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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit la bio-ingénierie des vésicules de membrane externe comme une plateforme vaccinale « Plug-and-Display », y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Résumé

Les nanoparticules biomimétiques obtenues à partir de bactéries ou de virus ont suscité un intérêt considérable dans la recherche et le développement de vaccins. Les vésicules de la membrane externe (OMV) sont principalement sécrétées par les bactéries à Gram négatif pendant la croissance moyenne, avec un diamètre nanométrique et une activité auto-adjuvante, ce qui peut être idéal pour l’administration du vaccin. Les OMV ont fonctionné comme un système d’administration à multiples facettes pour les protéines, les acides nucléiques et les petites molécules. Pour tirer pleinement parti des caractéristiques biologiques des OMV, les OMV dérivés d’Escherichia coli issus du bio-ingénierie ont été utilisés comme porteur et le domaine de liaison au récepteur du SARS-CoV-2 (RBD) comme antigène pour construire une plate-forme vaccinale « Plug-and-Display ». Les domaines SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) de Streptococcus pyogenes ont été appliqués aux OMV et RBD conjugués. Le gène de la cytolysine A (ClyA) a été traduit avec le gène SC en protéine de fusion après transfection plasmidique, laissant un site réactif à la surface des OMV. Après avoir mélangé RBD-ST dans un système tampon conventionnel pendant la nuit, une liaison covalente s’est formée entre les OMV et les RBD. Ainsi, un vaccin multivalent OMV a été obtenu. En les remplaçant par divers antigènes, la plateforme vaccinale OMVs peut afficher efficacement une variété d’antigènes hétérogènes, prévenant ainsi potentiellement rapidement les épidémies de maladies infectieuses. Ce protocole décrit une méthode précise pour construire la plateforme vaccinale OMV, y compris la production, la purification, la bioconjugaison et la caractérisation.

Introduction

En tant que plate-forme vaccinale potentielle, les vésicules de membrane externe (OMV) ont attiré de plus en plus d’attention ces dernières années 1,2. Les OMV, principalement sécrétées naturellement par les bactéries à Gram négatif3, sont des particules sphériques à l’échelle nanométrique composées d’une bicouche lipidique, généralement de la taille de 20-300nm4. Les OMV contiennent divers composants bactériens parentaux, y compris des antigènes bactériens et des profils moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), qui servent de potentialisateurs immunitaires solides5. Bénéficiant de leurs composants uniques, de la structure naturelle des vésicules et des grands sites de modification du génie génétique, les OMV ont été développés pour être utilisés dans de nombreux domaines biomédicaux, notamment les vaccins bactériens6, les adjuvants7, les médicaments d’immunothérapieanticancéreuse 8, les vecteurs d’administration de médicaments9 et les adhésifs antibactériens10.

La pandémie de SRAS-CoV-2, qui s’est propagée dans le monde entier depuis 2020, a fait payer un lourd tribut à la société mondiale. Le domaine de liaison au récepteur (RBD) dans la protéine de pointe (protéine S) peut se lier à l’enzyme 2 de conversion de l’angiotensine humaine (ACE2), qui intervient ensuite dans l’entrée du virus dans la cellule11,12,13. Ainsi, le TCSP semble être une cible de choix pour la découverte de vaccins14,15,16. Cependant, le TCSP monomère est peu immunogène et son faible poids moléculaire le rend difficile à reconnaître par le système immunitaire, de sorte que des adjuvants sont souvent nécessaires17.

Afin d’augmenter l’immunogénicité des TCSP, des OMV présentant des RBD polyvalents ont été construits. Les études existantes utilisant OMV pour afficher RBD fusionnent généralement RBD avec OMV pour être exprimé dans les bactéries18. Cependant, le TCSP est une protéine dérivée d’un virus, et l’expression procaryote est susceptible d’affecter son activité. Pour résoudre ce problème, le système SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), dérivé de Streptococcus pyogenes, a été utilisé pour former un isopeptide covalent avec OMV et RBD dans un système tampon conventionnel19. Le domaine SC a été exprimé avec la cytolysine A (ClyA) en tant que protéine de fusion par Escherichia coli issu de la bio-ingénierie, et ST a été exprimé avec RBD via le système d’expression cellulaire HEK293F. OMV-SC et RBD-ST ont été mélangés et incubés pendant la nuit. Après purification par ultracentrifugation ou chromatographie d’exclusion de taille (SEC), OMV-RBD a été obtenu.

Protocole

1. Construction plasmidique

  1. Insérer l’ADN codant pour la séquence SpyCatcher (dossier supplémentaire 1) dans un plasmide pThioHisA-ClyA résistant à l’ampicilline (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et Sal I pour construire le plasmide pThioHisA ClyA-SC à la suite d’un rapport publié précédemment20.
  2. Licater le gène de fusion SpyTag-RBD-Histag synthétisé (fichier supplémentaire 1) dans un plasmide pcDNA3.1 (voir le tableau des matériaux) entre les sites BamH I et EcoR I pour construire le plasmide pcDNA3.1 RBD-ST à la suite d’un rapport publié précédemment19.

2. Préparation de l’OMV-SC

  1. Effectuez la transformation ClyA-SC en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Ajouter 5 μL de solution plasmidique pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) à 50 μL de souche compétente BL21, souffler doucement et laisser refroidir sur la glace pendant 30 min.
    2. Placer la solution pendant 90 s au bain-marie à 42 °C, puis déposer immédiatement la solution mélangée sur de la glace pendant 3 min.
    3. Ajouter 500 μL de milieu LB à la suspension bactérienne et, après mélange, cultiver à 220 rpm à 37 °C pendant 1 h.
    4. Plaquer toute la transformation sur une plaque de gélose LB contenant de l’ampicilline (100 μg/mL, voir le tableau des matières) et la cultiver pendant une nuit à 37 °C.
      NOTE: Dans des expériences ultérieures, l’ampicilline a été maintenue à la même concentration dans le milieu. Sinon, cela peut entraîner une perte de plasmides dans les bactéries.
  2. Pour la production OMV-SC, effectuez les étapes ci-dessous.
    1. Isoler une seule colonie de la plaque (étape 2.1.4.) à 20 mL de milieu LB (résistant à l’ampicilline) et cultiver pendant une nuit à 220 rpm à 37 °C.
    2. Inoculer la solution bactérienne (à partir de l’étape 2.2.1.) dans un milieu de 2 L, culture à 220 tr/min, 37 °C pendant 5 h jusqu’au stade de croissance logarithmique (la DO600 nm est comprise entre 0,6 et 0,8).
    3. Lorsque la DO à 600 nm de la solution bactérienne atteint 0,6-0,8, ajouter l’isopropyl bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, voir le tableau des matériaux) pour obtenir la concentration finale de la solution bactérienne à 0,5 mM, puis la culture pendant la nuit à 220 rpm à 25 °C.
  3. Effectuez la purification OMV-SC.
    1. Centrifuger la solution bactérienne à 7 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
    2. Filtrer le surnageant avec un filtre à membrane de 0,22 μm, puis le concentrer à l’aide d’une membrane d’ultrafiltration de 100 kD ou d’une colonne de fibres creuses (voir le tableau des matériaux).
    3. Filtrer le concentré à travers un filtre à membrane de 0,22 μm, puis le centrifuger à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir le tableau des matériaux) et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
    4. Resuspendre les précipitations avec du PBS et les conserver à −80 °C. La solution peut maintenir la stabilité à long terme à −80 °C.

3. Préparation RBD-ST

  1. Effectuez la transfection RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Choisir un système d’expression eucaryote approprié (p. ex., HEK293F) et cultiver les cellules pendant une nuit à 130 rpm à 37 °C après la récupération.
    2. Ajouter 20 μL de solution cellulaire HEK293F dans le compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux), noter le nombre de cellules, ajuster la concentration à 1 x 106 cellules/mL, puis cultiver les cellules à 130 rpm à 37 °C pendant 4 h.
    3. Filtrer le plasmide RBD-ST à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et ajouter 300 μg de plasmides dans le milieu de culture cellulaire (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que le volume final atteigne 10 mL; agiter pendant 10 s.
    4. Chauffer l’IPE (1 mg/mL, voir le tableau des matières) à 65 °C au bain-marie, mélanger 0,7 mL de PEI avec 9,3 mL de milieu de culture cellulaire et agiter par intermittence pendant 10 s.
      REMARQUE: Ne pas agiter vigoureusement la solution. Sinon, les bulles résultantes peuvent affecter l’efficacité de la transfection.
    5. Ajouter la solution plasmidique à la solution de PEI, agiter le mélange par intermittence pendant 10 s et l’incuber à 37 °C pendant 15 min.
    6. Ajouter le mélange à 280 mL de milieu de culture cellulaire et cultiver à 130 rpm à 37 °C pendant 5 jours.
  2. Effectuer la purification RBD-ST.
    1. Centrifuger les cellules à 6 000 x g à 25 °C pendant 20 min et recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette.
    2. Remplir la colonne avec 2 mL d’agarose Ni-NTA (voir le tableau des matières) et la laver 3x avec 3x PBS.
    3. Ajouter l’imidazole (voir le tableau des matières) dans le surnageant cellulaire pour obtenir la concentration finale de 20 mM, et charger le surnageant cellulaire 2x.
    4. Ajouter 3 volumes de colonne (CV) de PBS contenant 20 mM d’imidazole pour le lavage et recueillir la fraction de lavage.
    5. élution de gradient avec 3 CV de PBS contenant des concentrations faibles à élevées (p. ex. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) d’imidazole; éluer 2x pour chaque concentration.
    6. Utilisez SDS-PAGE21 pour identifier le RBD-ST dans différents gradients de concentration.

4. Bioconjugaison et purification OMV-RBD

  1. Déterminer la concentration en protéines par la méthode BCA (voir le tableau des matériaux).
    1. Diluer en série la solution protéique standard de BSA de 2 mg/mL à 0,0625 mg/mL, diluer l’OMV-SC et le RBD-ST 10x purifiés, puis mélanger les solutions de travail BCA A et B (fournies dans la trousse de dosage) dans un rapport de 50:1 (v/v).
    2. Ajouter une solution de protéines diluées (25 μL/puits) et mélanger avec une solution de travail BCA (200 μL/puits); incuber à 37 °C pendant 30 min.
    3. Mesurer l’absorbance (DO) à 562 nm de chaque puits et calculer la concentration en protéines à partir de la courbe standard22.
  2. Effectuer la bioconjugaison de l’OMV-SC et du RBD-ST en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Mélanger OMV-SC et RBD-ST dans PBS à un rapport de 40:1 (p/p).
    2. Tourner verticalement pour mélanger le mélange pendant la nuit à 15 rpm à 4 °C.
      REMARQUE: Différents antigènes peuvent réagir dans des proportions différentes. On pourrait essayer différents rapports de réaction en fonction des caractéristiques de l’antigène.
  3. Vérifiez l’efficacité de la réaction.
    1. Préparer 10 μL d’OMV-SC, RBD-ST et le produit de réaction (étape 4.2.). Ajouter 2,5 μL de tampon de chargement 5x (voir le tableau des matières) et chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min. Charger les échantillons dans le gel (10 μL/puits). Effectuer une électrophorèse à 60 V pendant 20 min et changer la condition à 120 V pendant 1 h.
    2. Transférer la protéine du gel aux membranes de transfert Western en PVDF (voir le tableau des matériaux) à 100 V pendant 70 min.
    3. Mettre la membrane dans du lait en poudre écrémé à 5 % / TBST et agiter pendant 1 h. Ensuite, laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage avec agitation.
    4. Mettre la membrane dans un anticorps His-Tag/TBST à 0,1 % (voir le tableau des matières) et agiter pendant 1 h, puis laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage en secouant.
    5. Mettre la membrane dans 0,02% d’anticorps IgG1 anti-souris (HRP)/TBST (voir le tableau des matières) et agiter pendant 40 min, puis laver 3x avec TBST pendant 5 min par lavage avec agitation.
    6. Ajouter une solution de chimiluminescence améliorée (voir le tableau des matériaux) et exposer la membrane.
  4. Effectuer la purification de l’OMV-RBD.
    1. Diluer 1 mL de solution d’OMV-RBD à réaction à 10 mL et centrifuger la dilution à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h.
    2. Utilisez une pipette pour jeter le surnageant et suspendre le résidu avec 10 ml de PBS. Centrifuger la suspension à 150 000 x g à 4 °C pendant 2 h.
    3. Jeter le surnageant et suspendre le résidu avec 1 mL de PBS.
      NOTE: Si la solubilité de l’antigène est beaucoup plus faible, le même effet de séparation peut être obtenu par chromatographie d’exclusion de taille19.

5. Caractérisation

  1. Effectuez une diffusion dynamique de la lumière (DLS).
    1. Diluer les échantillons à une concentration de 100 μg/mL et ajouter 1 mL d’échantillon dans la cellule d’échantillon.
    2. Choisissez « Taille » pour « Type de mesure », « Protéines » pour « Matériau de l’échantillon », « Eau » pour « Dispersant », « 25 °C » pour « Température », puis chargez les échantillons et mesurez automatiquement23.
  2. Capturez des images à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET).
    1. Diluer les échantillons à 100 μg/mL. Prenez une grille de cuivre de 200 mailles, ajoutez-y 20 μL d’échantillon et laissez-la être absorbée pendant 10 minutes.
    2. Utilisez du papier filtre pour évacuer la solution, ajoutez 20 μL d’acétate d’uranyle à 3% au film de support et colorez pendant 30 s.
    3. Évacuer l’acétate d’uranyle et sécher le film naturellement à température ambiante pendant 1 h.
    4. Chargez les échantillons dans le système TEM (voir le tableau des matériaux) et capturez les images à 80 kV.

Résultats

L’organigramme de ce protocole est illustré à la figure 1. Ce protocole pourrait être une approche générale de l’utilisation des OMV comme plate-forme vaccinale; Il suffit de choisir les systèmes d’expression appropriés en fonction du type d’antigènes.

La figure 2 présente un schéma de conception plasmidique réalisable. Le gène SC est connecté au gène ClyA via un linker flexible, tandis que ST se connecte à la t...

Discussion

Pour créer une plate-forme vaccinale à nanoparticules « Plug-and-Display », ClyA fusionné SC a été exprimé dans les souches BL21 (DE3), qui est l’un des modèles les plus largement utilisés pour la production de protéines recombinantes en raison de ses avantages dans l’expression des protéines24, de sorte qu’il y aurait suffisamment de fragments SC affichés à la surface des OMV pendant le processus de prolifération bactérienne. Dans le même temps, un antigène cible fusionn...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme clé de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) et le projet de la Fondation nationale chinoise des sciences naturelles (n° 31670936, 82041045).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

Références

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