Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Résumé

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Résumé

Les membranes cellulaires sont des environnements très encombrés pour les réactions biomoléculaires et la signalisation. Pourtant, la plupart des expériences in vitro sondant l’interaction des protéines avec les lipides utilisent des membranes bicouches nues. De tels systèmes n’ont pas les complexités de l’encombrement par les protéines et les glycanes intégrés dans la membrane et excluent les effets de volume associés rencontrés sur les surfaces de la membrane cellulaire. En outre, la surface de verre chargée négativement sur laquelle les bicouches lipidiques sont formées empêche la libre diffusion des biomolécules transmembranaires. Ici, nous présentons une membrane polymère-lipide bien caractérisée comme imitateur pour les membranes lipidiques encombrées. Ce protocole utilise des lipides conjugués au polyéthylène glycol (PEG) comme approche généralisée pour incorporer des encombrements dans la bicouche lipidique supportée (SLB). Tout d’abord, une procédure de nettoyage des lames microscopiques et des lamelles de recouvrement pour effectuer des expériences sur une seule molécule est présentée. Ensuite, les méthodes de caractérisation des PEG-SLB et la réalisation d’expériences sur une seule molécule de liaison, de diffusion et d’assemblage de biomolécules à l’aide du suivi d’une seule molécule et du photoblanchiment sont discutées. Enfin, ce protocole montre comment surveiller l’assemblage nanoporeux de la toxine bactérienne formant des pores Cytolysine A (ClyA) sur des membranes lipidiques encombrées avec une analyse de photoblanchiment à molécule unique. Les codes MATLAB avec des exemples de jeux de données sont également inclus pour effectuer certaines des analyses courantes telles que le suivi des particules, l’extraction du comportement diffusif et le comptage des sous-unités.

Introduction

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes et très encombrés¹. L’encombrement moléculaire peut avoir un impact considérable sur la diffusion d’entités liées à la membrane comme les protéines et les lipides ^2,3,4. De même, les réactions bimoléculaires sur les membranes lipidiques comme la dimérisation des récepteurs ou l’oligomérisation des complexes membranaires sont influencées par l’encombrement ^5,6,7. La nature, la configuration et la concentration des crowders peuvent régir la liaison membranaire, la diffusivité et l’interaction protéine-protéine de plusieurs façons ^8,9. Étant donné qu’il est difficile de contrôler l’encombrement des membranes cellulaires et d’interpréter son influence sur les biomolécules intégrées, les chercheurs ont tenté d’établir d’autres systèmes in vitro ¹⁰.

Une approche populaire pour les membranes artificielles encombrées consiste à doper les membranes bicouches avec des lipides greffés de polymère (tels que le polyéthylène glycol, PEG)^11,12. Au cours de la visualisation de la dynamique des protéines et des lipides sur les bicouches lipidiques soutenues (SLB), ces polymères protègent en outre les composants intégrés à la membrane du substrat sous-jacent chargé négativement (tel que le verre) en soulevant efficacement la bicouche loin du support sous-jacent. En faisant varier la taille et la concentration du polymère, on peut contrôler l’étendue de l’encombrement moléculaire, ainsi que sa séparation du support solide sous-jacent^13,14. C’est clairement un avantage par rapport aux bicouches lipidiques supportées sur des substrats solides sans coussins polymères^15,16, où les biomolécules transmembranaires peuvent perdre leur activité^17,18,19. Plus important encore, cela nous permet de récapituler l’environnement encombré de la membrane cellulaire in vitro, ce qui est essentiel pour de nombreux processus membranaires.

Les polymères greffés en surface sur membranes subissent également des modifications de leur configuration en fonction de leur densité de greffage¹². À de faibles concentrations, ils restent dans une configuration enroulée enroulée, connue sous le nom de champignon, au-dessus de la surface de la membrane. Avec l’augmentation de la concentration, ils commencent à interagir et ont tendance à se dérouler et à s’étendre, donnant finalement une formation dense en forme de brosse sur la membrane²¹. Étant donné que la transition du champignon au régime en brosse est très hétérogène et se manifeste dans des conditions mal caractérisées du polymère, il est important d’utiliser des conditions bien caractérisées pour l’encombrement sur les membranes greffées en polymère. Par rapport à une étude récente²⁰, nous identifions et rapportons des compositions membranaires encombrées qui maintiennent le transport diffusif et l’activité des biomolécules transmembranaires.

Dans ce protocole, nous discutons de la façon de générer des membranes lipidiques PEGylées et fournissons des recommandations pour les densités de PEG qui imitent l’encombrement dans deux régimes différents de configuration de polymère (à savoir, champignon et brosse). Le protocole décrit également la liaison à une seule molécule, le suivi des particules et l’acquisition et l’analyse de données de photoblanchiment pour les molécules intégrées dans ces membranes encombrées. Tout d’abord, nous décrivons les étapes de nettoyage en profondeur, l’assemblage de la chambre d’imagerie et la génération de PEG-SLB. Deuxièmement, nous fournissons des détails pour les expériences de liaison à une seule molécule, de suivi des particules et de photoblanchiment. Troisièmement, nous discutons i) de l’extraction des affinités de liaison relatives, ii) de la caractérisation de la diffusion moléculaire et iii) du comptage des sous-unités dans un assemblage protéique à partir de films de molécules uniques sur la membrane.

Bien que nous ayons caractérisé ce système avec l’imagerie à molécule unique, le protocole est utile pour tous les biophysiciens membranaires intéressés à comprendre l’effet de l’encombrement sur les réactions biomoléculaires sur les membranes lipidiques. Dans l’ensemble, nous présentons un pipeline robuste pour la fabrication de bicouches lipidiques encombrées et soutenues, ainsi que divers tests à molécule unique menés sur eux et les routines d’analyse correspondantes.

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Protocole

1. Nettoyage de la lame et de la lamelle de couverture pour les expériences sur une seule molécule

1. Avant l’assemblage de la chambre d’imagerie, nettoyez et préparez les lames de couverture et les lames. Percez plusieurs paires de trous sur les lames de verre à l’aide d’une perceuse avec des forets revêtus de diamant (0,5 à 1 mm de diamètre). Si des feuilles d’acrylique sont utilisées, utilisez une découpeuse laser pour faire des trous précis (0,5 mm), comme illustré à la figure 1.
   REMARQUE: Chaque paire de trous agira comme une entrée et une sortie pour l’échange d’écoulement pour une chambre microfluidique individuelle. Un fichier CAO représentatif pour les trous dans une lame acrylique est disponible dans le fichier de codage supplémentaire 1. Les trous percés sur les lames de verre finissent généralement par être 1,5 à 2 fois plus grands que la taille du foret.
2. Nettoyez les lames et les lamelles de couverture avec du détergent. Rincez-les abondamment à l’eau désionisée. Placez les lames et les lames de couverture dans un pot séparé de coloration de glissière (Coplin) avec de l’eau et soniquez dans un sonicateur de bain pendant 30 min. Pour toutes les étapes de sonication, utilisez un réglage de puissance de 70 W.
3. Retirez l’eau et remplissez le pot Coplin contenant les lames de verre et les lamelles de couverture avec de l’acétone à ras bord (50-100 ml selon le volume du pot). Dans le cas des feuilles d’acrylique, utilisez le même volume de solution d’acétone prémélangée à 50% (v/v), sinon les lames deviendront givrées. Secouez le pot Coplin pour vous assurer que toutes les lames et les lames de couverture sont complètement immergées dans la solution et sonicate dans un sonicateur de bain pendant 30 min.
4. Retirez l’acétone et jetez-la dans un récipient à déchets, versez le méthanol dans les pots Coplin (50%, v/v pour les lames acryliques) et soniquez pendant 30 min. L’acétone et le méthanol sont utilisés pour éliminer les particules organiques sur les lames.
5. Rincez les lames et les lames de couverture avec de grandes quantités d’eau de type 1 et placez-les dans un pot Coplin en verre. Verser 1 M de solution KOH dans le pot et soniquer pendant 1 h. Pour les lames acryliques, utilisez 0,5 M de KOH.
6. Jetez le KOH dans un conteneur à déchets inorganiques. Rincez le pot avec beaucoup d’eau et placez les pots Coplin dans une hotte pour le traitement du piranha. Ne pas effectuer de traitement piranha pour les lames acryliques; Passez directement à l’étape 1.9.
   ATTENTION: Le traitement Piranha doit être effectué dans une hotte avec des gants appropriés, des lunettes de sécurité et un tablier pour la manipulation des acides. La solution de piranha est un agent oxydant puissant, et elle élimine toutes les particules organiques restantes des lames et des lames de couverture.
7. Pour préparer la solution de piranha, versez délicatement 2/3 de volume d’acide sulfurique (98%, v/v) dans un bécher en verre et remplissez le reste de peroxyde d’hydrogène (30%, v/v). Mélangez soigneusement la solution avec une tige de verre, versez-la dans le pot Coplin et laissez le pot Coplin dans la hotte pendant au moins 1 h.
8. Décanter la solution de piranha du pot Coplin dans un récipient jeté pour les déchets acides conservés à l’intérieur de la hotte. Rincez le pot Coplin avec une grande quantité d’eau de type 1.
9. Sécher les lames et les lames de couverture dans un léger jet d’azote gazeux et les placer dans un pot Coplin propre. Les lames séchées et les lames de couverture sont maintenant prêtes pour le traitement au plasma. Prenez une paire de lames et de lamelles et placez-les dans la machine plasma.
10. Créez un vide dans la chambre. Tournez le bouton sur la fréquence radio de 8-12 MHz pour générer du plasma dans la chambre. Une lueur violette à l’intérieur de la chambre indiquera la formation d’un plasma dans la chambre.
11. Effectuer le traitement au plasma pendant 8-10 min. Relâchez doucement le vide après avoir éteint le plasma et passez à l’étape 2 pour assembler la chambre d’imagerie microfluidique.

2. Assemblage de la chambre microfluidique

REMARQUE: La chambre d’imagerie est créée en prenant en sandwich du ruban adhésif double face entre une lamelle de couverture pré-nettoyée et une lame de l’étape précédente, comme décrit ci-dessous.

1. Assembler les lames et la lamelle de couverture après le traitement au plasma comme illustré à la figure 1. Placez la lame de verre sur un papier de soie propre. Coupez le ruban adhésif double face en bandes de ~2-3 mm de large et placez-les de chaque côté d’une paire de trous sur la lame de verre. Utilisez un embout de pipette pour aplatir la bande ou cela provoquera une fuite d’un canal à l’autre.
   REMARQUE : vous pouvez également couper la bande pour toute la diapositive à l’aide d’un découpeur laser ou automatique (Figure 1).
2. Placez la lamelle de couverture traitée au plasma sur la lame scotchée pour fermer la chambre. Utilisez un embout de pipette pour appuyer doucement sur la lamelle de couverture sur les zones collées afin de rendre le canal étanche.
3. Si vous utilisez des lames de verre, scellez les bords à l’aide de résine époxy. Enfin, chaque chambre d’imagerie réalisée à partir d’une lame et d’une lamelle de couverture a une dimension de 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (longueur x largeur x profondeur). Conservez les chambres d’imagerie microfluidique préparées pendant 1 à 2 semaines dans des conditions desséchées (de préférence entre 10 et 25 °C).
   REMARQUE: Pour les rubans découpés au laser utilisés avec des lames acryliques, il n’est pas nécessaire d’utiliser de l’époxy car les bords du ruban forment un joint étanche étanche.

3. Fabrication de bicouches supportées sur substrat de verre par fusion de vésicules

REMARQUE: Des bicouches lipidiques supportées sont générées sur les parois de la chambre d’imagerie par la fusion de vésicules lipidiques préparées avec des lipides PEG dopés.

1. Prenez un flacon en verre propre, de préférence pré-nettoyé à l’aide d’une solution de piranha. Ajouter une solution de chloroforme de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) et de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000] (DOPE-PEG2000) à la fraction molaire souhaitée des lipides PEG2000 de telle sorte que la concentration finale après ajout du tampon soit de 3 mM de lipides à l’étape 3.4. Préparer d’autres compositions membranaires de lipides de la même manière.
2. Sécher le chloroforme du flacon à l’aide d’un léger jet d’azote avec un petit tourbillon afin que les lipides séchés soient uniformément enrobés à la surface du flacon. Mettez le flacon dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h. Cela éliminera tout chloroforme résiduel dans le flacon en verre. Ajouter 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber pendant une nuit à 37 °C.
3. Préparez de petites vésicules unilamellaires (VUS) comme décrit ci-dessous.
   1. Tourbillonner doucement pendant 1-2 minutes après l’incubation pendant la nuit jusqu’à ce que la solution devienne trouble et laiteuse.
   2. Prendre 100 μL de cette solution dans un petit tube à centrifuger de 500 μL et sonifier pendant environ 1 h dans un sonicateur de bain (réglé à une puissance de 70 W). La solution deviendra claire; Sinon, soniquez pendant 30 minutes supplémentaires. Cette étape générera des VUS de 50 à 100 nm de diamètre.
      NOTE: Si vous vous préparez pour la première fois, caractériser les VUS en utilisant la diffusion dynamique de la lumière^22,23 (DLS) ou une méthode équivalente.
4. Ajouter du chlorure de calcium (CaCl_2, 3 M stock) aux vésicules soniquées de telle sorte que sa concentration finale soit de 30 mM dans la solution lipidique.
5. Coupez une pointe de micropipette pour injecter la solution d’échantillon de manière à ce qu’elle s’insère bien dans le trou. Mélanger la solution lipidique et injecter par l’un des trous de la chambre d’imagerie réalisés à l’étape 2. Essuyez l’excès de solution qui sort de la chambre de la sortie avec un tissu propre pour éviter la contamination des canaux adjacents.
6. Laissez cet ensemble dans une chambre humidifiée pendant 90 min. Préparer une chambre d’humidification en plaçant un mouchoir humide à l’extrémité d’un tube à centrifuger de 50 mL. Placez la glissière latéralement à l’intérieur du tube avec les bouchons de tube fermés. Les vésicules fusionneront et généreront une bicouche uniforme sur la surface du verre.
7. Lavez soigneusement la chambre avec une quantité abondante de tampon PBS (environ 5 fois le volume de la chambre d’imagerie). Empêcher l’entrée de bulles d’air dans la chambre pendant le lavage, car cela peut générer des défauts dans la membrane.

4. Configuration du microscope et mesures d’imagerie monoparticulaire

REMARQUE : Des expériences sur une seule molécule sont réalisées sur un microscope à fluorescence interne totale^24,25,26 (TIRF) basé sur des objectifs (Figure 2). L’imagerie TIRF fournit un meilleur rapport signal/bruit pour l’imagerie à molécule unique, bien que les microscopes à épifluorescence puissent également être utilisés dans certaines conditions (en particulier lorsque les biomolécules fluorescentes peuvent être éliminées de la solution en vrac par lavage). Le type prisme TIRF peut être utilisé mais le type objectif est préférable pour la facilité de mise en place de la microfluidique²⁷. Pour les TIRF de type objectif, un objectif à grande ouverture numérique (grossissement de 100x, habituellement disponible dans le commerce en tant qu’objectif TIRF) est recommandé.

1. Avant de mener toute expérience sur la mobilité et l’assemblage, aligner le microscope TIRF pour assurer un rapport signal sur bruit optimal en raison de l’éclairage par le champ évanescent. Pendant l’alignement, maintenez la puissance laser faible, entre 100 μW et 1 mW.
   ATTENTION : Des lunettes de sécurité laser doivent être utilisées lors de l’alignement du faisceau laser.
   1. Pour aligner le microscope, préparez un échantillon de billes fluorescentes en les ajoutant dans le canal microfluidique à de faibles concentrations (à ~100 pM) de sorte que les taches fluorescentes provenant de billes simples ne se chevauchent pas dans les images.
   2. Tout d’abord, visualisez les billes en mode épifluorescence. Lorsque l’éclairage est en mode épifluorescence, déplacez l’étage de translation du miroir M5 (le miroir qui réfléchit le laser vers le dichroïque) de sorte que le faisceau sortant de l’objectif se plie jusqu’à ce qu’il soit finalement dans une configuration de réflexion interne totale.
   3. Vérifier si l’éclairage TIR a été obtenu. Lorsque le champ d’évanescence TIR éclaire l’échantillon de billes, vérifier que seules les perles à la surface sont visibles et que les perles flottant librement loin de la surface ne sont pas observées.
2. Au début de l’expérience, régler la puissance laser au niveau du plan focal arrière de l’objectif sur 5-10 mW pour empêcher la photodestruction (photoblanchiment) des fluorophores.
3. Gardez la lame sur la scène du microscope et concentrez-vous d’abord sur la membrane nue (sans fluorophores). Habituellement, de petites traces d’impuretés dans les membranes lipidiques sont suffisantes pour ce faire. Facultatif : Incorporez un petit nombre de billes fluorescentes ou de points quantiques (plage sous-picomolaire) à l’étape 3.1, de sorte que seulement deux à cinq particules fluorescentes soient présentes dans le champ de vision pour faciliter l’identification de la mise au point correcte.
4. Injecter l’échantillon (protéines membranaires, etc.) à l’aide d’une micropipette dans la chambre d’imagerie revêtue de PEG-SLB réalisée à l’étape 3.7.
5. Pour mesurer la cinétique de liaison d’une seule molécule, utilisez une pompe à seringue pour faire circuler les biomolécules marquées à travers les trous d’entrée dans la chambre microfluidique (Figure 3). Utilisez un débit de 50 à 500 μL/min.
   1. Commencez l’acquisition du film avant d’ajouter la solution dans la chambre d’imagerie. Acquérir > 5 000 images à une fréquence d’images de 25 à 50 images/s en flux continu jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’augmentation de l’apparition de nouvelles taches sur la surface de la membrane (vidéo 1). Pour l’analyse de la cinétique de liaison, suivez les étapes de 6.1.
6. Pour le suivi d’une seule particule, ajoutez les biomolécules marquées à de faibles concentrations (par rapport à la constante de liaison) au canal à l’aide d’une micropipette. Optimiser la concentration à une densité de <0,1 particules/μm 2 afin que les particules individuelles se croisent rarement (vidéo 2). Cela garantit la haute fidélité des pistes récupérées à partir des jeux de données. Incuber si nécessaire (en cas de mauvaise fixation de la membrane par des biomolécules, ~10 min) dans un environnement humidificateur et laver la chambre avec le tampon.
   REMARQUE: Un lavage est nécessaire au cas où la liaison est mauvaise sur la membrane et que la plupart des molécules fluorescentes restent dans la solution. Sinon, cela peut interférer avec l’imagerie et entraîner un mauvais rapport signal sur bruit.
7. Pour l’analyse de trajectoire monoparticulaire, acquérir 200-500 images à 10-100 images/s. Maintenez la lentille de l’objectif focalisée sur le plan bicouche avec une dérive minimale de l’étage pendant l’intervalle d’acquisition.

5. Acquisition d’images pour compter les sous-unités dans un assemblage protéique

REMARQUE: L’acquisition d’images pour estimer la stœchiométrie nécessite un blanchiment continu des fluorophores et la détection du nombre d’étapes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de fluorophores émettant de fluorescence.

1. Pour mesurer les sous-unités, ajouter la concentration pertinente de biomolécules marquées (exemple: voir résultats; ClyA a été ajouté à une concentration de 25 nM) dans la chambre d’imagerie microfluidique et incuber (laver si nécessaire). Incuber la lame dans une chambre d’humidification à la température souhaitée pendant le temps requis (exemple : 37 °C et 60 min pour l’assemblage de ClyA).
2. Effectuer l’acquisition d’images pour le photoblanchiment à molécule unique comme décrit ci-dessous.
   1. Lavez la chambre d’imagerie avec un tampon avant l’imagerie (si nécessaire). Placez la lame sur le microscope et ajustez la mise au point pour visualiser les molécules marquées.
   2. Réglez la puissance laser à un niveau auquel le blanchiment du fluorophore se produit progressivement (~1-5 min). Idéalement, pour chaque biomolécule assemblée, gardez le taux de pas de photoblanchiment >10-20 images d’imagerie. Acquérir les images jusqu’à ce que toutes les molécules soient complètement photoblanchies (Vidéo 3).
      REMARQUE: Pour déterminer la durée totale de la trajectoire de photoblanchiment requise, tracez l’intensité moyenne des taches individuelles avec le nombre d’images d’imagerie et déterminez la constante de temps en ajustant une fonction de décroissance exponentielle. La durée totale de l’acquisition peut être fixée à 5-10 fois la constante de temps.
3. Effectuez une mesure d’assemblage dépendante du temps en commençant l’acquisition de films dès que l’échantillon est introduit dans la chambre et en acquérant de nouveaux films de photoblanchiment à intervalles de temps fixes après la fixation de la membrane à partir de différents segments du PEG-SLB.

6. Analyse des images et des données

1. Effectuez la liaison et le suivi d’une seule particule comme décrit ci-dessous.
   1. Extraire les trajectoires monoparticules des films acquis ci-dessus, comme illustré à la figure 4. Pour détecter des particules uniques et les suivre, utilisez le package MATLAB, u-track²⁸, ou le plug-in Trackmate²⁹, dans ImageJ, qui fournit également un algorithme robuste de suivi à une seule particule. Suivez les étapes de configuration de l’analyse u-track comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1.
      REMARQUE: Les paramètres critiques pour le suivi d’une seule particule sont l’écart type de la taille des particules (en pixels) et la longueur de fermeture de l’espace. Utilisez 1 et 0, respectivement, pour ces paramètres comme critères les plus stricts pour le suivi.
   2. Pour calculer les constantes de vitesse de liaison, estimez d’abord le nombre de particules se liant à la surface de la membrane au fil du temps. Utilisez le fichier MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) avec le dossier de sortie u-track pour identifier et tracer le nombre de particules apparaissant sur la membrane obtenue à partir de l’étape 6.1. Ajuster la cinétique observée aux modèles cinétiques appropriés (exemple : ajustement exponentiel unique pour déterminer la constante de temps, dont l’inverse peut être attribué à la constante de vitesse apparente)³⁰ pour extraire les constantes de vitesse (voir les résultats, Figure 5).
   3. Le déplacement quadratique moyen (TMS) des particules diffusantes (comme le traceur d’ADN dans les PEG-SLB, Figure 6) indique la nature de la diffusion. Utilisez le package MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) avec le dossier de sortie u-track pour obtenir le tracé MSD en fonction du temps de latence (Figure 6B).
   4. Pour identifier les espèces diffusantes hétérogènes, calculez les distributions de déplacement au carré instantané (DSI) comme illustré à la figure 6C. ISD2, défini comme (X t+τ - X t)2 + (Y_t+τ− Y _t)2, où le temps de latence, _τ = ², est préféré car il réduit le bruit. Filtrez les trajectoires courtes avec moins de trois images pour réduire le bruit.
   5. Utilisez ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) dans MATLAB avec la sortie u-track pour tracer les ISD des particules suivies (Figure 6C).
2. Effectuer l’analyse du photoblanchiment à molécule unique comme décrit ci-dessous.
   1. Pour estimer la stœchiométrie des complexes membranaires, effectuer une analyse de photoblanchiment sur les intensités temporelles des complexes fluorescents (vidéo 3). Pour cela, appliquez un algorithme de correction de dérive (drift_correct_images, Fichier de codage supplémentaire 2) basé sur l’autocorrélation des images vidéo pour extraire la dérive de traduction. Cela suppose que les structures assemblées sont en grande partie immobiles lors de l’acquisition d’images. Exécutez le package MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) pour détecter les traces temporelles d’intensité des particules à partir des films.
   2. Utilisez le code MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) pour effectuer la détection d’étape pour les traces de temps d’intensité. Dans le cas où les particules ne sont pas immobiles, utilisez le package u-track pour extraire l’emplacement des particules en mouvement. Cet ensemble de coordonnées xy peut être mappé aux films bruts pour extraire les valeurs d’intensité de la particule en mouvement lorsqu’elle diffuse latéralement sur la membrane. Utilisez le package MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) avec la sortie de l’analyse u-track pour cette option.
   3. Effectuer une correction pour le marquage incomplet des biomolécules avec des marqueurs fluorophores afin d’estimer la stœchiométrie correcte du complexe protéique. Déterminer l’efficacité du marquage avec un spectrophotomètre UV-VIS en mesurant l’absorption du colorant et des protéines pour estimer la concentration. Calculez l’efficacité du marquage comme le rapport molaire du colorant à la protéine.
      REMARQUE : Certains colorants absorbent également à des longueurs d’onde proches de 280 nm et, par conséquent, cette contribution à l’absorption par le colorant doit être prise en compte lors du calcul de la concentration.
   4. Effectuez une correction binomiale pour tenir compte de l’efficacité de marquage incomplète du fluorophore de la manière suivante en utilisant le code MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) avec les données obtenues à partir du comptage des pas à l’étape 6.2.2. Par exemple, pour une toxine formant des pores comme la cytolysine A, qui forme une structure dodécamérique en forme d’anneau, appliquez une correction binomiale en utilisant la formule suivante:
      n_k
      où = efficacité de l’étiquetage, n = nombre d’étapes de photoblanchiment et s = nombre réel. Utilisez la routine MATLAB Stepcount_immobile pour récupérer les espèces oligomères corrigées. Convertir la fréquence des oligomères (s_i) en fractions massiques (Figure 7C ; Fichier de codage supplémentaire 2).
      REMARQUE : Un ensemble de fichiers analysés que vous suivez sont inclus dans le fichier de codage supplémentaire 3. Les codes MATLAB du fichier de codage supplémentaire 2 peuvent être exécutés avec ces ensembles de données.

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Résultats

Surveillance de la liaison de la protéine ClyA sur les membranes PEGylées
Après l’étape 4.5, la cinétique de liaison est estimée en traçant le nombre de particules se liant à la surface de la membrane au fil du temps (vidéo 1). Lorsque la protéine ClyA se lie à une membrane contenant 5 mol% de lipides PEG2000, la densité des particules augmente et atteint la saturation (Figure 5). Une décroissance exponentielle adaptée aux particules liée...

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Discussion

Ici, nous démontrons des expériences sur une seule molécule sur des bicouches lipidiques soutenues (SLB) qui manifestent un environnement encombré pour les biomolécules intégrées dans la membrane. L’environnement surpeuplé génère un effet de volume exclu, conduisant à l’amélioration des réactions biomoléculaires 1,2,39,40. Pour le système PEG-lipide, où le polymère occupe p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Plastic syringe
Acetone	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylic Sheet			2 mm thick
Acrylic Sheet	BigiMall		2 mm, Clear
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC grade
Cholesterol	Avanti	700100
Coplin Jar	Duran Wheaton Kimble	S6016	8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA Connector Strand 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape	3M	LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)			0.5 - 1 mm
Drilling Machine	Dremel	220	Workstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads	Invitrogen	F10720
Glass Slides	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glass Vials	Sigma	854190
Hydrogen Peroxide	Lobachemie	00182	30% Solution, AR Grade
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Laser Cutter	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscope	Olympus	IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)			1X
Plasma Cleaner	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE1010	High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps	Sigma	27141
PTFE Tubing	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid	SD Fine Chemicals		98%, AR Grade
TIRF Objective	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator	Tarsons
Vortex Mixer	Tarsons