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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, une méthode facile à suivre pour cultiver in vitro des cellules épithéliales pigmentaires primaires de la rétine porcine est présentée.

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées polarisées, située entre la choroïde et la neurorétine dans la rétine. De multiples fonctions, y compris la phagocytose, le transport des nutriments / métabolites, le métabolisme de la vitamine A, etc., sont effectuées quotidiennement par l’EPR. Les cellules EPR sont des cellules épithéliales différenciées en phase terminale avec peu ou pas de capacité de régénération. La perte de cellules EPR entraîne de multiples maladies oculaires entraînant une déficience visuelle, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Par conséquent, l’établissement d’un modèle de culture in vitro de cellules EPR primaires, qui ressemble plus à l’EPR in vivo qu’aux lignées cellulaires, est essentiel pour les études caractéristiques et mécanistes des cellules EPR. Compte tenu du fait que la source des globes oculaires humains est limitée, nous créons un protocole pour cultiver des cellules primaires d’EPR porcines. En utilisant ce protocole, les cellules EPR peuvent être facilement dissociées des globes oculaires porcins adultes. Par la suite, ces cellules dissociées se fixent aux boîtes de culture, prolifèrent pour former une monocouche confluente et rétablissent rapidement les principales caractéristiques du tissu épithélial in vivo en 2 semaines. Par qRT-PCR, il est démontré que les cellules RPE porcines primaires expriment plusieurs gènes de signature à des niveaux comparables avec le tissu RPE natif, tandis que les expressions de la plupart de ces gènes sont perdues / fortement réduites dans les cellules humaines de type EPR, ARPE-19. De plus, la coloration par immunofluorescence montre la distribution de la jonction serrée, de la polarité tissulaire et des protéines du cytosquelette, ainsi que la présence de RPE65, une isomérase essentielle au métabolisme de la vitamine A, dans les cellules primaires en culture. Dans l’ensemble, nous avons développé une approche facile à suivre pour la culture de cellules EPR porcines primaires avec des caractéristiques RPE de haute pureté et natives, qui pourrait servir de bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier les toxicités cellulaires et faciliter les dépistages de médicaments.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est situé entre les photorécepteurs et la choriocapillarise dans la couche externe de la rétine1 avec de multiples fonctions, y compris la formation de la barrière hémato-rétinienne, le transport et l’échange de nutriments et de métabolites rétiniens, le recyclage de la vitamine A pour maintenir un cycle visuel normal, et la phagocytose et la clairance des segments externes des photorécepteurs (POS)2,3 . Étant donné que les PDV nécessitent un auto-renouvellement constant pour générer la vision, les cellules EPR doivent continuellement engloutir les POS détachés pour maintenir l’homéostasie rétinienne4. Par conséquent, le dysfonctionnement de l’EPR entraîne de nombreuses maladies oculaires cécitantes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)4, la rétinite pigmentaire (RP)5, l’amaurose congénitale de Leber6, la rétinopathie diabétique7, etc. Jusqu’à présent, la pathogenèse exacte de la plupart de ces maladies reste insaisissable. En conséquence, la culture cellulaire RPE est établie pour étudier la biologie cellulaire RPE, les changements pathologiques et les mécanismes sous-jacents.

En tant que modèle le plus simple pour étudier la biologie cellulaire, la culture de cellules EPR a commencé dès les années 19208. Bien que l’ARPE-19 soit largement utilisé comme cellules EPR, la perte de pigmentation, la morphologie des pavés et, surtout, les fonctions de barrière dans cette lignée cellulaire soulèvent beaucoup de préoccupations9. En comparaison, la culture de cellules EPR humaines primaires offre un scénario plus réaliste pour les études physiologiques et pathologiques9. Cependant, la disponibilité relativement limitée restreint leur utilisation et des problèmes éthiques existent toujours. En outre, plusieurs groupes ont utilisé des modèles murins pour cultiver des cellules EPR. Cependant, la taille de l’œil de souris est petite et une seule culture nécessite généralement de nombreuses souris, ce qui n’est pas pratique9. Récemment, les scientifiques ont mis au point de nouvelles méthodes pour utiliser des cellules souches embryonnaires humaines ou des cellules souches pluripotentes induites pour dériver des cellules EPR. Bien que cette technique ait un potentiel particulier pour le traitement des troubles héréditaires de l’EPR, elle prend beaucoup de temps et nécessite généralement plusieurs mois pour générer des cellules EPR matures10. Pour surmonter ces problèmes, nous introduisons ici un protocole facile à suivre pour isoler et cultiver régulièrement des cellules EPR de haute pureté en laboratoire. Dans des conditions de culture appropriées, ces cellules peuvent présenter des fonctions RPE typiques et présenter des morphologies RPE typiques. Par conséquent, cette méthode de culture peut fournir un bon modèle pour comprendre la physiologie de l’EPR, étudier la cytotoxicité, étudier les mécanismes pathologiques des maladies oculaires connexes et effectuer des dépistages de médicaments.

Protocole

L’utilisation d’animaux de laboratoire était conforme aux règlements de l’Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) et a été approuvée par le Comité d’éthique de la gestion des animaux expérimentaux de l’Université de Xiamen.

1. Préparation de dispositifs chirurgicaux expérimentaux, d’enzymes de digestion tissulaire et de tampons de culture cellulaire

  1. Préparer les dispositifs chirurgicaux expérimentaux, en nettoyant et en autoclavant deux paires de ciseaux et de pinces chirurgicaux ophtalmiques la veille de la dissection du globe oculaire, puis en séchant la boîte avec des dispositifs chirurgicaux dans une étuve à protocole général à 65 °C pendant la nuit.
  2. Préparation des milieux de culture.
    1. Préparer le DMEM/milieu basique complété par 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 2 mM de L-glutamine et 1 % (v/v) de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL).
    2. Préparer des milieux DMEM/F12 additionnés de FBS à 1 % (v/v) et de pénicilline à 1 % (v/v) (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL).
    3. Préparer MEM-Nic 11, en complétant MEM alpha avec 2 mM de L-glutamine, 1% FBS, 1% (v/v) de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL), 0,1 mM NEAA, 1% (v/v) supplément de N1, taurine (0,25 mg/mL), hydrocortisone (20 ng/mL), triiodo-thyronine (0,013 ng/mL) et10 mM de nicotinamide.
      NOTE: Pour améliorer la viabilité et la prolifération cellulaires, le pourcentage de FBS peut être augmenté à 20% pour neutraliser les enzymes de digestion et ensemencer les cellules dissociées. Pour la culture cellulaire à long terme, le pourcentage de FBS peut être réduit à aussi bas que 1%12.
  3. Décongeler l’enzyme de digestion tissulaire aliquote (solution de trypsine/EDTA à 0,25 % (p/v) supplémentée en EDTA à 0,91 mM, ci-après appelée solution de trypsine/EDTA) au cours de l’expérience.
    REMARQUE: Une solution fraîche de trypsine/EDTA doit être utilisée à chaque fois pour obtenir des résultats optimaux. Aliquote 10 mL de solution fraîche de trypsine/EDTA dans chaque tube centrifuge stérile de 15 mL et congeler les aliquotes au réfrigérateur à -20 °C jusqu’à utilisation.
  4. Solution de dissection.
    1. Stériliser 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,2) supplémentée en pénicilline à 2 % (v/v) (100 U/mL) et en streptomycine (100 U/mL) en filtrant la solution à l’aide d’une seringue filtrante de 0,22 μm.
  5. Enduire les plaques de culture et les inserts transwell.
    1. Lavez les puits et les inserts transwell avec 1x PBS. Retirer le PBS des puits et des puits à l’aide d’une pipette, puis ajouter 1 mL de 1x PBS frais dans la chambre inférieure et 600 μL de 10 μg/mL de solution de laminine dans la chambre supérieure.
    2. Incuber les plaques/inserts transwell dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2. Retirer la solution de laminine de la chambre supérieure et laver avec 1 mL de 1x PBS froid deux fois avant d’ensemencer les cellules.

2. Dissection des cellules EPR du globe oculaire porcin

  1. Préparation des instruments.
    1. Nettoyez la hotte à flux laminaire avec de l’éthanol à 75 % et de la lumière UV. Préparer trois tubes centrifugeux stériles de 50 mL contenant ~25 mL d’éthanol à 75 %, trois tubes centrifugeuses stériles de 50 mL contenant ~25 mL de 1x PBS et trois boîtes de culture cellulaire stérile de 10 cm contenant ~15 mL de 1x PBS.
      REMARQUE: Ces paramètres sont généralement utilisés pour disséquer quatre globes oculaires porcins. Veuillez augmenter la taille lorsque d’autres globes oculaires sont utilisés. Pour améliorer la viabilité de la cellule, prérefroidir 1x tampon PBS sur de la glace pendant au moins 30 minutes. L’éthanol à 75 % et la lumière UV sont nécessaires pour s’assurer que les instruments expérimentaux et les cellules ne sont pas contaminés. Allumez la lampe UV à l’avance pour stériliser toute la table d’opération pendant au moins 15 min.
  2. Nettoyez les globes oculaires du porc.
    1. Obtenir des globes oculaires frais d’un abattoir et les garder sur la glace jusqu’à la dissection. Trempez quatre globes oculaires porcins dans ~15 ml d’éthanol à 75% dans une boîte de Petri de 10 cm et utilisez une paire de ciseaux et de pinces pour couper tous les tissus conjonctifs et les muscles résiduels.
      REMARQUE : Enlevez autant de tissu que possible à l’extérieur de la sclérotique pour réduire les contaminations. Ne coupez pas le nerf optique à ce moment pour faciliter le transfert des globes oculaires pendant l’étape de décontamination et de lavage. Après cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire.
  3. Décontaminer les globes oculaires porcins en trempant et en lavant quatre globes oculaires porcins dans trois tubes centrifugeux stériles de 50 ml remplis d’éthanol à 75 % de manière séquentielle; Chaque globe oculaire est plongé pendant au moins 5 minutes dans chaque tube. Ensuite, lavez les globes oculaires porcins dans trois tubes centrifugés stériles de 50 ml remplis de 1x PBS de manière séquentielle; laver chaque globe oculaire pendant au moins 5 minutes dans chaque tube (figure 1A). Inversez les tubes toutes les minutes pour bien laver les globes oculaires.
  4. Dissection des globes oculaires porcins.
    1. Déplacez les quatre globes oculaires porcins dans une boîte de culture cellulaire stérile de 10 cm contenant 1x PBS. Coupez à nouveau la surface externe de chaque globe oculaire pour enlever le nerf optique et les petits débris (Figure 1B). Utilisez des ciseaux pour faire une petite coupure à l’intersection du limbe et de la sclérotique, puis retirez la cornée, l’iris, le cristallin, le corps vitré et la rétine neurale (pour les structures détaillées de ces tissus, veuillez vous référer à la figure 1).
    2. Transférer le complexe EPR-choroïde-sclérotique dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 cm et faire quatre coupes pour aplatir l’œilleton en forme de trèfle à quatre feuilles (Figure 1C).
  5. Effectuer la digestion de la solution trypsine/EDTA en plaçant les quatre complexes EPR-choroïde-sclérotique dans une nouvelle boîte de 10 cm. Verser 20 ml de solution fraîche de trypsine/EDTA pour fusionner les complexes EPR-choroïde-sclérotique et mettre la capsule dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant ~30 min.
    REMARQUE: Utilisez une solution fraîche de trypsine/EDTA pour dissocier les cellules EPR. Contrôlez soigneusement le temps de digestion de la solution de trypsine / EDTA, car un temps d’incubation plus long (plus de 30 minutes) peut augmenter la contamination d’autres types de cellules.

3. Isolement et culture de cellules EPR du globe oculaire porcin

  1. Dissociation RPE.
    1. Sortir la capsule de l’incubateur après 30 minutes d’incubation avec une solution de trypsine/EDTA et ajouter 20 ml de milieux de culture préchauffés (avec 10 % de FBS) dans la capsule pour neutraliser la solution de trypsine/EDTA.
      Remarque : À cette étape, seul le support DMEM/Basic est utilisé. Lorsque les cellules atteignent la confluence, trois milieux de culture peuvent être utilisés en fonction des conditions expérimentales : milieu DMEM/Basic, milieu DMEM/F12 et milieu MEM-Nic.
    2. Utilisez une pipette de transfert de 5 mL pour dissocier les cellules EPR en les pipetant doucement plusieurs fois. Recueillir les suspensions cellulaires dans des tubes à centrifuger de 15 mL. Utiliser 10 mL supplémentaires de milieux de culture frais (10 % FBS) pour laver les complexes EPR-choroïde-sclérotique sur la capsule en pipetant doucement pour obtenir autant de cellules EPR que possible.
      REMARQUE: Ne triturez pas les cellules trop vigoureusement. Assurez-vous de remplir et de vider la pipette à un débit d’environ 3 mL/s. Évitez de faire bouillonner la suspension cellulaire.
  2. Recueillir les cellules EPR en centrifugeant les tubes à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 5 mL supplémentaires de milieu de culture (10% FBS) pour remettre les cellules en suspension et centrifuger à 200 x g pendant 5 minutes supplémentaires. Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 12 mL de milieux de culture.
    REMARQUE: Lors de l’aspiration du surnageant, laissez environ 1 mL de média pour éviter la rupture des amas cellulaires.
  3. Ensemencement des cellules EPR.
    1. Semer ~1-2 x 105 cellules/puits dans des plaques de culture à 12 puits ou des inserts transwell. Habituellement, environ 1,5 x 106 cellules RPE sont obtenues à partir de quatre globes oculaires porcins. Changez les milieux de culture tous les 2 jours et réduisez la concentration sérique à 1% lorsque les cellules couvrent complètement la surface des puits/inserts.
      REMARQUE: Ne déplacez pas la boîte de culture cellulaire trop fréquemment avant que les cellules ne se fixent à la boîte de culture/inserts.
  4. Changez les milieux de culture tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées.
    REMARQUE: La concentration de FBS peut être réduite après que les cellules atteignent la confluence, et les cellules peuvent être cultivées jusqu’à plusieurs mois pour permettre une différenciation et une maturation complètes.

4. Caractérisation des cellules EPR porcines primaires

  1. Cultivez les cellules à confluence pendant 1 ou 2 semaines, puis récoltez les cellules pour une analyse plus approfondie.
  2. Récolter des cellules pour l’analyse quantitative par PCR en temps réel (qRT-PCR).
    1. Retirer le milieu de culture, laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS froid, puis ajouter 500 μL de solution d’extraction d’ARN dans chaque puits pour recueillir le lysat cellulaire d’environ 1 x 106 cellules.
    2. Extraire l’ARNm13; environ 4 μg d’ARN sont extraits de chaque échantillon. Utiliser 100 ng d’ARNm pour effectuer la transcription inverse14; diluer l’ADNc 40 fois pour une analyse quantitative par PCR en temps réel. Les amorces sont énumérées dans le tableau 1.
  3. Récolter des cellules pour la coloration par immunofluorescence.
    1. Retirer le milieu de culture, laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS froid, puis ajouter 500 μL de paraformaldéhyde à 4% (p/v) dans 1x PBS pour fixer les cellules (environ 1 x 106 cellules/puits) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, laver les cellules avec 1x PBS deux fois et effectuer une coloration par immunofluorescence avec des anticorps primaires (1:100 dans 1x PBS supplémenté avec 1% (p/v) d’albumine sérique bovine) à 4 °C pendant la nuit et des anticorps secondaires (1:200 dans 1x PBS supplémenté avec 1% (p/v) d’albumine sérique bovine) à température ambiante pendant 2 h selon les protocoles en ligne15.
    2. Les images d’immunofluorescence sont acquises par un microscope confocal suivant le manuel en ligne16.
  4. Récolter des cellules pour l’analyse par transfert Western.
    1. Retirez le milieu de culture, lavez les cellules avec 1x PBS froid deux fois, puis ajoutez 80 μL de tampon RIPA (avec 1x inhibiteur de protéase) dans chaque puits et utilisez des grattoirs cellulaires pour gratter environ 1 x 106 cellules de la vaisselle / inserts.
    2. Recueillir le lysat cellulaire de chaque puits/insert dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Faire bouillir les lysats cellulaires pendant 10 minutes, puis mesurer les concentrations de protéines à l’aide de kits BCA; la concentration en protéines de chaque échantillon est d’environ 2 mg/mL. Utiliser 25 μg de protéines de chaque échantillon pour l’analyse par transfert Western conformément aux protocoles en ligne17.
    3. Dans le cas du transfert Western, incuber les membranes dans 5 mL de solution d’anticorps primaires (dilution 1:1 000 des anticorps primaires dans 1x solution TBST supplémentée avec 5 % (p/v) d’albumine sérique bovine) à 4 °C pendant une nuit sur un agitateur polyvalent rotatif.
    4. Ensuite, incuber la membrane avec environ 15 mL de solution d’anticorps secondaires anti-lapin ou anti-souris (dilution 1:5 000 d’anticorps secondaires dans 1x solution TBST supplémentée avec 5% (p/v) de lait écrémé) à température ambiante pendant 2 h sur un agitateur orbitaire, selon la source d’anticorps primaire utilisé.
  5. Mesure de la résistance transépithéliale (TER).
    1. Lavez les électrodes de baguette avec de l’éthanol à 70% et stérile 1x PBS de manière séquentielle. Placez ensuite l’extrémité la plus courte de l’électrode dans la chambre supérieure et l’extrémité la plus longue dans la chambre inférieure des inserts transwell et cliquez sur le bouton du voltmètre épithélial pour les mesures. Enregistrer les mesures TER de chaque puits en trois exemplaires.

Résultats

Les cellules primaires de l’EPR porcine (EPRP) ont été cultivées dans un milieu DMEM/Basic avec 10 % de FBS, et la morphologie cellulaire au microscope optique a été photographiée 2 jours (figure 2A), 6 jours (figure 2B) et 10 jours (figure 2C) après l’ensemencement. Après 1 semaine, une monocouche confluente de cellules pRPE pigmentées avec des morphologies pavées a été observée.

Pour mi...

Discussion

Ici, un protocole détaillé et optimisé pour l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules EPR à partir de globes oculaires porcins, qui génère un bon modèle pour la caractérisation in vitro des cellules EPR et les études sur les troubles liés à l’EPR, a été décrit. Des méthodes d’isolement de l’EPR à partir d’yeux humains, de souris et de rats ont été décrites précédemment23,24,25<...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ont révélé qu’il n’y avait pas de conflits d’intérêts.

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Les auteurs aimeraient montrer leur gratitude et leur respect à tous les animaux qui apportent leurs cellules dans cette étude. Cette étude a été financée en partie par des subventions du National Key R&D Program of China (2019YFA0111200, Yi Liao & Yuan Gao et Grant nos. 2018YFA0107301, Wei Li). Les auteurs remercient Jingru Huang et Xiang You du laboratoire central de la faculté de médecine de l’Université de Xiamen pour leur soutien technique en imagerie confocale.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ARPE-19 cellsCCTCCGDC0323
Bovine serum albuminYeasen36101ES60
Confocal microscopyZeissLSM 880 with Airyscan
ChemiDoc TouchBio-Rad1708370
Cell scraperSangonF619301
10 cm culture dishNEST121621EH01
12-well culture plateNEST29821075P
DMEM F12 MediumGibcoC11330500BT
DMEM basic MediumGibcoC11995500BT
EVOM2World Precision InstrumentsEVOM2For TER measurement
Fetal bovine serumExCell BioFSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRPBio-Rad0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRPBio-Rad5196-2504
hydrocortisoneMCEHY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)ThermoFisher Scientific62249
LightCycler 96 InstrumentRoche5815916001
LiothyronineMCEHY-A0070A/CS-4141
lamininSigma-AldrichL2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX MediumGibco10566-016
MEM NEAA(100X)Gibco11140-050
Millex-GP syringe filter unitMilliporeSLGPR33RB
N1Sigma-AldrichSLCF4683
NcmECL UltraNew Cell&Molecular BiotechP10300
Non-fat Powdered MilkSolarbioD8340
NicotinamideSparkJadeSJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibodyAbcamab76020Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)EpizymePG112
primary Human RPE cells --Generous gift from Shoubi Wang lab 
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific23225
PrismGraphPad by Dotmaticsversion 8.0
Protease Inhibitor CocktailsAPExBIOK1024
PRE65 antibodyProteintech17939-1-APRecognize both human and porcine proteins
PEDF antibodySanta Cruz Biotechnologysc-390172Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin Biological Industries03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)RARBIORA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master MixToyoboFSQ-201
RIPA bufferThermoFisher Scientific 89900
15 mL sterile centrifuge tubesNEST601052
50 mL sterile centrifuge tubesNEST602052
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200-056
TaurineDamas-beta107-35-7
TrizolThermo-Fisher 15596026RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR430A
12-well transwell insertsLabselect14212
VEGF antibodyProteintech19003-1-APRecognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kitNovusbioVAL106
ZO-1 antibodyABclonalA0659Recognize both human and porcine proteins

Références

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