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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué à certains aptamères qui se lient uniquement aux virus infectieux et non aux virus qui ont été rendus non infectieux par une méthode de désinfection ou à tout autre virus similaire. Cela ouvre la possibilité de déterminer le statut d’infectiosité dans les tests portables et rapides.

Résumé

Les infections virales ont un impact majeur sur la société; La plupart des méthodes de détection ont des difficultés à déterminer si un virus détecté est infectieux, ce qui entraîne des retards dans le traitement et une propagation ultérieure du virus. Le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité d’échantillons cliniques ou environnementaux permettra de relever ce défi non relevé. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virus infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux par les méthodes de désinfection. Ici, nous décrivons un protocole pour sélectionner des aptamères capables de distinguer les virus infectieux des virus non infectieux en utilisant l’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX). Nous profitons de deux fonctionnalités de SELEX. Tout d’abord, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes, telles que les virus non infectieux ou d’autres virus similaires, en utilisant la contre-sélection. De plus, le virus entier peut être utilisé comme cible pour SELEX, au lieu d’une protéine de surface virale, par exemple. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans avoir besoin de perturber le virus. Cette méthode permet ainsi d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de surface des agents pathogènes, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance.

Introduction

Les infections virales ont d’énormes répercussions économiques et sociétales dans le monde entier, comme l’a montré de plus en plus la récente pandémie de COVID-19. Un diagnostic rapide et précis est primordial dans le traitement des infections virales tout en prévenant la propagation des virus aux personnes en bonne santé. Bien que de nombreuses méthodes de détection de virus aient été développées, telles que les tests PCR1,2 et les tests inmunoassays3, la plupart des méthodes actuellement utilisées ne sont pas en mesure de déterminer si le virus détecté est réellement infectieux ou non. En effet, la présence de composants du virus seuls, tels que l’acide nucléique viral ou les protéines, n’indique pas que le virus infectieux intact est présent, et les niveaux de ces biomarqueurs ont montré une faible corrélation avec l’infectiosité 4,5,6. Par exemple, l’ARN viral, couramment utilisé pour les tests actuels de dépistage de la COVID-19 basés sur la PCR, présente des niveaux très faibles dans les premiers stades de l’infection lorsque le patient est contagieux, tandis que le taux d’ARN est souvent encore très élevé lorsque les patients se sont rétablis de l’infection et ne sont plus contagieux 7,8. Les biomarqueurs de protéines virales ou d’antigènes suivent une tendance similaire, mais apparaissent généralement encore plus tard que l’ARN viral et sont donc encore moins prédictifs de l’infectabilité 6,9. Pour remédier à cette limitation, certaines méthodes permettant d’informer sur l’état d’infectiosité du virus ont été développées, mais sont basées sur des techniques de microbiologie de culture cellulaire qui nécessitent beaucoup de temps (jours ou semaines) pour obtenir des résultats 4,10. Ainsi, le développement de nouveaux capteurs capables d’informer sur l’infectabilité des échantillons cliniques ou environnementaux peut éviter les retards dans le traitement et la propagation du virus. Cependant, très peu de méthodes peuvent obtenir des molécules de détection capables de reconnaître un virion infectieux intact et de le différencier du même virus qui a été rendu non infectieux.

Dans ce contexte, les aptamères sont particulièrement bien adaptés en tant qu’outil biomoléculaire unique11,12,13,14. Les aptamères sont de courtes molécules d’ADN ou d’ARN simple brin avec une séquence nucléotidique spécifique qui leur permet de former une conformation 3D spécifique pour reconnaître une cible à haute affinité et sélectivité15,16. Ils sont obtenus par un processus de sélection combinatoire appelé évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX), également connu sous le nom de sélection in vitro, qui est réalisé dans des tubes à essai avec une grande bibliothèque aléatoire d’échantillonnage d’ADN de 10 14-10 15 séquences17,18,19. À chaque cycle de ce processus itératif, le pool d’ADN est d’abord soumis à une pression de sélection par incubation avec la cible dans les conditions souhaitées. Toutes les séquences qui ne sont pas liées à la cible sont ensuite supprimées, ne laissant derrière elles que les quelques séquences capables de se lier dans les conditions données. Enfin, les séquences qui ont été sélectionnées à l’étape précédente sont amplifiées par PCR, enrichissant la population du pool avec les séquences fonctionnelles souhaitées pour le prochain tour de sélection, et le processus est répété. Lorsque l’activité du pool de sélection atteint un plateau (généralement après 8-15 tours), la bibliothèque est analysée par séquençage de l’ADN pour identifier les séquences gagnantes présentant la plus grande affinité.

SELEX présente des avantages uniques qui peuvent être exploités pour obtenir une sélectivité accrue par rapport à d’autres cibles similaires20,21, telles que l’état d’infectiosité du virus 22. Tout d’abord, une grande variété de différents types de cibles peuvent être utilisées pour la sélection, des petites molécules et protéines aux agents pathogènes entiers et aux cellules16. Ainsi, pour obtenir un aptamère qui se lie à un virus infectieux, un virus intact peut être utilisé comme cible, au lieu d’une protéine de surface virale19. Le virus entier SELEX permet de sélectionner des aptamères qui se lient spécifiquement à l’état natif du virus, sans qu’il soit nécessaire de perturber le virus. Deuxièmement, SELEX peut être conçu sur mesure pour éliminer les cibles concurrentes 21,23, telles que d’autres virus similaires ou des virus inactivés non infectieux, en utilisant des étapes de contre-sélection à chaque tour de sélection22. Au cours des étapes de contre-sélection, le pool d’ADN est exposé à des cibles pour lesquelles la liaison n’est pas souhaitée, et toutes les séquences qui se lient sont rejetées.

Dans ce travail, nous fournissons un protocole qui peut généralement être appliqué pour sélectionner des aptamères qui se lient à un virus infectieux, mais pas au même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière ou à un autre virus apparenté. Cette méthode permet d’obtenir des agents de reconnaissance en fonction des différences fonctionnelles de la surface du virus, qui n’ont pas besoin d’être connues à l’avance, et offre ainsi un avantage supplémentaire pour la détection d’agents pathogènes nouvellement apparus ou de maladies peu étudiées.

Protocole

1. Préparation des réactifs et des tampons

  1. Préparer 10x Tris-borate EDTA (10x TBE) en ajoutant 0,9 M Tris-base, 0,9 M d’acide borique, 20 mM EDTA (sel disodique) et eau désionisée jusqu’à un volume final de 1 L. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous.
  2. Préparer une solution mère de polyacrylamide dénaturant à 10% comme suit. Dans une bouteille en verre de 250 mL, ajouter 120 g d’urée (8 M), 25 mL de 10x TBE, 62,5 mL de solution d’acrylamide/bisacrylamide à 40 % (29:1) et suffisamment d’eau distillée pour atteindre le volume final de 250 mL. Mélanger jusqu’à ce que tous les composants soient dissous.
  3. Préparez le tampon de chargement 2x comme suit. Dans un tube de 50 mL, ajouter 21,636 g d’urée (8 M), 1,675 g d’EDTA (1 mM) et 4,5 mL de 10x TBE. Remplir à 45 ml d’eau distillée et mélanger jusqu’à dissolution de tous les composants.
  4. Préparer le tampon d’extraction en ajoutant 100 mM d’acétate de sodium et 1 mM d’EDTA (sel disodique). Réglez le pH final à 5.
  5. Préparer les solutions de précipitation à l’éthanol comme suit. Préparer l’acétate de sodium 3 M, ajuster à pH 5,2 et conserver à 4 °C. Préparer de l’éthanol à 70 % v/v et conserver à -20 °C. Préparer l’éthanol à 100 % et le conserver à -20 °C.
  6. Préparer 500 mL de tampon SELEX contenant 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2 et 0,5 mM CaCl2. Ajuster à pH 7,4. Préparer 100 mL de tampon SELEX avec 8 M d’urée en ajoutant 1x PBS, 2,5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2 et 8 M d’urée. Ajuster à pH 7,4.
    REMARQUE: Le choix du tampon SELEX est essentiel pour s’assurer que l’aptamère sélectionné fonctionnera sur l’échantillon final où l’aptamère sera appliqué. Par exemple, des aptamères spécifiques au SARS-CoV-2 seront utilisés dans des échantillons biologiques (p. ex. écouvillonnages de salive ou de nasopharynges). Il est donc important de choisir des concentrations ioniques, un pH et un tampon qui imitent étroitement ces conditions dans les échantillons biologiques prévus.
  7. Préparez le tampon de reliure et de lavage comme suit. Dans un tube de 50 mL, préparer 5 mM de Tris, 0,5 mM d’EDTA (sel disodique) et 2 M de NaCl. Ajuster à pH 7,5.

2. Conception et synthèse de la banque d’ADN et des amorces

  1. Concevez la bibliothèque initiale d’ADNss et les amorces avec les critères suivants (voir le Tableau 1 pour un exemple de bibliothèque d’ADNss et d’ensemble d’amorces, où N indique une position nucléotidique aléatoire).
    1. Assurez-vous que la bibliothèque contient une région aléatoire centrale de 35 à 60 nucléotides flanquée de deux séquences constantes aux extrémités 3' et 5' qui agissent comme des régions d’amorce pour l’amplification. Une longueur de bibliothèque typique est de 45 nucléotides aléatoires.
    2. Assurez-vous que l’amorce inverse contient une modification de la biotine pour séparer l’ADNs des produits de PCR double brin amplifiés à l’aide de billes enrobées de streptavidine pendant le processus de sélection in vitro .
  2. Achetez les oligos d’ADN de sources commerciales avec purification de dessalage standard. Purifier la bibliothèque d’ADNss et les amorces par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 10 % (dPAGE), suivie d’une précipitation à l’éthanol selon les procédures standard24.
    ATTENTION : L’acrylamide monomère et le bromure d’éthidium sont des produits chimiques dangereux (cancérogènes pour l’homme), alors utilisez un équipement de protection individuelle approprié (blouses de laboratoire, gants et protection oculaire) lorsque vous effectuez le PAGE. Dans la mesure du possible, évitez d’utiliser du bromure d’éthidium et remplacez-le par un colorant plus sûr.
    REMARQUE: Il est possible de commander les oligos avec une purification HPLC pour éviter d’effectuer cette étape de purification, bien que cela n’éliminera pas les oligonucléotides courts aussi efficacement.
  3. Ajouter de l’eau exempte de nucléases pour remettre en suspension l’ADNss après la précipitation de l’éthanol jusqu’à la concentration désirée (100 μM). Déterminer la concentration de la bibliothèque d’ADNss et des amorces par absorption UV à λ = 260 nm. Conserver à -20 °C.
  4. Achetez une amorce inverse non modifiée à utiliser pour la préparation de bibliothèques de séquençage à haut débit et la quantification qPCR.

3. Échantillons de virus infectieux et non infectieux

MISE EN GARDE : Les échantillons de virus infectieux et non infectieux sont des échantillons de niveau de biosécurité 2 (BSL2) qui nécessitent des précautions supplémentaires pour être manipulés de façon sécuritaire et appropriée. Toutes les étapes de la procédure qui comprennent ces échantillons doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité, ou la solution virale doit être dans un contenant scellé (p. ex. tubes en plastique recouverts d’un bouchon).

  1. Procurez-vous une solution mère de virus infectieux ou préparez-les, en suivant le protocole correspondant à chaque virus. Les pseudovirus SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 et H5N1 utilisés ici ont été fournis par le laboratoire du professeur Lijun Rong (UIC) dans un tampon PBS et ont été préparés conformément aux protocolesrapportés 22,25,26.
    REMARQUE : Pour les virus qui nécessitent des installations de niveau de biosécurité 3 pour manipuler le virus infectieux intact, il est possible de travailler avec des pseudovirus. Un virus pseudotypé est généré à partir d’un lentivirus (VIH) qui affiche les protéines de surface du virus dans l’enveloppe virale, et imite donc étroitement la surface et le mécanisme d’entrée du virus, mais est défectueux dans la réplication virale continue.
  2. Procurez-vous une solution mère de virus non infectieuse ou préparez-la en suivant la procédure de désinfection. Le stock de pseudovirus SARS-CoV-2 inactivé par UV (p-SARS-CoV-2) utilisé ici a été fourni par le laboratoire du professeur Rong (UIC) dans le tampon PBS, et le protocole précédemment rapporté a été utilisé pour l’inactivation UV22.
    REMARQUE : Si possible, effectuez un test pour tester l’infectiosité du virus afin de vous assurer qu’il a été complètement inactivé.
  3. Quantifier les stocks de virus
    1. Quantifier le virus à l’aide d’un dosage de plaque selon les procédures standard27,28,29. Ce test permet non seulement de quantifier le virus, mais indique également l’état d’infectiosité du virus, confirmant la concentration du virus infectieux.
    2. Pour les pseudovirus ou les virus pour lesquels il n’existe pas de test sur plaque, quantifier le virus à l’aide d’une trousse ELISA quantitative sur lentivirus disponible dans le commerce.
    3. Préparer 1 x 108 copies/ml de solution mère pour p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 et p-H5N1. Séparer chaque solution mère dans des aliquotes contenant 50 μL chacune et conserver à -80 °C. Décongeler une nouvelle partie aliquote avant chaque expérience.

4. Sélection in vitro ou procédé SELEX : premier tour

REMARQUE: Pour toutes les étapes utilisant le virus infectieux, travaillez dans une armoire BSL2.

  1. Dénaturez la bibliothèque ssDNA. Prélever 10 μL de 100 μM de la bibliothèque ssDNA (1 nmol) et mélanger avec 240 μL de tampon SELEX. Chauffer à 95 °C pendant 15 min dans un bain sec, puis placer le tube sur de la glace pendant 15 min.
  2. Incuber la bibliothèque d’ADNss avec le virus infectieux (étape de sélection positive) comme suit. Mélanger 250 μL de la bibliothèque d’ADNss dans le tampon SELEX de l’étape 4.1 avec 50 μL de virus infectieux (1 x 108 copies/mL). Incuber pendant 2 h à température ambiante.
  3. Bloquez les sites non spécifiques dans les filtres centrifugeuses comme suit. En attendant l’étape 4.2, préparez les filtres à centrifuger pour les étapes suivantes.
    1. Ajouter 400 μL de séquence T20 de 1 mM (tableau 1) à chaque filtre à centrifuger de 0,5 mL qui sera utilisé - un filtre à centrifuger avec une coupure de 100 kDa et un avec une coupure de 10 kDa.
    2. Incuber pendant 30 min à température ambiante et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min pour éliminer la solution T20 dans le filtre. Lavez 3x avec le tampon SELEX pour éliminer les séquences T20 en excès.
  4. Lavez les séquences non liées comme suit. Ajouter le mélange incubé à l’étape 4.2 dans le filtre à centrifuger bloqué de 100 kDa et centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min. Laver 3x, en ajoutant 400 μL de tampon SELEX et en centrifugeant à 14 000 x g pendant 10 min. Conservez la fraction dans le filtre et jetez l’écoulement.
  5. Séquences liées à élute comme décrit ci-dessous.
    1. Changez le tube de collecte du filtre à centrifuger et ajoutez 300 μL de tampon SELEX contenant 8 M d’urée au filtre à centrifuger à l’étape 4.4. Chauffer le filtre à centrifuger à 95 °C pendant 15 min dans un bain sec, puis centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min.
    2. Recueillir la fraction qui a traversé le filtre contenant les séquences éluées. Répétez encore trois fois. Travaillez dans une armoire BSL2 et lavez tous les matériaux avec 10% d’eau de Javel pour inactiver le virus avant de jeter les matériaux.
  6. Concentrer et dessaler comme suit. Ajouter la solution recueillie en 4.5 à un filtre centrifugeuse bloqué de 10 kDa. Centrifuger à 14 000 x g pendant 15 min. Jetez la fraction qui a traversé le filtre.
    REMARQUE : Comme les virus sont retenus et inactivés avec 8 M d’urée dans le filtre à l’étape précédente, cette étape et les suivantes n’ont pas besoin d’être effectuées dans l’enceinte de biosécurité. Cette procédure doit être répétée si un tube centrifuge de 0,5 mL est utilisé jusqu’à ce que toute la solution soit recueillie comme à l’étape 4.5, 1,2 mL circule à travers le filtre.
  7. Laver 3x avec 300 μL de tampon SELEX pour éliminer l’urée par centrifugation à 14 000 x g pendant 15 min. Jetez la fraction qui a traversé le filtre. Récupérez la solution dans le filtre en la retournant dans un tube de collecte propre et en centrifugeant pendant 5 min.
  8. Mesurer le volume final de la solution récupérée à partir de 4.7 à l’aide d’une pipette dans un tube en plastique. Cette solution est nommée R ia, où i correspond au nombre rond. Typiquement, des volumes compris entre 30 μL et 50 μL sont obtenus. Prélever 1 μL de l’ADNs élué pour quantifier la quantité d’ADN par qPCR.
    NOTE: Il s’agit d’un point de pause possible, où l’échantillon R1peut être maintenu à -20 ° C pour continuer à un autre moment.
  9. Effectuez l’amplification PCR comme décrit ci-dessous.
    1. Au premier tour, prenez 90% de l’échantillon R1comme modèle de PCR. Dans les tours suivants, prendre 60% du volume total à l’étape 4.8 pour effectuer la PCR et stocker l’autre fraction à -20 °C.
    2. Mettre en place une réaction PCR de 50 μL avec les éléments suivants ayant la concentration finale spécifiée : 1x tampon de réaction PCR, 200 μM dNTP, 10 μL de matrice d’ADN (R 1échantillon a), 200 nM chaque amorce et 1,25 U polymérase (2,5 U/μL stock).
    3. Optimisez les conditions de PCR, y compris le nombre de cycles et la température de recuit pour chaque ensemble d’amorces et de bibliothèque d’ADNss. Évitez d’utiliser trop de cycles, ce qui produira des sous-produits de PCR indésirables tels que les primer-dimères. Testez différentes températures de recuit en fonction de la température de fusion des apprêts.
    4. Exécutez la PCR en utilisant des conditions optimisées à 95 °C pendant 5 min, suivies de 18 cycles de 1 min à 95 °C, 30 s à 52 °C et 1 min à 72 °C, avec une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 10 min, pour obtenir le pool dsDNA.
      REMARQUE: Il s’agit d’un autre point de pause possible, où le produit PCR peut être maintenu à -20 ° C pour continuer à un autre moment.
  10. Récupérer l’ADNss à l’aide de billes magnétiques modifiées par la streptavidine.
    1. Prenez 80% du produit PCR. Conserver la fraction restante à -20 °C.
    2. Diviser le produit de PCR en aliquotes de 50 μL et les ajouter à des tubes de microfuge contenant 50 μL de billes magnétiques modifiées par la streptavidine (Mo). Incuber pendant 30 minutes avec une légère agitation (par exemple, utiliser un agitateur rotatif) à température ambiante. Ensuite, placez le tube microfuge sur le rack magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage (il doit s’agir d’une solution claire).
    3. Laver en ajoutant 200 μL de tampon de liaison et de lavage au tube. Retirez le tube du rack magnétique, tapotez le tube et remettez en suspension le MB jusqu’à obtenir une solution homogène par pipetage. Replacez le tube de microfuge sur le rack magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage. Répétez cette étape de lavage deux fois.
    4. Une fois le lavage terminé, remettre le MB en suspension dans un total de 100 μL de tampon SELEX et chauffer la solution à 95 °C pendant 10 min. Placez immédiatement le tube dans le rack magnétique avant que le tube ne refroidisse et prenez le surnageant contenant le pool d’ADNss. Répétez cette étape de récupération, en ajoutant 50 μL de tampon SELEX.
  11. Mesurer le volume final de la fraction récupérée à partir de 4.10 à l’aide d’une pipette. Cette fraction est nommée R ix, où i correspond au nombre rond. En général, on obtient des volumes compris entre 140 et 150 μL. Prendre 1 μL deR1x pour quantifier la quantité d’ADN par qPCR.

5. Tours de sélection ultérieurs

  1. Dénaturez le pool ssDNA. Prélever 60% de l’échantillonR1x et mélanger avec 50 μL de tampon SELEX. Chauffer à 95 °C pendant 15 min dans un bain sec. Placez le tube sur de la glace pendant 15 min.
  2. Incuber le pool d’ADNss avec le virus non infectieux et d’autres virus interférents potentiels (étape de contre-sélection). Mélanger le pool d’ADNss dénaturé dans le tampon SELEX de 5,1 avec 50 μL de chaque virus (5 x 109 copies/mL; p. ex. p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 et p-H5N1 non infectieux). Incuber pendant 1 h à température ambiante.
  3. Bloquez les sites non spécifiques dans les filtres à centrifugeuses. En attendant l’étape 5.2., préparez les filtres à centrifuger pour les étapes suivantes. En règle générale, utilisez deux filtres à centrifugeuses, l’un avec une coupure de 100 kDa et l’autre avec une coupure de 10 kDa. Suivez la même procédure qu’au point 4.3.
  4. Lavez les séquences liées aux virus non ciblés. Ajouter le mélange incubé à l’étape 5.2 dans un filtre centrifugeuse bloqué de 100 kDa. Centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min et récupérer la fraction qui circule dans le filtre à centrifugation. Laver 2x, en ajoutant 100 μL de tampon SELEX et en centrifugeant à 14 000 x g pendant 10 min. Conservez la fraction qui a traversé le filtre.
  5. Incuber le pool d’ADNss avec le virus infectieux (étape de sélection positive). Prélever les 300 μL de fraction de l’étape 5.4 et mélanger avec 50 μL du virus infectieux (1 x 108 copies/mL). Incuber pendant 2 h à température ambiante. Suivez les étapes 4.4 à 4.11.

6. Suivi du processus SELEX

REMARQUE: Pour surveiller l’enrichissement du pool, qPCR est utilisé de deux manières. Tout d’abord, par quantification absolue, il est possible de tester l’enrichissement des groupements (rendement d’élution). Deuxièmement, en surveillant la courbe de fonte, la diversité des bassins (convergence des espèces aptamères) peut être évaluée30.

  1. Effectuer tous les tests qPCR avec un volume de réaction de 10 μL dans des plaques à 96 puits conçues pour la qPCR.
  2. Préparer un mélange qPCR standard contenant 5 μL de mélange maître, 0,3 μL de 500 nM de chaque amorce non étiquetée, 3,4 μL de H2O et 1 μL de matrice d’ADN.
    1. Préparer les dilutions de la bibliothèque d’ADNss purifiée (étape 2.3) pour exécuter la courbe étalon.
    2. Diluer les échantillons d’ADN pour que leur concentration corresponde à la courbe standard. Pour les échantillons de Ria, ajouter 1 μL de l’échantillon sans dilution et 1 μL de dilution 1:10 au mélange qPCR. Pour les échantillons Rix, inclure des dilutions de 1:10 ou 1:100.
  3. Exécutez qPCR en définissant le protocole suivant. Tout d’abord, réglez une étape initiale de dénaturation à 98 °C pendant 2 min. Ensuite, régler 40 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 5 s et recuit et extension à 52 °C pendant 10 s. Enfin, définissez une analyse de la courbe de fusion de 65 à 95 °C. Déterminez les valeurs du cycle de seuil (Ct) par analyse de seuil automatisée.
  4. À l’aide de la courbe standard, quantifier la quantité d’ADNssdans les échantillons R i a et Rix.
  5. Calculer le rendement d’élution comme la quantité d’ADN lié (nombre de moles dans R i a) divisée par la quantité d’ADN initial (nombre de moles dans Ri-1x). Tracer le rendement d’élution en fonction du nombre rond pour voir si un enrichissement au cours des cycles est observé.
  6. Tracez les courbes de fusion pour différents tours. On s’attend à un passage à des températures de fusion plus élevées dans le pic proche de 75/85 °C à mesure que le nombre de cartouches augmente. Cela signifie que la diversité du bassin diminue.

7. Séquençage à haut débit

  1. Consultez l’installation de séquençage à haut débit pour connaître les types et les échelles de séquençage disponibles, ce qui déterminera la méthode de préparation de la bibliothèque.
    NOTE: Cette décision tiendra compte à la fois de la longueur des pools à séquencer (y compris les amorces) et du nombre de pools à soumettre (généralement, viser au moins 1 x 105-10 6 séquences par pool). Si une échelle de séquençage particulière ne peut pas lire toute la longueur du pool, le séquençage d’extrémité appariée peut être utilisé pour lire à partir des deux extrémités de la séquence, par opposition à une extrémité qui lit à partir d’une seule extrémité.
  2. Choisir un kit approprié disponible dans le commerce en fonction du type de séquençage, en consultation avec l’installation de séquençage. Préparez plusieurs pools de cycles de sélection représentant un enrichissement élevé, moyen et faible, ainsi que le pool final, à l’aide d’une paire d’index différente dans les adaptateurs pour chaque pool qui a permis l’analyse de l’échantillon de tous les cycles à l’aide d’une seule voie.
    REMARQUE: L’amplification PCR peut également être utilisée pour incorporer les adaptateurs et les index requis pour le séquençage à haut débit, mais cela coûte généralement des coûts similaires à ceux des kits commerciaux et ne fonctionne pas mieux.
    1. Effectuez la préparation de la bibliothèque en suivant ces étapes : réparation finale de l’ADN fragmenté, ligature de l’adaptateur et amplification PCR pour produire les bibliothèques finales.
    2. Purifiez le produit PCR avec des billes de nettoyage d’ADN magnétique en suivant les instructions du fabricant.
    3. Quantifier l’ADN à l’aide d’un kit de quantification basé sur la fluorescence. Évitez d’utiliser des méthodes moins précises, telles que les mesures UV de petit volume.
    4. Mélangez des quantités approximativement égales (en fonction de la quantité d’ADN, et non du volume) de chaque bibliothèque de pool contenant des index spécifiques.
    5. Vérifiez la qualité de la bibliothèque finale avec la quantification qPCR et un analyseur de fragments d’ADN. Cette étape est souvent effectuée par l’installation de séquençage.
      REMARQUE : Le personnel de l’installation de séquençage peut fournir des renseignements utiles sur la façon de préparer la bibliothèque et sur les contrôles de qualité suggérés. Discuter avec eux est nécessaire avant de préparer les bibliothèques.
  3. Envoyez la bibliothèque finale préparée à l’installation de séquençage en fonction de leurs besoins.

8. Analyse de séquençage

  1. La plupart des logiciels disponibles pour l’analyse de séquençage sont conçus pour être exécutés sur la ligne de commande sur un système d’exploitation Linux. Pour les petits ensembles de données, configurez le système d’exploitation Linux souhaité et installez les programmes requis sur un ordinateur personnel; pour les ensembles de données plus volumineux, l’analyse HTS est exécutée sur des ressources de calcul haute performance ou des superordinateurs (recommandé).
    REMARQUE : L’accès et la formation seront nécessaires pour utiliser les ressources de calcul de haute performance, ce qui peut prendre un certain temps à obtenir. En outre, une connaissance de base de l’utilisation de la ligne de commande UNIX sera requise. De nombreuses ressources gratuites sur l’utilisation de base de la ligne de commande sont disponibles en ligne, et les ressources informatiques fourniront probablement des informations supplémentaires pour l’utilisation de leurs systèmes.
  2. Accédez aux fichiers de séquencement, généralement dans un format de fichier FastQ compressé, en utilisant les informations fournies par la fonction de séquençage.
    1. Utilisez un client FTP pour transférer les fichiers vers votre propre ordinateur et/ou la ressource de calcul haute performance. De nombreux programmes d’analyse de séquences peuvent utiliser directement des fichiers compressés, alors gardez les fichiers compressés, si possible, pour limiter leur taille de fichier (les lectures de grandes séquences de séquences de 50 M + peuvent occuper jusqu’à 100 Go + d’espace de fichier lorsqu’elles sont décompressées).
    2. Si les fichiers de séquence doivent être décompressés, utilisez la fonction gzip qui est standard sur la plupart des installations Linux. Obtenez des informations supplémentaires sur gzip et ses options à partir du manuel installé en tapant « man gzip » sur la ligne de commande.
  3. Nettoyez les séquences avant l’analyse en démultiplexant, en supprimant les cartes de séquencement, en supprimant les lectures de mauvaise qualité et en incluant les lectures dans les directions avant et arrière.
    1. Utilisez le programme FastQC31 après chacune des étapes suivantes pour obtenir des informations de base sur le contrôle de la qualité des séquences afin d’évaluer l’efficacité de chaque étape de nettoyage.
    2. Démultiplexez les séquences pour séparer toutes les séquences d’un seul fichier de lecture dans les différents pools en fonction des index inclus dans les adaptateurs de séquencement. Cette étape est souvent effectuée par l’installation de séquençage, qui doit être consultée car la procédure exacte dépendra de la machine de séquençage utilisée.
    3. Supprimez les cartes de séquencement à l’aide du programme de ligne de commande, Cutadapt32. Utilisez les amorces de sélection (plutôt que les adaptateurs de séquencement) comme entrée en mode Carte liée. Utilisez l’option --discard-untrimmed pour ignorer les séquences qui ne contiennent pas les amorces de sélection.
    4. Définissez les options du taux d’erreur maximal correspondant aux cartes et de la longueur minimale et maximale des séquences à accepter. Si vous utilisez des lectures de fin appariées, entrez les paramètres spécifiques disponibles et donnez les fichiers de séquençage Read 1 et Read 2. Définissez des paramètres supplémentaires si nécessaire en vous référant au manuel Cutadapt32.
      REMARQUE : La ligature des adaptateurs de séquençage aux pools est indépendante de la direction et incorporera environ 50 % des séquences dans le sens avant et 50 % dans le sens inverse. Pour éviter de perdre les 50% de séquences dans le sens inverse, Cutadapt peut être exécuté une deuxième fois en utilisant le complément inverse des amorces de sélection comme entrées.
    5. (Facultatif) Si le séquençage d’extrémité appariée est utilisé, fusionnez les fichiers Read 1 et Read 2 avec le programme PEAR33.
    6. Utilisez le programme FASTX-Toolkit34 pour supprimer les séquences de faible qualité dont la qualité est inférieure à un certain seuil à n’importe quel nucléotide. Un seuil de qualité de 30 est un bon point de départ. Si la qualité globale est généralement bonne, cette étape peut être ignorée.
    7. Pour fusionner les fichiers de séquence dans le sens inverse avec ceux dans le sens avant, utilisez la fonction FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement sur les fichiers de sens inverse. Ensuite, utilisez le programme cat intégré (standard sur la plupart des installations Linux) pour fusionner les fichiers forward et reverse-complement - reverse en un seul fichier.
  4. Pour analyser l’enrichissement des séquences dans différents pools de sélection, utilisez la boîte à outils d’analyse FASTAptamer35.
    1. Utilisez FASTAptamer-Count pour compter le nombre de fois que chaque séquence apparaît. Ensuite, classez et triez les séquences par abondance. Le fichier de sortie de comptage est requis comme entrée pour tous les autres programmes FASTAptamer.
    2. Utilisez FASTAptamer-Clust pour regrouper toutes les séquences d’un fichier en groupes de séquences étroitement liées. Utilisez le paramètre « distance » pour définir le nombre de mutations mononucléotidiques ou indels autorisées à se regrouper en cluster.
      REMARQUE: Le programme FASTAptamer-Clust peut être très coûteux en calcul si un grand nombre de séquences uniques sont présentes (en particulier pour les premiers tours), ce qui peut prendre des jours, voire des semaines. Le paramètre de filtre de coupure peut être utilisé pour exclure les séquences de faible abondance du clustering. En général, il est bon de commencer avec un seuil plus élevé, tel que 10 ou 5 lectures par million (RPM) et de le diminuer si le programme se termine rapidement. Si les pools sont très hétérogènes, il peut ne pas être possible de regrouper les séquences dans un délai raisonnable.
    3. Utilisez FASTAptamer-Enrich pour calculer l’enrichissement de chaque séquence présente dans plus d’un tour de la sélection. Comparez le RPM de la séquence d’une population avec le RPM d’une autre. Utilisez le programme Enrich sur les fichiers Count ou Cluster. Le résultat est un fichier .tsv (valeurs séparées par des tabulations) qui peut être ouvert dans n’importe quel tableur pour une analyse plus approfondie et un tri facile.
      REMARQUE: Le programme FASTAptamer-Enrich peut également être très coûteux en calcul si un grand nombre de séquences uniques sont présentes. Le paramètre de filtre de coupure peut être utilisé pour exclure des séquences de faible abondance de la sortie afin d’éviter les fichiers trop volumineux pour être ouverts dans un tableur.
    4. (Facultatif) Si de nombreux pools sont trop hétérogènes (de nombreuses séquences uniques et peu de séquences en double), il peut ne pas être possible d’utiliser les programmes Clust ou Richify. Dans ce cas, effectuez une vérification manuelle de l’enrichissement à l’aide du fichier de sortie Count qui trie les séquences par abondance (la plus abondante en haut) et renomme l’identificateur de séquence pour inclure des informations importantes telles que RPM.
      1. Utilisez le programme Linux standard « head » sur les fichiers Count pour obtenir une liste des séquences les plus abondantes. Ensuite, utilisez le programme Linux standard « grep » pour rechercher chacune des séquences les plus abondantes dans les fichiers Count de tous les autres pools pertinents. S’il existe des correspondances, utilisez l’identificateur de séquence modifié pour déterminer le RPM dans ce pool, afin de construire manuellement les informations d’enrichissement.
        REMARQUE : Les scripts pour toutes les étapes d’analyse de séquençage se trouvent dans les fichiers de codage supplémentaires 1 à 11.

9. Validation et dosages de liaison des aptamères

  1. À partir des informations d’enrichissement obtenues par l’analyse des séquences, identifier les séquences aptamères candidates en fonction des séquences qui ont le plus d’enrichissement par rapport aux tours de sélection suivants et/ou les séquences les plus abondantes dans le tour de sélection final. Sélectionnez plusieurs séquences candidates différentes (au moins 10-20) pour des tests plus approfondis, car les plus enrichis ne sont pas nécessairement les aptamères les plus performants.
  2. Effectuer le dépistage initial des aptamères candidats à l’aide d’un test de liaison qui peut être effectué rapidement pour plusieurs échantillons. Un test de liaison par ultrafiltration sur colonne36 ou un test d’oligonucléotides enzymatiques (ELONA) sont de bonnes méthodes pour ce dépistage initial.
  3. Analyser la spécificité et l’affinité des séquences qui montrent la meilleure activité de liaison dès le criblage initial, à l’aide d’au moins deux tests de liaison indépendants (p. ex., MicroScale Thermophoresis (MST)37,38, Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay (ELONA)39, Surface plasmonresonance 40 ou biolayer interferometry (BLI)41).

Résultats

Étant donné que les aptamères d’ADN peuvent être obtenus à l’aide de SELEX dans un tube à essai15, cette stratégie SELEX a été soigneusement conçue pour inclure à la fois des étapes de sélection positive vers le virus infectieux intact et entier (c.-à-d. conserver les molécules d’ADN qui se lient au virus infectieux), ainsi que des étapes de contre-sélection pour le même virus qui a été rendu non infectieux par une méthode de désinfection particulière. en particulier ...

Discussion

SELEX permet non seulement l’identification d’aptamères à haute affinité, dans la gamme pM-nM 22,43,44,45, mais aussi avec une sélectivité élevée et accordable. En tirant parti de la contre-sélection, il est possible d’obtenir des aptamères présentant une sélectivité difficile. Par exemple, le groupe Li a démontré sa capacité à obtenir des séquences capables de différen...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Mme Laura M. Cooper et le Dr Lijun Rong de l’Université de l’Illinois à Chicago pour avoir fourni les échantillons de pseudovirus utilisés dans ce protocole (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), ainsi que le Dr Alvaro Hernandez et le Dr Chris Wright du Centre de biotechnologie Roy J. Carver de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign pour leur aide au séquençage à haut débit, et de nombreux membres du groupe Lu qui nous ont aidés avec des techniques de sélection in vitro et de caractérisation des aptamères. Ce travail a été soutenu par une subvention RAPID de la National Science Foundation (CBET 20-29215) et une subvention de démarrage de l’Institute for Sustainability, Energy, and Environment de l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign et de l’Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. remercie le PEW Latin American Fellowship pour son soutien financier. Nous remercions également la Fondation Robert A. Welch (subvention F-0020) pour son soutien au programme de recherche du groupe Lu à l’Université du Texas à Austin.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Ammonium persulfate (APS)BioRad1610700
100% EthanolSigma-AldrichE7023
1x PBS without calcium & magnesiumCorning21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBioRad1610146
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA clean-up beads - Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC501024cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMerckUFC510024cut-off 100 kDa
Boric AcidSigma-Aldrich100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction ModuleBioRad1851148
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection SystemBioRad1855201
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher65001streptavidin-modified magnetic beads - Section 4.9
EDTA disodium saltSigma-Aldrich324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma-AldrichT96611.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer KitTakara Bio USA, Inc.632200Lentivirus quantification kit - Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tubeThermo ScientificMR02
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, opticalBioRadMSB1001non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast GelsBioRad1658004EDU
Mini-PROTEAN Short PlatesBioRad1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated SpacersBioRad1653310
Molecular Biology Grade WaterLonza51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clearBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA PolymeraseNew England BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01High-troughput sequencing library preparation kit - Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety CabinetsLabconco4261
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32850fluorescence-based  dsDNA quantification  kit - Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sorvall Legend Micro 17R MicrocentrifugeThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-AldrichT1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8USA scientificAB1183PCR tubes
UreaSigma-AldrichU5128

Références

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