Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

Résumé

Le protocole décrit l’obtention chirurgicale et la décellularisation ultérieure des lambeaux porcins vascularisés par perfusion du détergent au dodécylsulfate de sodium à travers le système vasculaire du lambeau dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Résumé

Les défauts des tissus mous de grand volume entraînent des déficits fonctionnels et peuvent avoir un impact considérable sur la qualité de vie du patient. Bien que la reconstruction chirurgicale puisse être réalisée par transfert de lambeau libre autologue ou allotransplantation composite vascularisée (AVC), de telles méthodes présentent également des inconvénients. Des problèmes tels que la morbidité sur le site donneur et la disponibilité des tissus limitent le transfert de lambeau libre autologue, tandis que l’immunosuppression est une limitation importante de l’ACV. Les tissus modifiés en chirurgie reconstructive utilisant des méthodes de décellularisation / recellularisation représentent une solution possible. Les tissus décellularisés sont générés à l’aide de méthodes qui éliminent le matériel cellulaire natif tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Ces échafaudages acellulaires peuvent ensuite être recellularisés avec des cellules spécifiques au receveur.

Ce protocole détaille les méthodes d’approvisionnement et de décellularisation utilisées pour réaliser des échafaudages acellulaires dans un modèle porcin. En outre, il fournit également une description de la conception et de la configuration du bioréacteur de perfusion. Les lambeaux comprennent l’épiploon porcin, le fascia lata tenseur et l’avant-bras radial. La décellularisation est réalisée par perfusion ex vivo de détergent à faible concentration de dodécylsulfate de sodium (SDS), suivie d’un traitement enzymatique par la DNase et d’une stérilisation à l’acide peracétique dans un bioréacteur de perfusion personnalisé.

Une décellularisation tissulaire réussie se caractérise par un aspect blanc-opaque des lambeaux macroscopiquement. Les lambeaux acellulaires montrent l’absence de noyaux sur la coloration histologique et une réduction significative de la teneur en ADN. Ce protocole peut être utilisé efficacement pour générer des échafaudages de tissus mous décellularisés avec une ECM préservée et une microarchitecture vasculaire. De tels échafaudages peuvent être utilisés dans des études de recellularisation ultérieures et ont le potentiel d’une traduction clinique en chirurgie reconstructive.

Introduction

Les lésions traumatiques et l’ablation de la tumeur peuvent entraîner des défauts des tissus mous importants et complexes. Ces défauts peuvent nuire à la qualité de vie du patient, entraîner une perte de fonction et entraîner une invalidité permanente. Bien que des techniques telles que le transfert de lambeau de tissu autologue aient été couramment pratiquées, les problèmes liés à la disponibilité du lambeau et à la morbidité au site donneur sont des limites majeures ^1,2,3. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une alternative prometteuse qui transfère les tissus composites, par exemple les muscles, la peau, le système vasculaire, en une seule unité aux receveurs. Cependant, le VCA nécessite une immunosuppression à long terme, ce qui entraîne une toxicité médicamenteuse, des infections opportunistes et des tumeurs malignes ^4,5,6.

Les échafaudages acellulaires issus de l’ingénierie tissulaire sont une solution potentielle à ces limitations⁷. Les échafaudages de tissus acellulaires peuvent être obtenus en utilisant des méthodes de décellularisation, qui éliminent le matériel cellulaire des tissus natifs tout en préservant la microarchitecture sous-jacente de la matrice extracellulaire (ECM). Contrairement à l’utilisation de matériaux synthétiques dans l’ingénierie tissulaire, l’utilisation d’échafaudages d’origine biologique offre un substrat ECM biomimétique qui permet la biocompatibilité et le potentiel de traduction clinique⁸. Après la décellularisation, la recellularisation subséquente d’échafaudages avec des cellules spécifiques au receveur peut alors générer des tissus vascularisés fonctionnels avec peu ou pas d’immunogénicité 9,10,11. En développant un protocole efficace pour obtenir des tissus acellulaires à l’aide de techniques de décellularisation par perfusion, un large éventail de types de tissus peut être conçu. À son tour, s’appuyer sur cette technique permet l’application à des tissus plus complexes. À ce jour, la décellularisation par perfusion des tissus mous vascularisés a été étudiée à l’aide de tissus vascularisés simples tels qu’un lambeau fasciocutané de pleine épaisseur chez le rongeur¹², le porcin 13 et le modèle humain 14, ainsi que le muscle squelettique du porc droit abdominis¹⁵. De plus, des tissus vascularisés complexes ont également été décellularisés par perfusion, comme l’ont démontré les modèles d’oreille porcine et humaine ^16,17 et les modèles de greffe de visage entier^{humain 18}.

Ici, le protocole décrit la décellularisation des lambeaux libres vascularisés à l’aide d’échafaudages ECM dérivés biologiquement. Nous présentons la décellularisation de trois lambeaux cliniquement pertinents: 1) l’épiploon, 2) le fascia lata tenseur et 3) l’avant-bras radial, qui sont tous représentatifs des lambeaux de cheval de trait utilisés couramment en chirurgie reconstructive et n’ont pas été examinés auparavant dans des études animales dans le contexte de la décellularisation tissulaire. Ces lambeaux issus de la bioingénierie offrent une plate-forme polyvalente et facilement disponible qui a le potentiel d’applications cliniques pour une utilisation dans le domaine de la réparation et de la reconstruction de grands défauts des tissus mous.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (CCIA) du Réseau universitaire de santé et sont effectuées conformément au protocole et aux procédures du Centre de ressources animales du Réseau universitaire de santé et aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Cinq porcs Yorkshire (35-50 kg; âgés d’environ 12 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. Fabrication de bioréacteurs de perfusion

1. Voir la figure 1 pour tous les composants utilisés dans le bioréacteur de perfusion. Pour la fabrication de la chambre à tissus, utilisez des contenants à pression en polypropylène disponibles dans le commerce avec des couvercles étanches à l’eau et à l’air contenant une doublure d’étanchéité en silicone. Assurez-vous que les conteneurs sont compatibles avec l’autoclave.
2. Percez deux 1/4 dans des trous le long des côtés du récipient et enfilez un court segment de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Un tube transportera le débit entrant perfusé et l’autre est pour l’écoulement.
3. Pour le tube d’entrée, fixez un connecteur Luer mâle à la partie interne qui sera utilisée pour se connecter à la canule tissulaire. Fixez un connecteur Luer femelle à l’extrémité externe du tube d’entrée qui sera utilisé pour se connecter à un robinet d’arrêt à trois voies.
4. Percez un seul trou de 1/4 de pouce sur le couvercle de la chambre et enfilez un autre segment court de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Ce tube servira de bouche d’aération.
5. Fabriquez le tube d’entrée et de sortie en mesurant environ 50 cm de tube en silicone revêtu de platine L/S-16. Raccordez une extrémité à un tube de pompe jaune à trois arrêts et l’autre extrémité à une pipette sérologique stérile de 2 mL pour transporter le perfusat des réservoirs de détergent dans la chambre du bioréacteur.
6. Autoclaver tous les composants (chambre et tubes) dans un emballage stérile emballé individuellement.

Figure 1 : Fabrication du bioréacteur de perfusion. Le bioréacteur de perfusion se compose (A) d’une chambre de tissu en polypropylène en plastique (B) avec des trous latéraux percés pour accueillir des tubes de perfusion avec un couvercle étanche à l’air et à l’eau. (C) Des robinets d’arrêt sont fixés aux tubes pour permettre la fixation du tube de perfusion qui transporte les agents de décellularisation du réservoir de détergent aux déchets en un seul passage. (D) Des cassettes de pompe compatibles sont utilisées pour connecter le tube à trois arrêts à la pompe péristaltique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparation des solutions de décellularisation

1. Préparer une solution saline normale héparinée (15 UI/mL) en diluant 1,5 mL de solution mère d’héparine à 1000 UI/mL dans 100 mL de solution saline normale.
2. Préparer une solution de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,05 % p/v en ajoutant lentement 9 g de poudre de SDS à 18 L d’eau distillée-désionisée autoclavée. Utilisez une bonbonne en polypropylène (PP) de grand volume pour accueillir la solution SDS. La solution est prête à l’emploi lorsqu’elle est complètement dissoute. Conserver à température ambiante.
3. Préparez la solution de travail DNase I. Tout d’abord, reconstituer la DNase I lyophilisée à une concentration mère de 10 mg/mL avec 5 mM de CaCl2 dans du dH₂O stérile. Conserver la solution mère reconstituée de DNase I sous forme d’aliquotes_{dans un} congélateur à −20 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée. Le jour de l’utilisation, diluer la DNase I avec du stock 1:100 avec Mg++ (1,29 mM) et Ca⁺⁺ (1,98 mM) dans du _dH2Ostérile jusqu’à une concentration finale de 0,1 mg/mL.
   REMARQUE: L’activité DNase se dégrade à moins d’être stockée gelée. Seule une solution de DNase fraîche doit être utilisée pour la digestion enzymatique de l’ADN à température ambiante.
4. Préparer 1x solution de PBS en diluant 10x PBS stock 1:10 avec de l’eau autoclavée stérile dans un volume final de 5 L dans une bonbonne en PP. Conserver à température ambiante.
5. Préparer 1% d’antibiotiques / antimycotiques (A / A) dans PBS. Diluer 100x antibiotiques/antimycotiques 1:100 avec 1x solution stérile de PBS jusqu’à un volume final de 1 L. Conserver à température ambiante.
6. Préparer de l’acide peracétique (AAP) à 0,1 % (v/v)/éthanol à 4 % (v/v) (EtOH) en ajoutant 3,13 mL d’AAP + 40 mL d’éthanol à 100 % + 956 mL de dH₂O stérile. Porter le volume final à 1 000 mL et conserver à température ambiante.

3. Acquisition de lambeaux porcins

Remarque : Il s’agit d’une procédure terminale. Un cochon a été utilisé pour se procurer les trois volets. Euthanasier l’animal sans cruauté après l’obtention de tous les volets.

1. Soins préopératoires
   1. Porcs rapides au moins 12 heures avant la chirurgie. Sédater les animaux avec de la kétamine (20 mg/kg intramusculaire, IM), de l’atropine (0,04 mg/kg IM) et du midazolam (0,3 mg/kg IM).
   2. Induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane à 5 % à travers un masque à un débit de 22-44 mL/kg/min pour l’insertion et l’intubation du cathéter périphérique. Maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane à 0,5 % à 2 % à 22-44 mL/kg/min. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en vérifiant la stabilité hémodynamique et notez l’absence de réflexes de retrait palpébral / pédale ou de tonus musculaire de la mâchoire pour indiquer un niveau approprié d’anesthésie administrée. Administrer une perfusion intraveineuse de rémifentanil (10-20 μg/kg/h) à débit continu pendant la chirurgie de l’analgésie.
   3. Intuber le porc avec un tube endotrachéal approprié (7-8 mm) et connecter le tube à un ventilateur réglé à un volume courant de 8 mL/kg, PEP de 5 cm H₂0,_FiO2 de 0,5 et fréquence respiratoire de 14.
   4. Insérez un cathéter d’angiocathe de 22 G dans la veine de l’oreille. Une fois l’accès intraveineux (IV) obtenu, infuser une solution saline normale chaude à 0,9 % à 5-10 mL/kg/h tout au long de la procédure pour maintenir la pression artérielle moyenne entre 60 mmHg et 90 mmHg.
   5. Surveillez en permanence la fréquence cardiaque, l’oxymétrie de pouls et le CO₂ en fin de marée. Évaluez la pression artérielle et la température corporelle toutes les 5 minutes.
   6. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie. Préparez tout le champ chirurgical avec de la povidone-iode. Drapez le champ chirurgical avec des serviettes stériles.
2. Rabat omental
   1. Placez le porc en décubitus dorsal et effectuez une laparotomie xypho-ombilicale.
   2. En entrant dans l’abdomen, mobiliser la céphalade de l’estomac pour visualiser le grand épiploon. Placez soigneusement l’épiploon dans le champ opératoire et identifiez les vaisseaux gastro-épiploïques qui courent le long de la plus grande courbure de l’estomac (Figure 2A).
   3. Commencez par l’aspect gauche de la plus grande courbure où l’artère gastro-épiploïque gauche rejoint l’artère splénique. À l’aide de ciseaux de ténotomie Stevens droits, squelettiser à la fois l’artère gastro-épiploïque gauche et la veine. Ligate divise ensuite les deux séparément à l’aide de liens chirurgicaux ou de clips.
   4. Continuez le long de la plus grande courbure de l’estomac de gauche à droite. Liguer et diviser les branches vasculaires courtes provenant de l’épiploon fournissant la plus grande courbure de l’estomac. Veillez à ne pas blesser le pédicule gastro-épiploïque principal de l’épiploon au cours de cette étape.
   5. Poursuivre la mobilisation du grand épiploon jusqu’à la jonction des vaisseaux gastro-épiploïques droits et de l’artère gastroduodénale rencontrée. Avec des clips ou des attaches, ligaturer puis diviser l’artère gastro-épiploïque droite et les veines séparément pour libérer le lambeau omental.
   6. Une fois libéré, l’épiploon peut être divisé le long du milieu en deux moitiés, chaque moitié étant accompagnée d’une artère et d’une veine gastro-épiploïques respectives. Cela permet l’acquisition de deux lambeaux libres omentaux d’une exploitation animale. Canuler individuellement les vaisseaux gastro-épiploïques avec une canule de 20-22 G puis fixer avec des attaches en soie 3-0.
   7. Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle gastro-épiploïque jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
3. Tenseur fascia lata lambeau
   REMARQUE : Le protocole est basé sur une description antérieure du lambeau du fascia lata tensoriel porcin par Haughey et ^al.19. La modification est apportée pour isoler uniquement la partie fasciale du lambeau tenseur fascia lata.
   1. Placez le porc en position de décubitus latéral et rasez bilatéralement tout le membre postérieur supérieur. Préparer et draper en utilisant les procédures stériles habituelles.
   2. Marquez la limite antérieure du lambeau avec une ligne s’étendant de l’épine iliaque supérieure antérieure (ASIS) vers la rotule latérale. L’emplacement du pédicule est à environ 6-8 cm de l’ASIS le long de cette ligne.
   3. Marquez une ligne postérieure parallèle à environ 8 cm à 10 cm de l’incision antérieure le long de l’axe du fémur pour inclure la largeur du lambeau. Marquez le bord distal du lambeau au niveau de la rotule latérale.
   4. Commencez la dissection à la marge distale à la rotule avec une incision aiguë de la peau à l’aide d’un scalpel. Approfondissez l’incision cutanée avec cautérisation à travers le tissu sous-cutané jusqu’à ce que le fascia recouvrant le fémur droit soit rencontré.
   5. Continuez les incisions cutanées vers le SIAS le long des limites antérieures et postérieures marquées décrites ci-dessus. Pour isoler le lambeau fascial seul, retirez le composant cutané sus-jacent de la couche fasciale sous-jacente. Liférer ou cautériser tout petit vaisseau perforateur sur la peau.
   6. Retournez au bord distal du lambeau et incisez le fascia profond pour permettre la mobilisation du muscle vastus lateralis sous-jacent. Mobiliser le fascia vers l’ASIS.
   7. Lors de la mobilisation, identifier le pédicule vasculaire émergeant entre les muscles vastus lateralis et rectus femoris (Figure 2B). Prenez soin d’éviter une traction excessive afin de ne pas blesser les vaisseaux pédiculaires.
   8. Disséquer l’aspect proximal de l’ASIS tout en protégeant le pédicule vasculaire. Disséquer jusqu’à ce que le volet soit suffisamment mobilisé autour de son pédicule.
   9. Tracez le pédicule vers les vaisseaux fémoraux profonds. Squelettiser à la fois l’artère fémorale circonflexe latérale et la veine alimentant le lambeau fascial. Ligate divise ensuite les deux vaisseaux à proximité où ils rejoignent les vaisseaux fémoraux profonds.
   10. Canuler les vaisseaux pédiculaires individuellement avec des angiocathéters de 20 G à 24 G, fixés par des attaches en soie 3-0. Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle du lambeau jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
4. Rabat radial de l’avant-bras
   REMARQUE : Le protocole ci-dessous est basé sur une description publiée du modèle de lambeau radial de l’avant-bras porcin par Khachatryan et ^al.20.
   1. Placez le porc sur la table d’opération en position de décubitus latéral. Placez le membre antérieur dépendant dans le champ opératoire.
   2. Marquez un lambeau d’environ 3 cm x 3 cm carré sur l’avant-bras radial. Tracez une ligne entre le point médian de la marge du lambeau proximal et la fosse antécubitale pour indiquer l’évolution approximative du pédicule de l’artère radiale. Confirmez le parcours artériel avec palpation.
      NOTE: Dans le modèle porcin, les vaisseaux radiaux sont situés relativement plus profondément que chez l’homme. Leur emplacement est entre le piston carpi radialis et brachioradialis.
   3. Inciser la peau à l’aide d’un scalpel à l’aspect distal avec une profondeur jusqu’au fascia antébrachial. Disséquer émoussé avec des ciseaux de ténotomie jusqu’à ce que l’artère radiale distale et ses deux veines comitantes soient rencontrées. Litruez l’artère et les veines avec des liens chirurgicaux individuellement et divisez.
   4. Continuez les incisions cutanées sur les marges radiales et ulnaires du carré cutané marqué. Mobiliser le lambeau de l’os radial sous-jacent avec une lame chirurgicale allant d’une direction radiale à une direction cubitale tout en soulevant le lambeau cutané proximale vers la fosse antécubitale.
      REMARQUE : Maintenir un plan de dissection sous-fascial afin de s’assurer que le pédicule de l’artère radiale reste associé à la couche cutanée sus-jacente.
   5. À la marge proximale, rétracter l’espace entre le brachioradial et le fléchisseur carpi radial à l’aide d’un rétracteur auto-retenant pour exposer l’artère radiale proximale et ses veines comitantes (Figure 2C).
   6. À l’aide de ciseaux de ténotomie, squelettiser l’artère radiale et les veines comitantes proximale à proximité de la fosse antécubitale où elles rejoignent respectivement l’artère brachiale et les veines. Disséquer les vaisseaux des tissus fibrogras environnants pour obtenir une longueur de pédicule suffisante d’environ 5-6 cm. Litérer et diviser l’artère et les veines séparément pour libérer le lambeau radial de l’avant-bras.
   7. Canuler les vaisseaux pédiculaires avec des angiocathéters de 20 G à 24 G, fixés avec des attaches en soie 3-0. Rincer la solution saline héparinée (15 UI/mL) dans la canule artérielle du lambeau jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé.
   8. Après l’obtention des volets, conserver les lambeaux dans une solution saline froide à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la décellularisation. Sous anesthésie profonde à l’isoflurane, euthanasier les animaux par injection intraveineuse de chlorure de potassium (100 mg/kg IV). Confirmer le décès par l’absence de signes vitaux.

Figure 2 : Acquisition de trois volets vascularisés porcins. (A) Aploon. Les artères gastro-épiploïques droite (i) et gauche (ii) sont canulées dans le lambeau omental (iii). (B) Tenseur fascia lata. Le pédicule du lambeau (iv) est la branche ascendante de l’artère circonflexe fémorale latérale (v). (C) Rabat radial de l’avant-bras. L’obtention du lambeau radial de l’avant-bras (vi) est basée sur l’artère radiale et la veine comitantes (vii) comme pédicule vasculaire (NOTE: Les champs ont été omis à des fins de démonstration). Barres d’échelle: 3 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Mise en place du système de décellularisation

1. Assembler la chambre tissulaire avec des lambeaux dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité à flux laminaire.
2. Fixez un robinet d’arrêt à trois voies aux orifices d’entrée et de sortie du bioréacteur. Fixez un filtre de 0,2 μm à l’orifice d’aération du couvercle de la chambre à tissu. Amorcez le tube d’entrée avec une solution saline héparinée stérile pour éliminer les bulles d’air.
3. Placez les volets dans la chambre. À l’aide d’hémostatiques stériles, connectez les volets au tube d’entrée à l’aide du connecteur Luer mâle. Vissez la canule artérielle respective de chaque volet sur le Luer mâle et assurez-vous d’une étanchéité étanche.
4. Rincer la solution saline héparinée à travers le robinet d’arrêt pour vérifier que le raccord Luer est exempt de fuites et que les volets peuvent être perfusés avec des signes d’écoulement veineux. Fermez le couvercle de la chambre de tissu.
5. Connectez le tube d’entrée avec un tube de pompe jaune à trois arrêts au robinet d’arrêt d’entrée de la chambre à tissus. Fixez également un transducteur de capteur de pression en ligne au robinet d’arrêt à trois voies d’entrée pour permettre la surveillance de la pression de perfusion.
6. Allumez la pompe péristaltique d’entrée. Sur l’écran initial, passez à la troisième languette à l’aide de la touche fléchée pour régler l’ID du tube sur 1,85 mm. Ensuite, passez au deuxième onglet pour définir le taux de perfusion. Débit d’entrée comme mode de livraison et réglé sur 2 mL/min. Assurez-vous que la direction de l’écoulement est correcte telle qu’affichée à l’écran. Chargez le tube de pompe à trois arrêts sur la pompe péristaltique à l’aide d’une cassette compatible.
7. Répétez la procédure pour la pompe péristaltique à débit sortant comme ci-dessus. Réglez le réglage de la pompe de sortie sur une vitesse de 4 mL/min. Connectez le tube de sortie avec un tube de pompe jaune à trois arrêts au robinet d’arrêt de sortie de la chambre à tissu. Chargez le tube de pompe à trois arrêts sur la pompe péristaltique à l’aide d’une cassette compatible. Démarrez le débit des deux pompes en appuyant sur le bouton d’alimentation .
   REMARQUE: Le débit plus élevé de la pompe de sortie est une mesure de sécurité cruciale pour éviter le débordement de la chambre de tissu, en veillant à ce que le débit sortant de la chambre dépasse toujours le débit entrant au cours de la décellularisation. L’ensemble de la configuration de décellularisation assemblée est illustré à la figure 3.

Figure 3 : Système assemblé de décellularisation par perfusion. (A) Schéma du système de décellularisation de perfusion. Le tube d’entrée transporte le perfusat du réservoir de détergent dans la chambre à tissu en un seul passage avec surveillance du capteur de pression. Le tube de sortie élimine activement le perfusat de la chambre à tissus dans le conteneur à déchets. Les flèches noires indiquent la direction de l’écoulement de perfusion. Une pompe péristaltique est utilisée avec la pompe gauche pour contrôler l’apport entrant. L’écoulement est activement éliminé à l’aide d’une deuxième pompe péristaltique à travers le tube respectif. Figure créée avec BioRender.com. (B) Photographie du système de décellularisation de perfusion assemblé sur la paillasse avec la pompe péristaltique d’entrée (i) reliée aux chambres tissulaires (ii) puis la pompe péristaltique de sortie (iii). La pression de perfusat d’entrée est surveillée avec un capteur de pression en ligne (iv) avant d’entrer dans la chambre à tissus. Ici, trois volets sont décellularisés en parallèle. Les réservoirs de détergent et de déchets sont sous la paillasse et ne sont pas photographiés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Décellularisation des lambeaux porcins

1. Effectuez toutes les étapes suivantes pour la décellularisation de la perfusion à température ambiante. Pour un résumé des taux et des durées de perfusion, voir le tableau 1. Commencer la perfusion de solution saline héparinée à 2 mL/min à l’aide d’une pompe péristaltique et perfuser les lambeaux avec une solution saline héparinée dans la chambre tissulaire pendant 15 minutes pour éliminer les caillots sanguins retenus.
2. À la fin de la perfusion saline héparinisée, aspirer la solution saline résiduelle dans la chambre à tissus. Remplir la chambre tissulaire avec environ 500 mL de solution de décellularisation SDS pour submerger suffisamment le lambeau.
3. Transférer le tube d’entrée dans la solution de décellularisation SDS et perfuser le tissu à 2 mL/min. La durée de la perfusion varie en fonction du lambeau ; perfuser SDS pendant 2 jours pour l’épiploon, 3 jours pour le fascia tenseur et 5 jours pour le lambeau fascio-cutané radial de l’avant-bras.
4. Une fois la décellularisation de la FDS terminée, aspirer le perfusat SDS existant contenu dans la chambre tissulaire. Transférer le tube d’entrée dans 1x solution PBS et perfuser les volets pendant 1 jour à 2 mL/min.
5. Retirez la solution PBS précédente et transférez le tube d’entrée dans la solution de travail DNase. Perfuser pendant 2 h à 2 mL/min. Retirez la solution de DNase de la chambre tissulaire et placez le tube d’entrée dans 1x solution PBS. Immerger les tissus avec 1x solution de PBS dans la chambre et perfuser 1x solution de PBS pendant 1 jour à 2 mL/min.
6. Stérilisez les lambeaux avec une solution PAA/EtOH. Transférer le tube d’entrée dans le PAA/EtOH dans une solution dH_2Oet immerger les tissus dans la même solution. Perfuse PAA/EtOH à 2 mL/min pendant 3 h. Une fois la stérilisation PAA/EtOH terminée, débranchez le tube des robinets d’arrêt à trois voies.
7. Retirer les lambeaux en utilisant une technique aseptique et placer les instruments stériles dans du PBS contenant 1% d’antibiotiques/antimycotiques (A/A). Immerger les lambeaux avec PBS + 1% A/A pendant 15 min dans deux lavages séparés pour neutraliser complètement l’acide résiduel. Gardez les lambeaux dans PBS + 1% A/A à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la recellularisation.
8. Vérifier la stérilité des échafaudages en effectuant une culture par écouvillonnage sur des plaques de gélose et examiner la croissance microbienne. Inoculer les plaques de gélose avec des écouvillons prélevés sur chaque surface de rabat. Culture des plaques de gélose à 37 °C jusqu’à 2 semaines. La stérilité est démontrée par l’absence de croissance de colonies microbiennes.

Tableau 1 : Résumé des paramètres du protocole de perfusion-décellularisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

6. Évaluation de la décellularisation

1. À l’aide d’une biopsie à l’emporte-pièce, prélever des échantillons de 3 mm à 10 mm d’épaisseur à partir des volets.
2. Pour l’histologie, fixer les biopsies dans des cassettes histologiques dans du formol tamponné normal pendant 24 h à température ambiante.
3. Lavez les cassettes de biopsie dans de l’eau ou du PBS pendant 15 minutes, puis placez-les dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le traitement des tissus. Traiter les cassettes dans un processeur de tissus selon les protocoles standard.
4. Incorporer les biopsies dans de la paraffine, en laissant la cire se solidifier pendant 10-15 minutes sur une plaque froide. Section de blocs de paraffine sur un microtome à 5 μm d’épaisseur. Colorer les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) selon les protocoles standard. Imagez les lames tissulaires avec la microscopie optique.
5. Pour la quantification de la teneur en ADN, obtenir le poids sec des biopsies tissulaires après séchage des tissus pendant une nuit dans une étuve à 60 °C. Digérer les échantillons dans un tampon d’extraction de papaïne à 65 °C pendant une nuit. Centrifuger les échantillons digérés à 10 000 x g et transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge frais. Doser la teneur en ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial conformément aux instructions du fabricant.

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Résultats

Ce protocole de décellularisation des lambeaux porcins vascularisés repose sur la perfusion d’un détergent à base ionique, SDS, à travers le système vasculaire du volet dans un bioréacteur de perfusion personnalisé. Avant la décellularisation, trois lambeaux vascularisés dans un modèle porcin ont été achetés et canulés en fonction de leurs principaux vaisseaux d’alimentation. Les volets ont été immédiatement rincés après l’approvisionnement afin de maintenir un système vasculaire perfusable bre...

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Discussion

Le protocole proposé utilise la perfusion de SDS à faible concentration pour décellulariser une gamme de lambeaux d’origine porcine. Avec cette procédure, l’épiploon acellulaire, le fascia lata tenseur et les lambeaux radiaux de l’avant-bras peuvent être décellularisés avec succès en utilisant un protocole qui favorise les SDS à faible concentration. Des expériences d’optimisation préliminaires ont déterminé que la SDS à une faible concentration (0,05%) entre 2 jours et 5 jours est capable d’éli...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore Acrodisk Filter	VWR	CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline)	Baxter	JF7123
20 L Polypropylene Carboy	Cole-Parmer	RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie	Covidien	LS639
3-way Stopcock	Cole-Parmer	UZ-30600-04
Adson Forceps	Fine Science Tools	11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X	Wisent	450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
BD Angiocath 20-Gauge	VWR	BD381134
BD Angiocath 22-Gauge	VWR	BD381123
BD Angiocath 24-Gauge	VWR	BD381112
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C4901	DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)	Invitrogen	P7589
DPBS, 10X	Wisent	311-415-CL	without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL	Leo Pharma A/S	453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing	Cole-Parmer	RK-96450-40	Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump	Cole-Parmer	78001-78
Ismatec Tubing Cassettes	Cole-Parmer	RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
LB Agar Lennox	Bioshop Canada	LBL406.500	Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing	Cole-Parmer	RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Monopolar Cautery Pencil	Valleylab	E2100
Normal Buffered Formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
N°11 scalpel blade	Swann Morton	303
Papain from papaya latex	Sigma-Aldrich	P3125
Peracetic Acid	Sigma-Aldrich	269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID	McMaster-Carr	5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors	McMaster-Carr	5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs	McMaster-Carr	51525K143	Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets	McMaster-Carr	51525K293	Female Luer
Punch Biopsy Tool	Integra Miltex	3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Povidone-Iodine, 10%	Rougier	833133
Serological Pipet, 2mL	Fisher Science	13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers	SnapLock	142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder	Sigma-Aldrich	L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small	Teleflex	001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight	B. Braun	BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set	Edwards Lifesciences	PX260