Procédé visuel sensible pour la détection de bactéries productrices de sulfure d’hydrogène

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour détecter les bactéries productrices de sulfure d’hydrogène avec un protocole modifié utilisé pour la précipitation du sulfure de bismuth (BS). Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.

Résumé

Le sulfure d’hydrogène (_H2S) est un gaz toxique produit par les bactéries dans la protéolyse des acides aminés et des protéines contenant du soufre qui joue un rôle important dans la santé humaine. Le test de production H₂S est l’un des tests d’identification biochimique bactérienne importants. Les méthodes traditionnelles sont non seulement fastidieuses et chronophages, mais aussi sujettes à l’inhibition de la croissance bactérienne en raison de l’effet toxique des sels de métaux lourds dans un milieu contenant du soufre, ce qui conduit souvent à des résultats négatifs. Ici, nous avons établi une méthode simple et sensible pour détecter_H2Sdans les bactéries. Cette méthode est une version modifiée de la précipitation du sulfure de bismuth (BS) qui utilise des plaques de microtitrage transparentes à 96 puits. La culture bactérienne a été combinée avec une solution de bismuth contenant de la L-cystéine et cultivée pendant 20 minutes, à la fin de laquelle un précipité noir a été observé. La limite de détection visuelle pour H 2 S était de_0,2mM. Sur la base du changement de couleur visuel, la détection simple, à haut débit et rapide des bactéries productrices de H₂S peut être réalisée. En résumé, cette méthode peut être utilisée pour identifier la production de_H2Schez les bactéries.

Introduction

Les bactéries productrices de sulfure d’hydrogène peuvent utiliser des acides aminés et des protéines contenant du soufre pour produire du sulfure d’hydrogène (H₂S). La production de H₂S se produit généralement dans les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae à Gram négatif et aussi chez les membres de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. et Shewanella spp.1. Ces bactéries ont la capacité de réduire le sulfate en sulfure d’hydrogène (_H2S) afin d’obtenir de l’énergie. Le sulfure d’hydrogène a été impliqué dans le développement de la résistance bactérienne aux médicaments. _H2Sprotège les bactéries de la toxicité des espèces réactives de l’oxygène (ROS), antagonisant ainsi l’effet antibactérien des antibiotiques ^2,3. H₂S a également un effet physiologique important dans le maintien de l’homéostasie. Aux niveaux supraphysiologiques, H₂S s’est avéré profondément toxique pour le corps. Dans le corps humain, H₂S a un autre rôle en tant que molécule de signalisation de gaz impliquée dans une variété de processus physiologiques et pathologiques. _H2Speut réguler la fonction systolique du cœur et joue un rôle physiologique important dans la relaxation des vaisseaux sanguins, l’inhibition du remodelage vasculaire, et la protection du myocarde ^4,5. _H2Sjoue également un rôle important dans la régulation du système nerveux et du tube digestif ^6,7. Il a été constaté que, lorsqu’elles sont exposées à des antibiotiques bactéricides, les bactéries produisent des espèces réactives mortelles de l’oxygène (ROS) entraînant la mort cellulaire 8,9,10,11.

En tant que test biochimique courant dans les cours de laboratoire de microbiologie, le test au sulfure d’hydrogène est une expérience importante dans l’identification des bactéries, en particulier des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae. À l’heure actuelle, le test de sulfure d’hydrogène est généralement effectué sur un grand nombre d’acides aminés contenant du soufre et un milieu d’acétate de plomb inoculé avec les bactéries à tester. Après une période d’incubation (2-3 jours), les résultats sont jugés en observant si le milieu de culture ou la bande de papier acétate de plomb est noirci en raison de la production d’acétate de plomb¹¹. Cependant, ces méthodes traditionnelles sont non seulement fastidieuses et chronophages, mais aussi sujettes à l’inhibition de la croissance bactérienne en raison de l’effet toxique des sels de métaux lourds dans un milieu contenant du soufre, ce qui conduit souvent à des résultats négatifs. Une méthode basée sur le bismuth a été établie pour la détection de H₂S^12,13. H₂S peut réagir avec le bismuth, formant une précipitation de sulfure de bismuth noir. Afin de mener une réforme pour ce test biochimique, une méthode simple et rapide sans effets secondaires sur la croissance bactérienne doit être établie. Ici, nous avons mis en place une méthode simple pour la détection des bactéries productrices de sulfure d’hydrogène cultivées dans un environnement in vitro en utilisant le sulfure de bismuth comme substrat dans un format de plaque de microtitrage à 96 puits.

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Protocole

1. Souches bactériennes

REMARQUE : Pour cette expérience, neuf souches standard ont été utilisées, dont Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris et Klebsiella pneumoniae (tableau 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa et Proteus vuigaris peuvent produire H₂S, comme indiqué dans la littérature précédente¹.

1. Préparation de la culture bactérienne
   1. Transférer une colonie bactérienne de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 et Klebsiella pneumoniae d’une boîte de gélose Luria-Bertani (LB) à 100 mL de milieu LB et culture à 37 °C pendant 12-16 h jusqu’à ce que la concentration bactérienne soit d’environ 1 x 10⁹ cellules/mL (comme indiqué par DO₆₀₀ = 1).
   2. Transférer une colonie bactérienne de Fusobacterium nucleatum et de Proteus vuigaris à partir de plaques de gélose au bouillon de soja trypticase (BST) à 100 mL de milieu BST et culture en anaérobiose à 37 °C pendant 24 h jusqu’à ce que la concentration bactérienne soit d’environ 1 x 10⁹ cellules/mL (comme indiqué par OD₆₀₀ = 1).

2. Essai de détection H₂S

1. Test de production de sulfure d’hydrogène
   1. Mélanger 100 μL de culture bactérienne avec 100 μL de solution de bismuth nouvellement préparée (pH 8,0; chlorure de bismuth (III) 10 mM, 0,4 M de triéthanolamine-HCl, 20 mM de pyridoxal 5-phosphate monohydraté, 20 mM d’EDTA et 40 mM de L-cystéine) dans les plaques de microtitrage à 96 puits et culture pendant 20 minutes à 37 °C. Pour chaque souche bactérienne, effectuer l’analyse en trois exemplaires.
   2. Après 20 min, vérifiez s’il y a un changement de couleur. Si la couleur de la solution passe du jaune clair au noir, cela indique que la bactérie est capable de produire H₂S. Répétez cette mesure 3x.
2. Sensibilité de la méthode
   1. Déterminer la sensibilité de la méthode en utilisant différentes concentrations d’hydrosulfure de sodium (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM et 0 mM, mélangé avec la solution BS ¹⁴.
   2. Déterminer la présence de HS−/S²⁻ en observant la formation d’un précipité BS noir. Évaluez la couleur des puits à l’aide d’une échelle visuelle allant de la production sans couleur (-) à la production de couleur noire la plus foncée (++++++).

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Résultats

Détection de bactéries productrices de sulfure d’hydrogène
L’efficacité de l’essai H₂S a été étudiée à l’aide de cultures pures de souches bactériennes sélectionnées, comme indiqué dans le tableau 1. Les résultats ont indiqué que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa et Proteus vuigaris peuvent produire H₂S avec précipité BS noir, tandis que Salmonella...

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Discussion

Le test de production de sulfure d’hydrogène est l’un des tests phénotypiques conventionnels pour l’identification et la différenciation des souches bactériennes. De nombreuses espèces bactériennes peuvent produire du sulfure d’hydrogène dans leur environnement naturel, comme l’eau aquatique. Ces espèces bactériennes comprennent Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., certaines souches de Klebsiella sp., Escherichia coli et ce...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8