La technique du peel-blot : une méthode de préparation d’échantillons cryo-EM pour séparer les couches uniques des échantillons biologiques multicouches ou concentrés

Résumé

La technique peel-blot est une méthode de préparation de grille cryo-EM qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en couches uniques afin de réduire l’épaisseur, d’augmenter la concentration des échantillons et de faciliter le traitement des images.

Résumé

La technique de préparation de la grille cryo-EM par transfert peel-blot est une méthode de rétro-injection considérablement modifiée dans le but d’obtenir une réduction des couches d’échantillons multicouches. Cette élimination des couches avant la congélation peut aider à réduire l’épaisseur de l’échantillon à un niveau approprié pour la collecte de données cryo-EM, à améliorer la planéité de l’échantillon et à faciliter le traitement de l’image. La technique peel-blot permet de séparer les membranes multilamellaires en couches simples, les cristaux 2D stratifiés en cristaux individuels et les structures empilées en feuilles de protéines solubles à séparer également en couches uniques. L’épaisseur élevée de ces types d’échantillons pose souvent des problèmes insurmontables pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images cryo-EM, en particulier lorsque la platine du microscope doit être inclinée pour la collecte de données. De plus, des grilles de concentrations élevées de l’un de ces échantillons peuvent être préparées pour une collecte efficace des données, car la concentration de l’échantillon avant la préparation de la grille peut être augmentée et la technique du transfert de pelage ajustée pour aboutir à une distribution dense de l’échantillon à une seule couche.

Introduction

La technique peel-blot a été développée afin de séparer les cristaux bidimensionnels empilés de protéines membranaires en couches uniques afin d’obtenir des échantillons suffisamment minces pour la collecte de données cryo-EM 2D et 3D et de faciliter le traitement des images¹. Le protocole convient également à d’autres types d’échantillons multilamellaires ainsi qu’à l’obtention de concentrations élevées d’échantillons de l’un ou l’autre type d’échantillon sur la grille sans augmenter l’épaisseur en Z.

La réduction des couches d’échantillon en une seule couche est obtenue en appliquant une combinaison de pression capillaire et de forces de cisaillement dans un protocole qui étend considérablement et modifie la méthode de rétroinjection². Une première étape de buvard entraîne une prise en sandwich serrée et une adhérence au film de carbone et à une barre de grille de chaque côté de l’échantillon multicouche pendant le buvard sur submicron plutôt que la taille des pores du papier filtre de 20 à 25 μm dans la méthode de rétroinjection. La séparation, ou le pelage, d’une couche individuelle se produit lorsque l’on force la séparation des couches en sandwich une fois que la grille est pressée verticalement sur une goutte de tréhalose, forçant le film de carbone à s’éloigner de la barre de grille (Figure 1). Le repositionnement du film de carbone loin du point de contact d’origine avec la barre de grille se produit à l’étape suivante, lorsque la grille est à nouveau épongée sur du papier filtre submicronique. Le nombre d’itérations de ces étapes peut être optimisé pour des échantillons spécifiques. De plus, le protocole peut être utilisé pour augmenter les concentrations des échantillons tout en évitant l’agrégation en Z. En raison de la dépendance à l’adhérence à la barre de grille et au film de carbone ainsi que de la séparation forcée, cette approche peut ne pas convenir aux molécules très fragiles telles que certaines protéines et complexes protéiques délicats et / ou instables.

La technique du peel-blot ne nécessite ni équipement spécialisé ni fournitures coûteuses. L’applicabilité à des échantillons spécifiques nécessitera toutefois un examen attentif des paramètres biologiques. La décision est plus facile pour les cristaux 2D car un film de carbone est nécessaire pour assurer la planéité, mais la manipulation via la technique du peel-blot peut affecter l’intégrité biologique de l’échantillon ou l’ordre cristallin. L’adéquation de la technique peel-blot aux particules uniques est limitée et peut être testée pour celles qui nécessitent un film de carbone et sont stables à la manipulation. Les spécimens présentant des interactions biologiques critiques entre les couches peuvent ne pas convenir à la caractérisation à l’aide de la technique du peel-blot en raison de la perturbation de ces interactions.

La technique du peel-blot (« peel-blot ») est optimisée le plus rapidement par le test et le dépistage avec des échantillons négatifs ou non colorés par TEM à température ambiante. Une fois que le nombre optimal d’itérations peel-blot a été identifié, le temps nécessaire pour contrôler l’épaisseur avant la vitrification peut être déterminé.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Étapes de préparation pour la technique peel-blot

REMARQUE: La préparation nécessite que les éléments suivants soient placés les uns à côté des autres.

1. Empiler deux morceaux de papier filtre de 20 à 25 μm de taille pore (voir le tableau des matériaux).
2. Placez un film de paraffine de ~8 cm x 10 cm de long à côté du papier filtre avec le papier tourné vers le haut.
3. Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux autres morceaux de papier filtre #4 (Figure 1-1).
4. Positionnez la pince anti-capillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas. Ensuite, sélectionnez une grille à 600 mailles avec le côté lisse / brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.
5. Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés (~5 mm) pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 μL de solution de tréhalose à 4 % ~1-2 cm d’un côté court du film de paraffine et ~1 cm d’intervalle sur le film de paraffine.
6. Sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit contenant en mousse de polystyrène (voir Tableau des matériaux).
   ATTENTION : Recevez une formation sur la manipulation appropriée à l’aide de gants et d’un écran facial afin d’éviter les engelures.
7. Placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide et couvrez le récipient en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses.

2. Placer le film de carbone sur le réseau

1. Utilisez la pince Dumont #5 (voir Tableau des matériaux) pour faire flotter le film de carbone du mica en touchant un côté du mica à un léger angle vers le bas (~20°-40°) sur l’une des gouttes de solution de tréhalose et laissez lentement la tension de l’eau se soulever du film de carbone en déplaçant le mica vers le bas. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette.
2. Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.
3. Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle (~20°-30°) dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrée sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone (figure 1-2).
4. Gardez la grille dans la même orientation et abaissez-la lentement sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans rompre la tension superficielle de la goutte pour éliminer le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.

3. Séparation de cristaux 2D multicouches en couches simples

1. Faites pivoter les pinces anticapillaires (voir le tableau des matériaux) et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas (figure 1-3).
2. Pipeter 1,3 μL de l’échantillon dans le ménisque du tréhalose léger au-dessus de la grille. Pipeter la solution ~8-10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et échantillonner des deux côtés de la grille.
3. Pendant l’incubation de la solution pendant 1 min, pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 μL de solution de tréhalose sur le film de paraffine.
4. Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone tourné vers le haut.
5. Utilisez les pinces anticapillaires pour presser la grille sur le papier filtre submicronique (Figure 1-4). Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendre 3 secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 μL de solution de tréhalose (Figure 1-5).
   REMARQUE: Répétez cette étape plusieurs fois pour les échantillons fortement empilés, ou la grille est préparée pour la vitrification dans les étapes suivantes.
6. Épongez la grille sur les deux feuilles de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre (Figure 1-6). Après environ 13 s, selon l’humidité et le tampon d’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez la grille dans le récipient cryo-EM grid ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données.
   REMARQUE: Afin d’optimiser rapidement le protocole, tachez négativement la grille pelée à cette étape plutôt que de la plonger dans de l’azote liquide. Colorer négativement l’échantillon en appliquant 3 μL d’acétate d’uranyle à 1% sur la grille, incuber la grille pendant 30 s et l’éponger avec un morceau déchiré de papier filtre de 20 à 25 μm de la taille des pores. Les grilles de cristaux 2D vitrifiés dans du tréhalose, du tanin ou du glucose sont régulièrement plongées à la main pour la vitrification car le tréhalose, le tanin et le glucose empêchent la formation de glace cristalline à des taux utilisés pour plonger à la main².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Une expérience réussie de transfert de pelage aboutira à des couches uniques d’échantillons à des concentrations souvent élevées. Il faut s’attendre à ce que certaines régions de la plupart des carrés de la grille contiennent encore plusieurs couches, en particulier à moins d’itérations des étapes de transfert de pelage. La majorité des carrés de grille, cependant, contiendront de vastes régions de couches simples comme observé pour les cristaux 2D de leucotriènes_C4 synthase humaine (Fi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le peel-blot est une méthode puissante pour surmonter l’empilement et l’épaisseur de cristaux 2D multicouches et d’échantillons similaires pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images. Une décision sur l’utilisation du peel-blot sera basée sur les paramètres biologiques de l’échantillon et devra également être évaluée une fois qu’un modèle 3D cryo-EM sera disponible. L’importance biologique des contacts et la flexibilité potentielle des régions de contact seront particuliè...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.