Un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents

Résumé

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus. Ce modèle à haut débit simule mieux les infections in vivo par rapport aux techniques de microbiologie conventionnelles et offre aux chercheurs une plateforme physiologiquement pertinente pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents.

Résumé

Le développement d’antimicrobiens est un processus coûteux avec des taux de réussite de plus en plus faibles, ce qui rend les investissements supplémentaires dans la recherche sur la découverte d’antimicrobiens moins attrayants. La découverte de médicaments antimicrobiens et leur commercialisation subséquente peuvent être rendues plus lucratives si une approche rapide et peu coûteuse peut être mise en œuvre au cours des étapes d’optimisation des pistes où les chercheurs ont un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Dans cet article, la configuration d’un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus est décrite, ce qui est simple, rentable, à haut débit et reproductible. La physiologie bactérienne dans le modèle imite que pendant l’infection, la prolifération bactérienne dépend de la capacité de l’agent pathogène à endommager le tissu. L’établissement de l’infection de la plaie est vérifié par une augmentation du nombre de bactéries viables par rapport à l’inoculum. Ce modèle peut être utilisé comme plateforme pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents à l’étape de l’optimisation des prospects. On peut soutenir que la disponibilité de ce modèle fournira aux chercheurs qui développent des antimicrobiens un modèle d’échec rapide et bon marché, ce qui contribuera à augmenter les taux de réussite dans les essais ultérieurs sur les animaux. Le modèle facilitera également la réduction et le perfectionnement de l’utilisation des animaux pour la recherche et, en fin de compte, permettra une application plus rapide et plus rentable de nouveaux antimicrobiens pour les infections de la peau et des tissus mous à la clinique.

Introduction

Les infections cutanées sont un problème mondial important, avec des coûts économiques importants pour les prestataires de soins de santé du monde entier. Le développement de la multirésistance aux médicaments et la formation de biofilms par des agents pathogènes jouent un rôle clé dans la prévalence des plaies non cicatrisantes 1,2,3,4. En conséquence, les infections de la peau et des tissus mous sont l’une des raisons les plus courantes d’hospitalisation prolongée et de réadmission ultérieure⁵. Les retards dans la cicatrisation des plaies sont coûteux pour le patient et les prestataires de soins de santé, certaines estimations suggérant qu’environ 6,5 millions de patients sont touchés chaque année aux États-Unis. Au Royaume-Uni, les infections cutanées et les complications associées entraînent environ 75 000 décès par an ^2,4,6.

Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène redoutable des plaies fréquemment isolé des plaies des patients ^2,7. Le taux d’émergence de la multirésistance a considérablement augmenté dans les années 2000. Pendant ce temps, environ 60% des infections bactériennes aiguës de la peau et de la structure de la peau étaient positives à la culture pour S. aureus¹ résistant à la méthicilline. Le nombre croissant de souches multirésistantes parmi les staphylocoques, et même d’autres agents pathogènes, au cours des 2 dernières décennies indique un besoin urgent de développement rapide d’antibiotiques avec de nouveaux modes d’action capables de surmonter la résistance.

Cependant, depuis le début des années 2000, les programmes de découverte d’antibiotiques ont été dominés par des temps de développement plus longs et de faibles taux de réussite, avec seulement 17% des nouveaux antibiotiques entrant dans les essais cliniques aux États-Unis obtenant l’approbation de mise sur le marché⁸. Cela suggère une disparité entre les résultats des tests in vitro d’antibiotiques émergents et leurs résultats cliniques. On peut soutenir que cette disparité est en grande partie due aux différences de physiologie bactérienne au cours des infections in vivo et au cours des méthodes microbiologiques conventionnelles lors de l’essai de l’efficacité des antibiotiques aux stades précliniques in vitro . Par conséquent, de nouvelles méthodes de laboratoire plus représentatives de la physiologie bactérienne pendant l’infection sont nécessaires pour améliorer les taux de réussite des programmes de découverte d’antibiotiques.

Les méthodes actuelles d’étude des infections cutanées comprennent des études sur des animaux vivants (p. ex. souris), des modèles cutanés ex vivo (p. ex. porcins) et des modèles cutanés issus de l’ingénierie tissulaire 3D (p. ex. humains)9,10,11,12. Les études sur des animaux vivants sont strictement réglementées et ont un débit relativement faible. Dans les modèles animaux, les blessures et les infections causent une détresse importante aux animaux et soulèvent des préoccupations éthiques. Les modèles de peau humaine, ex vivo ou tissulaires, nécessitent une approbation éthique, le respect de la législation locale et mondiale (la loi sur les tissus humains, la déclaration d’Helsinki), et il est difficile d’acquérir des tissus, certaines demandes prenant des années à satisfaire^13,14. Les deux types de modèles exigent beaucoup de main-d’œuvre et nécessitent une expertise importante pour assurer le succès expérimental. Certains modèles actuels d’infection cutanée ex vivo nécessitent des disques pré-inoculés et des additifs pour le lit de la plaie afin de permettre l’infection; Bien que ces modèles soient incroyablement utiles, il existe des limites dans le processus d’infection car les additifs limitent l’utilisation du lit de la plaie comme source de nutriments^10,15,16,17. Le modèle décrit dans cette étude n’utilise aucun additif au lit de la plaie, ce qui garantit que la pathologie de l’infection et le nombre de cellules viables sont le résultat de l’utilisation directe du lit de la plaie comme seule source de nutriments.

Compte tenu de la nécessité de nouvelles méthodes de laboratoire, un nouveau modèle ovin ex vivo à haut débit d’infections cutanées a été mis au point pour évaluer l’efficacité des antibiotiques émergents. Les études sur les infections cutanées font face à de nombreux défis - coûts élevés, préoccupations éthiques et modèles qui ne donnent pas une image complète^20,21. Les modèles ex vivo et les modèles 3D explant permettent une meilleure visualisation du processus de la maladie et de l’impact que les traitements peuvent avoir à partir d’un modèle plus pertinent sur le plan clinique. Ici, la configuration d’un nouveau modèle de peau ovine est décrite, qui est simple, reproductible et cliniquement pertinente et a un débit élevé. La peau d’ovins a été choisie car les moutons sont l’un des grands mammifères couramment utilisés pour modéliser les réponses aux infections in vivo. De plus, ils sont facilement disponibles dans les abattoirs, ce qui assure un approvisionnement régulier en peau pour la recherche, et leurs carcasses ne sont pas ébouillantées, ce qui garantit une bonne qualité des tissus. Cette étude a utilisé S. aureus comme agent pathogène exemplaire; Cependant, le modèle fonctionne bien avec d’autres micro-organismes.

Protocole

Les têtes d’agneau de l’abattoir R.B Elliott and Son ont été utilisées comme source d’échantillons de peau dans le cadre de ce projet. Tous les agneaux ont été abattus pour être consommés comme aliments. Au lieu de jeter les têtes, celles-ci ont été réutilisées pour la recherche. L’approbation éthique n’était pas requise puisque les tissus provenaient de déchets jetés dans les abattoirs.

1. Stérilisation

1. Désinfecter les pinces avant la collecte des têtes en prenant des pinces propres et en effectuant une stérilisation à la chaleur sèche dans une étuve à 200 °C pendant 1 h. Autoclaver toute la verrerie à 121 °C pendant 15 min avant utilisation.
2. Effectuer tous les travaux décrits dans une armoire de classe de microbiologie 2. Préparez tous les réactifs conformément aux instructions du fabricant.

2. Prélèvement d’échantillons

1. Dans l’abattoir, les agneaux de Swaledale étaient abattus par étourdissement à l’aide d’électricité ou d’un pistolet à tige captive et exsanguinés. Collecter les têtes d’agneau au plus tard 4 heures après l’abattage.

3. Préparation des têtes

1. Désinfecter la section frontale de l’agneau en versant environ 100 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale de la tête à l’aide d’une tondeuse électrique et laver la zone avec 200 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.
2. Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire pendant 35 min. Grattez délicatement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. S’il reste une quantité importante de poils, répétez le processus d’épilation.
3. Utilisez 200 mL supplémentaires de solution de dioxyde de chlore pour rincer la zone, puis rincez à l’éthanol et essuyez avec un rouleau bleu.
4. À l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de 8 mm, découper des échantillons de peau de 8 mm dans la zone préparée. Retirez les échantillons à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à 15 lames, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.
5. Placer les échantillons dans un pot stérile de 0,5 L rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis les transférer dans des tubes stériles de 50 mL avec 50 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm, inverser deux fois, et laisser stériliser pendant 30 minutes.
6. Retirez les échantillons de la solution de dioxyde de chlore et lavez-les en les plaçant dans un tube de 50 mL rempli de 40 mL de PBS stérile. Une fois lavé, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits.
7. Ajouter 350 μL de milieu préchauffé tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide. La composition du milieu est la suivante : milieu MK (milieu 199 avec sels de Hanks, L-glutamate et 1,75 mg/mL de bicarbonate de sodium) et F12 de Ham dans un rapport de 1:1, avec ajout de FBS (10 % v/v), EGF (10 ng/mL), insuline (5 μg/mL), pénicilline-streptomycine (100 U/mL) et amphotéricine B (2,5 μg/mL).
8. Sceller les plaques à 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz et incuber à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifié à 5% de CO₂ pendant 24 heures maximum.

4. Conservation des échantillons de peau

1. Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 μL de PBS stérile. Ajouter un milieu sans antibiotique à chaque échantillon et incuber à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5 % de CO₂ pendant 24 h pour éliminer les antibiotiques résiduels dans l’échantillon.
2. Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu sans antibiotique après 24 heures, jetez l’échantillon.

5. Préparation de l’inoculum

1. Préparez un tube de 50 ml avec 10 ml de bouillon de soya tryptique stérile. Prenez une plaque de gélose fraîche de S. aureus et utilisez un écouvillon pour transférer plusieurs colonies dans le bouillon. Incuber pendant 18 h à 37 °C à 150 tr/min.
2. Centrifuger à 4 000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de PBS stérile. Répétez deux fois pour assurer un lavage adéquat des cellules.
3. Ajuster l’inoculum à 0,6 OD₆₀₀ dans du PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum en effectuant une numération manuelle viable sur la plaque.

6. Infection des échantillons de peau

1. Préparez une nouvelle assiette de 24 puits avec 400 μL de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles.
2. Retirez le média des échantillons de peau, lavez avec 500 μL de PBS stérile et retirez le lavage. Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits.
3. Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de 4 mm pour faire un lambeau central de la plaie, perçant à une profondeur approximative de 1-2 mm. Ensuite, utilisez un scalpel à 15 lames et une pince à tissus allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie. La variabilité des dimensions de la plaie peut affecter l’issue de l’infection et les unités formant colonies (UFC).
4. Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 μL de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie. Ensuite, incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5% de CO₂ .
5. Si des périodes d’incubation plus longues sont nécessaires, retirez le média et remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber dans les mêmes conditions.

7. Détermination de la charge bactérienne

1. Retirez le média du fond des puits. À l’aide d’une pince stérile, transférer chaque échantillon dans un tube séparé de 50 mL rempli de 1 mL de PBS stérile.
2. Utilisez un homogénéisateur à pointe fine pour homogénéiser la surface de l’échantillon. Veillez à ce que le lit de la plaie soit en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur.
3. Homogénéiser chaque échantillon pendant 35 s à moyen/vif. L’homogénéisateur détache les bactéries de la surface du lit de la plaie pour permettre le dénombrement de la charge bactérienne.
4. Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon, à tour de rôle, avant le pipetage. Ceci afin de s’assurer que l’homogénat bactérien est mélangé.
5. Pipeter 20 μL d’homogénat vortex dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 μL de PBS stérile.
6. Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 x 10⁻⁷ et pipeter 10 μL de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose au soja tryptique en trois exemplaires.
7. Incuber la gélose pendant 18 h à 37 °C. Ensuite, comptez le nombre de colonies pour déterminer l’UFC pour chaque échantillon.

Résultats

L’identification d’une voie de stérilisation de la peau avant la mise en place du modèle d’infection de la plaie a été difficile. Le défi consistait à stériliser la peau sans endommager les différentes couches de la peau, ce qui peut avoir des conséquences imprévues sur l’issue de l’infection. Pour identifier un régime de stérilisation approprié, différents traitements ont été essayés pour des durées variables, comme indiqué dans le tableau 1. La contamination a été enregis...

Discussion

Le développement d’antimicrobiens est une entreprise importante mais coûteuse qui devrait coûter environ 1 milliard de dollars et prendre environ 15 ans. Plus de 90 % des découvertes de médicaments antimicrobiens et des études précliniques sur l’efficacité des médicaments antimicrobiens sont réalisées par des chercheurs universitaires et des petites et moyennes entreprises comptant généralement moins de 50 employés²². Ces équipes sont très contraintes financièrement, ce qui re...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX