 et Ad7HpaIR1 (Tableau S1) par PCR. Récupérer et diluer le produit de PCR (2541 pb) à utiliser comme modèle pour le deuxième tour de réaction PCR afin d’amplifier Kan-Ori2 avec des amorces d’Ad7HpaIF2 et Ad7HpaIR2.
   1. Purifier le produit PCR (2584 pb) après résolution dans un gel d’agarose à 1 % par électrophorèse. Régler la réaction PCR comme suit : un cycle à 98 °C pendant 30 s, puis 30 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 8 s, recuit et extension à 72 °C pendant 2 min.
      REMARQUE : La partie centrale de Kan-Ori2 est le fragment contenant Kan et Ori, suivi des séquences d’une endonucléase de restriction unique qui n’existe pas dans le petit fragment pKAd7-HpaI-FS (par exemple, Pme I), et la région qui se chevauche avec le grand fragment pKAd7-HpaI-FL ; les séquences les plus externes sont la région qui se chevauche avec le petit fragment pKAd7-HpaI-FS.
3. Ajoutez le produit PCR Kan-Ori2 et le pKAd7-HpaI-FS récupéré à l’étape 5.1 à DNA Assembly Master Mix. Incuber à 50 °C pendant 1 h. Suivez les étapes 2.4 à 2.6. Le plasmide correct est nommé pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
4. Amplifiez le fragment CMV-GFP-PA (~1,7 kb) contenant le promoteur CMV, le CDS GFP et le signal polyA SV40 (PA) en utilisant pShuttle-GFP²³ comme modèle avec les amorces Ad7E3GFPF1 et Ad7E3GFPR1 (Tableau S1). Purifier le produit PCR (1650 pb) après résolution dans un gel d’agarose à 1 % par électrophorèse.
   REMARQUE : Les régions qui se chevauchent et qui peuvent être assemblées avec le pKan-Ad7HpaI digéré par BstZ17 I et Mlu I doivent être incluses dans les amorces, et un site de restriction unique (par exemple, Sbf I) qui n’existe pas dans le plasmide pKan-Ad7 est ajouté dans les amorces pour un assemblage de restriction supplémentaire.
5. Digestion de 300 ng de pKan-Ad7HpaI avec BstZ17 I et Mlu I. Purifier le fragment de 7,3 kb (la plupart des régions E3 sont supprimées) après résolution dans un gel d’agarose à 1 % par électrophorèse. Ajoutez le fragment récupéré de 7,3 kb et le fragment CMV-GFP-PA récupéré (~1,6 kb) à DNA Assembly Master Mix. Suivez les étapes 2.4 à 2.6. Le plasmide correct est nommé pKAd7-E3GFP (~9 kb).
   REMARQUE : Toutes les séquences entre BstZ17 I et Mlu I appartiennent à la région E3.
6. Digérer 300 ng de pKAd7-HE3GFP avec Pme I. Purifier le gros fragment (~6,4 kb) à l’aide d’un kit de récupération de gel d’ADN après électrophorèse sur gel. Ajoutez le fragment purifié et le pKAd7-HpaI-FL récupéré à l’étape 5.1 à l’ADN Assembly Master Mix. Incuber à 50 °C pendant 1 h. Suivez les étapes 2.4 à 2.6. Le plasmide correct est nommé pKAd7-E3GFP.
7. Cellules HEK293 transfectrices avec Pme I-linéarisé pKAd7-E3GFP comme décrit dans la section 3. L’adénovirus sauvé est nommé Ad7-E3GFP.
8. Amplifiez le fragment CMV-mCherry-PA (~1,6 kb) contenant le promoteur CMV, le mCherry CDS et le signal polyA SV40 en utilisant pKFAV4-CX19A comme modèle avec les amorces de Ad7E3CHEF1 et Ad7E3CHER1. Purifier le produit PCR après résolution dans un gel d’agarose à 1 % par électrophorèse.
9. Digérer 600 ng de pKAd7-E3GFP avec Sbf I, et purifier le fragment de ~35 kb. Ajoutez le fragment de 35 kb et le fragment CMV-mCherry-PA récupéré à DNA Assembly Master Mix. Incuber à 50 °C pendant 1 h. Suivez les étapes 2.4 à 2.6. Le plasmide correct est nommé pKAd7-E3CHE.
10. Cellules HEK293 transfectées avec Pme I-linéarisé pKAd7-E3CHE comme décrit dans la section 3. L’adénovirus sauvé est nommé Ad7-E3CHE.

6. Amplification et purification de l’adénovirus recombinant dans les cellules HEK293

1. Inoculer une monocouche confluente de 80 à 90 % de cellules HEK293 cultivées dans huit boîtes de culture de 150 mm de diamètre traitées par TC avec adénovirus. Incuber à 37 °C pendant 2 h sous une légère agitation. Remplacer le surnageant par 25 mL de DMEM contenant 2 % de FBS.
2. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2-3 jours.
   1. Jetez la majeure partie du surnageant des huit paraboles de 150 mm de diamètre lorsqu’une EPC affecte la majorité des cellules. Récoltez les cellules infectées à l’aide d’élévateurs de cellules d’un volume d’élution final de ~6,0 mL dans des tubes en polypropylène de 15 mL.
   2. Perturbez les cellules par trois cycles de gel-dégel pour libérer le virus. Éclaircir le lysat par centrifugation pendant 12 min à 1200 x g à température ambiante. Prélever le surnageant contenant le virus.
3. Ajouter du MgCl₂ (0,1 mM) et de la nucléase de benzonase (50 U/mL) au surnageant. Agitez doucement pendant 40 min à 37 °C. Ajouter du NaCl (600 mM) au surnageant et agiter doucement pendant encore 40 min à 37 °C. Centrifuger pendant 12 min à 1200 x g à température ambiante. Prélever le surnageant contenant le virus pour la purification.
4. Préparez du chlorure de césium (CsCl) avec différentes concentrations de 1,35 g/mL, 1,30 g/mL et 1,25 g/mL avec 10 mM de Tris-HCl.
   1. Ajouter 0,8 mL de solution de CsCl de 1,35 g/mL dans le fond d’un tube Ultra-Clear de 5,1 mL à l’aide d’une pipette, puis ajouter lentement 0,8 mL de solution de CsCl de 1,30 g/mL et 0,8 mL de solution de CsCl de 1,25 g/mL sur la première solution de manière séquentielle.
   2. Enfin, superposer soigneusement ~2,5 mL du surnageant recueilli à l’étape 6.3 sur une solution de CsCl de 1,25 g/mL, et remplir le tube à 2-3 mm du haut avec 10 mM de Tris-HCl.
5. Centrifugeuse pendant 2 h à 200 000 x g et 8 °C dans un rotor à godet oscillant avec accélération et décélération lentes pour séparer les particules virales intactes des particules virales défectueuses.
   REMARQUE : Après centrifugation, plusieurs bandes blanches sont clairement visibles dans la solution de CsCl.
6. Retirez avec précaution les bandes des particules vides et la couche de débris cellulaires à l’aide de la pipette, et prélevez la bande la plus basse contenant le virus mature à l’aide d’une seringue de 2 ml.
7. Transvasez la suspension virale recueillie dans une cassette de dialyse MWCO de 20 K et dialysez dans un tampon de dialyse contenant 10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂ et 2 % de glycérol (pH 8,0) pendant la nuit à 4 °C.
   1. Remplacez le tampon de dialyse contenant 10 mM de Tris-Cl, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl₂ et 5 % de glycérol (pH 8,0) le lendemain et dialysez 5 h à 4 °C.
   2. Prélever les particules virales dialysées à l’aide d’une seringue de 2 ml. Préparez plusieurs aliquotes des petits volumes souhaités (20-200 μL) et stockez le virus purifié à -80 °C.
      REMARQUE : Le titre de particules du virus purifié peut être déterminé en mesurant le contenu de l’ADN génomique, et le titre d’infectiosité peut être déterminé sur les cellules HEK293 en comptant les cellules GFP positives avec le test de dilution limitative.

7. Identification du génome d’un adénovirus recombinant par digestion enzymatique de restriction

1. Infectez une monocouche confluente de 80 à 90 % de cellules HEK293 cultivée dans un flacon T-25 avec un adénovirus recombinant. Incuber pendant 2 h à 37 °C. Remplacer le milieu de culture par du DMEM frais contenant 2 % de FBS.
2. Retirer le surnageant de culture et extraire l’ADN génomique viral à l’aide de la méthode de Hirt modifiée décrite à l’étape 1.3 lorsque l’EPC se produit dans les 2 à 3 jours.
3. Digérer l’ADN génomique de l’adénovirus recombinant avec les enzymes indiquées, et analyser sur électrophorèse sur gel d’agarose. Le plasmide adénoviral recombinant a servi de témoin.

Résultats

La stratégie de construction d’un clone infectieux de HAdV-7 est illustrée aux figures 1 et 2. Deux plasmides clones infectieux ont été sélectionnés au hasard et identifiés par BstZ17 I, BamH I et EcoR V, respectivement. Les résultats ont montré que les fragments étaient cohérents avec la taille attendue (Figure 2A), indiquant que les plasmides étaient correctement construits. Des foye...

Discussion

Différents adénovirus ont différents tropismes tissulaires, et la prévalence de l’immunité préexistante de l’hôte contre différents adénovirus peut fluctuer intensément chez les êtres humains²⁴, ce qui suscite l’intérêt pour la construction de nouveaux vecteurs adénoviraux pour la thérapie génique ou le développement de vaccins. Cependant, la mise en place d’un nouveau système de vecteurs adénoviraux reste lourde pour les laboratoires g?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-150-C	Storage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubes	Corning	430790	Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishes	Corning	430599	Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassette	ThermoFisher Scientific	66005	Dialysis of virus
Acetic acid	Amresco	714	Extraction of DNA
Afl II	NEB	R0520	Digestion
Agarose	Takara	5260	Electrophoresis
Age I	NEB	R0552	Digestion
Asc I	NEB	R0558	Digestion
BamH I	NEB	R0136	Digestion
Benzonase Nuclease	Sigma	E8263-25KU	Purification of virus
BsrG I	NEB	R0575	Digestion
Cell lifter	Corning	3008	Scrape off the cells
CsCl	Sigma	C3032	Purification of virus
DNA gel recovery kit	Zymo	D4045	Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Cytiva	SH30022.01	HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cells	TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.	CB-104	Transformation of assembly product
EcoR V	NEB	R3195	Digestion
EDTA	Thermo Fisher Scientific	R3104	Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)	Cytiva	SV30208.02	HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kit	Zymo	D4065	Purification of DNA
Glycerol	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	G810575	Dialysis of virus
HEK293 cells	ATCC	CRL-1573	Amplification of virus
High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491	PCR
Hind III	NEB	R3104	Digestion
Kanamycin sulfate	Amresco	408	Selection of plasmid
Kpn I	NEB	R3142	Digestion
Lambda/HindIII DNA marker	Takara	3403	Electrophoresis
LB broth	BD	240230	LB plate for bacteria
LB medium	Solarbio Life Science	L1010	Medium for bacteria
MgCl2	Sigma	63068	Dialysis of virus
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall Legend Micro 21R	Extraction of DNA
NaCl	Sigma	S5886	Dialysis of virus
Nde I	NEB	R0111	Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621	DNA assembly
Nhe I	NEB	R0131	Digestion
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30256.01	Washing of cells
Pipette	Thermo Fisher Scientific	Matrix	Aspirate the medium
Plasmid Maxprep Kit	Vigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.	N001	Extraction of DNA
Plasmid Miniprep Kit	TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.	DP103	Extraction of DNA
Pme I	NEB	R0560	Digestion
Potassium acetate	Amresco	698	Extraction of DNA
Protease K	Thermo Fisher Scientific	AM2542	Extraction of DNA
pShuttle-CMV	Stratagene	240007	PCR template
RNase	Beyotime	D7089	Extraction of DNA
Sal I	NEB	R0138	Digestion
Sbf I	NEB	R3642	Digestion
SDS	Amresco	227	Extraction of DNA
Swinging-bucket rotor	HITACHI	S52ST	Purification of virus
T-25 cell flask	Corning	430639	Growth of HEK29E cells
T-75 cell flask	Corning	430641	Growth of HEK29E cells
Transfection reagent	Polyplus-transfection	114-15	Transfection
Transmission electron microscope	FEI	TECNAI 12	Obsevation of virus
Tris-HCl	Amresco	234	Dialysis of virus
Ultracentrifuge	HITACHI	Himac CS120GXII	Purification of virus