Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Résumé

Ce protocole décrit la méthode détaillée de PCR par gouttelettes numériques (dd-PCR) pour une quantification précise des niveaux d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules à l’aide d’amorces divergentes.

Résumé

La réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase (dd-PCR) est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles; il fractionne la réaction en près de 20 000 gouttelettes d’eau dans l’huile, et la PCR se produit dans les gouttelettes individuelles. La dd-PCR présente plusieurs avantages par rapport à la qPCR conventionnelle en temps réel, notamment une précision accrue dans la détection des cibles de faible abondance, l’omission des gènes de référence pour la quantification, l’élimination des réplications techniques pour les échantillons et la démonstration d’une grande résilience aux inhibiteurs dans les échantillons. Récemment, la dd-PCR est devenue l’une des méthodes les plus populaires pour quantifier avec précision l’ADN ou l’ARN cible pour l’analyse de l’expression génique et le diagnostic. Les ARN circulaires (circRNA) sont une grande famille de molécules d’ARN fermées par covalence récemment découvertes dépourvues d’extrémités 5' et 3'. Il a été démontré qu’ils régulent l’expression des gènes en agissant comme des éponges pour les protéines de liaison à l’ARN et les microARN. De plus, les circRNA sont sécrétés dans les fluides corporels et leur résistance aux exonucléases en fait des biomarqueurs pour le diagnostic des maladies. Cet article vise à montrer comment effectuer la conception d’amorces divergentes, l’extraction d’ARN, la synthèse de l’ADNc et l’analyse dd-PCR pour quantifier avec précision les niveaux spécifiques d’ARN circulaire (circRNA) dans les cellules. En conclusion, nous démontrons la quantification précise des circRNA à l’aide de la dd-PCR.

Introduction

Les progrès récents dans les technologies de séquençage de l’ARN et de nouveaux algorithmes de calcul ont permis de découvrir un nouveau membre de la famille croissante des ARN non codants, appelé ARN circulaire (circRNA)¹. Comme leur nom l’indique, les circRNA sont une famille de molécules d’ARN simple brin sans extrémités libres. Ils sont formés par épissage tête à queue non canonique appelé épissage arrière, où le site accepteur d’épissage en amont se joint de manière covalente avec le site donneur d’épissage en aval pour former un cercle d’ARN stable ^1,2. Ce processus pourrait être médié par plusieurs facteurs, y compris les éléments répétitifs Alu inversés présents en amont et en aval des exons circularisés, ou peut être médié par certains facteurs d’épissage ou protéines de liaison à l’ARN (RBP)^2,3. Les ARN circulaires générés exclusivement à partir de la séquence exonique ou intronique sont classés comme circRNA exonique et ARN intronique circulaire ou ARN-ci, tandis que certains circRNA exoniques conservent l’intron et sont appelés circRNAs exon-intron (EIcircRNAs)^3,4. Les fonctions des circRNA sont multiformes, y compris l’éponge des miARN et / ou RBP, la régulation de la transcription et la régulation de la fonction cellulaire en traduisant en peptides 3,5,6,7. Plusieurs rapports ont mis en évidence l’importance des circRNAs dans diverses maladies et processus physiologiques⁸. De plus, les schémas d’expression spécifiques aux tissus et la résistance à la digestion des exonucléases en font un biomarqueur fonctionnel pour le diagnostic de la maladie et il peut également être utilisé comme cible thérapeutique appropriée⁸. Compte tenu de son importance dans la régulation de la santé et des maladies, la quantification précise de l’expression de l’ARNcirc est le besoin de l’heure.

Plusieurs méthodes biochimiques ont été développées pour quantifier les circRNA dans des échantillons biologiques⁹. L’une des méthodes les plus pratiques et les plus largement acceptées pour la quantification de l’ARNcirc est la transcription inverse suivie d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) utilisant des paires d’amorces divergentes¹⁰. Cependant, la majorité des circRNA sont en faible abondance par rapport aux ARNm linéaires, ce qui rend difficile leur quantification¹¹. Pour surmonter ce problème, nous avons cherché à utiliser la PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour quantifier avec précision le nombre de circRNA dans un échantillon donné. La dd-PCR est une technologie de PCR avancée qui suit le principe de la microfluidique; il génère plusieurs gouttelettes aqueuses dans l’huile, et la PCR se produit dans chaque gouttelette comme une réaction individuelle¹². La réaction se produit dans des gouttelettes individuelles et est analysée à l’aide d’un lecteur de gouttelettes, ce qui donne le nombre de gouttelettes positives ou négatives pour le gène d’intérêt¹². C’est la technique la plus sensible pour quantifier avec précision un gène d’intérêt, même s’il n’y a qu’une seule copie dans un échantillon donné. La diminution de la sensibilité aux inhibiteurs, une meilleure précision et l’omission du gène de référence pour la quantification le rendent plus avantageux que la qPCR^{conventionnelle 13,14,15}. Il a été largement utilisé comme outil de recherche et de diagnostic pour la quantification absolue d’un gène d’intérêt^16,17. Ici, nous décrivons le protocole détaillé de dd-PCR pour la quantification circRNA dans la différenciation des myotubes C2C12 de souris et des myoblastes C2C12 de souris proliférants à l’aide d’amorces divergentes.

Protocole

L’ARN est sensible aux RNases; par conséquent, tous les réactifs, instruments et espaces de travail doivent être exempts de RNase et manipulés avec soin.

1. Conception divergente de l’amorce pour l’ARNcirc (voir la figure 1)

1. Récupérer la séquence mature à partir des données d’annotation circRNA à l’aide de BEDTools ou du navigateur de génome UCSC en joignant la séquence exon/intron présente entre les coordonnées de jonction d’épissure^18,19.
2. Préparer une séquence modèle de PCR de 200 nucléotides de longueur en joignant les 100 derniers nucléotides de la longueur totale de la séquence circRNA aux 100 premiers nucléotides de la séquence circRNA¹⁰.
   REMARQUE: Si la longueur de l’ARNcirc est inférieure à 200 nucléotides, divisez-la en deux moitiés égales et joignez les nucléotides de la dernière moitié au début de la première moitié.
3. Utilisez la séquence de modèle ci-dessus pour la conception de l’amorce en utilisant l’outil Web Primer3 et en définissant une longueur de produit PCR allant de 120 à 180 nucléotides de longueur²⁰.
4. Utilisez les paramètres par défaut de Primer3 pour d’autres paramètres tels que Tm et la longueur de l’apprêt. Les séquences d’amorces pour circBnc2 sont énumérées dans le tableau 1.
5. Ordonner les séquences d’amorces divergentes pour la synthèse de n’importe quelle société d’oligo-synthèse.

2. Isolement de l’ARN

REMARQUE: Isolez l’ARN total des cellules C2C12 de la souris à l’aide de kits disponibles dans le commerce ou d’une méthode d’isolement de l’ARN interne. La méthode interne d’isolement de l’ARN utilisée ici a été décrite précédemment²¹. Les billes de silice magnétiques sont préparées en laboratoire selon le protocole²² publié précédemment. Ces billes magnétiques peuvent également être achetées auprès de divers fournisseurs.

1. Prenez une boîte de 10 cm contenant environ 5 x 10⁶ cellules myoblastiques C2C12 proliférantes et un myotube C2C12 différencié de 4 jours pour isoler l’ARN.
2. Lavez les cellules avec 10 ml de 1x PBS trois fois et jetez le PBS à l’aide d’une pipette.
3. Grattez les cellules dans 1 mL de 1x PBS à l’aide d’un grattoir de cellules, centrifugez-les à 4 °C pendant 5 min à 750 x g et jetez le PBS à l’aide d’une pipette.
4. Ajouter 1 mL de réactif d’isolement d’ARN (RIR) et lyser les cellules par pipetage vigoureux²¹.
5. Ajouter 200 μL (1/5 du volume de RIR) de chloroforme et de vortex pendant 15 s. Centrifuger le tube à 4 °C pendant 10 min à 12 000 x g.
6. Prélever 400 μL de la couche aqueuse supérieure, la charger sur une colonne de silice et centrifuger pendant 1 min à 12 000 x g à température ambiante. Apportez le flux à un nouveau tube et ajoutez 600 μL d’éthanol à 100%.
7. Ajouter 20 μL de billes de silice magnétiques et placer le tube sur un thermomélangeur réglé à 25 °C et 1 200 tr/min pendant 5 min.
   REMARQUE: Le volume de la bille peut être augmenté ou diminué en fonction du nombre initial de cellules prises pour la lyse. Les billes de silice magnétiques peuvent être achetées auprès de fournisseurs commerciaux.
8. Placez le tube sur un support magnétique pendant 30 s ou jusqu’à ce que la solution devienne claire. Jeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
9. Remettez en suspension les billes de silice magnétiques dans un tampon de lavage de 500 μL contenant 90 % d’éthanol. Placez le tube sur le support magnétique pendant 30 s. Faites pivoter le tube deux fois sur le support magnétique pour laver les perles. Laissez les billes se déposer vers l’aimant et jetez le tampon à l’aide d’une pipette.
10. Répétez l’étape 2.9 deux fois. Après le lavage, faites tourner brièvement le tube et replacez-le sur le support magnétique pendant 30 s. Jetez le tampon de lavage restant. Sécher le tube à l’air libre à 50 °C pendant 3 min sur un thermomélangeur, en gardant le couvercle ouvert.
11. Ajouter 20 μL d’eau sans nucléase et remettre les billes en suspension.
    REMARQUE: Le volume d’élution de l’ARN peut être réduit jusqu’à 10 μL pour augmenter la concentration d’ARN.
12. Placez les tubes pendant 2-3 min à température ambiante. Replacez le tube sur le support magnétique et laissez-le reposer pendant 30 s. Recueillir l’ARN dissous dans un nouveau tube pour l’évaluation de la quantité et de la qualité à l’aide d’un spectrophotomètre.
    REMARQUE: L’ARN peut être stocké à -20 ° C ou -80 ° C pour un stockage à long terme. Pour obtenir un résultat optimal, il est recommandé de procéder à l’étape de synthèse de l’ADNc le lendemain.

3. Synthèse de l’ADNc

1. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et prendre 1 μg d’ARN pour la synthèse de l’ADNc.
2. Mélanger 1 μg d’ARN total avec 1 μL de mélange dNTP (10 mM chacun de dATP, dTTP, dGTP et dCTP), 4 μL de tampon de transcriptase inverse (RT) 5x, 2 μL d’amorce aléatoire RT 10x, 0,25 μL d’enzyme transcriptase inverse (200 U/μL) et 0,5 μL d’inhibiteur de la RNase (40 U/μL), et compléter le volume jusqu’à 20 μL en utilisant de l’eau sans nucléase.
   REMARQUE: Le volume de l’enzyme de transcriptase inverse peut être modifié en fonction de la concentration initiale d’ARN prise pour la synthèse de l’ADNc.
3. Tapotez le tube pour mélanger la réaction et tourner brièvement. Placer le tube à 25 °C pendant 10 min puis à 50 °C pendant 1 h.
4. Pour inactiver l’enzyme, placez le tube à 85 °C pendant 5 min.
5. Réfrigérer le tube pendant 2 minutes et ajouter 480 μL d’eau sans nucléase dans le tube pour obtenir la concentration d’ADNc à 2 ng / μL.
   REMARQUE: L’ADNc peut être stocké à -20 °C ou utilisé immédiatement pour l’analyse dd-PCR.

4. Flux de travail PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR)

REMARQUE: Le flux de travail de la dd-PCR implique plusieurs étapes, à commencer par la préparation de l’échantillon, suivie de la génération de gouttelettes, de l’amplification PCR, du comptage des gouttelettes et de l’analyse des données. Chaque étape est cruciale pour la génération de données précises car la dd-PCR implique la quantification absolue des produits et ne nécessite aucune courbe standard. Par conséquent, chacune des différentes étapes de la dd-PCR a été décrite ci-dessous.

1. Préparation de la réaction dd-PCR.
   1. Mettez en place la réaction PCR de 22 μL dans des tubes ou des bandelettes PCR de 0,2 mL avec un tube témoin négatif et des tubes NTC (témoins sans gabarit).
      REMARQUE: Chaque paire d’amorces divergentes pour la détection de différents circRNA doit avoir une réaction NTC avec des échantillons d’essai.
   2. Ajouter 11 μL de mélange maître dd-PCR (p. ex., EvaGreen Supermix) et 11 μL d’eau sans nucléase pour mettre en place le tube de réaction de contrôle négatif.
      NOTE: Décongeler le mélange maître dd-PCR à température ambiante suivi d’un bref vortex pour obtenir un mélange homogène. Utilisez la même eau exempte de nucléases pour mettre en place le tube de réaction de contrôle négatif et les tubes NTC qui ont été utilisés pour diluer l’ADNc.
   3. Ajouter 11 μL de mélange maître dd-PCR, 5,5 μL de mélange d’amorces avant et arrière spécifique de circRNA de concentration de 1 μM et 5,5 μL d’eau sans nucléase pour mettre en place les tubes de réaction NTC.
      NOTA : Diluer les amorces divergentes circulaires directes et inverses spécifiques de l’ARN de 100 μM et mélanger pour préparer une concentration de travail de 1 μM de mélange d’amorces circRNA avant et arrière; ainsi, la concentration finale de l’amorce est de 250 nM dans la réaction de 22 μL.
   4. Ajouter 11 μL de mélange maître dd-PCR, 5,5 μL de mélange d’amorces avant et arrière spécifique de l’ARNcirc d’une concentration de 1 μM et 5,5 μL d’ADNc (2 ng/μL) pour mettre en place les tubes de réaction d’essai.
   5. Vortex soigneusement suivi en centrifugeant brièvement tous les tubes de réaction pour obtenir un mélange réactionnel homogène au fond des tubes.
2. Génération de gouttelettes.
   1. Transférer les 20 μL de mélange PCR des tubes de PCR de 0,2 mL aux puits d’échantillon de la cartouche du générateur de gouttelettes.
   2. Ajouter soigneusement 70 μL d’huile génératrice de gouttelettes dans les puits de pétrole de la cartouche du générateur de gouttelettes à l’aide d’une pipette multicanal.
      REMARQUE: Incuber l’huile de génération de gouttelettes à température ambiante pendant 15 minutes avant utilisation.
   3. Couvrir la cartouche du générateur de gouttelettes avec le joint en caoutchouc et la placer dans la machine génératrice de gouttelettes pour obtenir le mélange échantillon-gouttelettes d’huile, généré dans les puits de gouttelettes de la cartouche.
3. Amplification PCR.
   1. Transférer 40 μL du mélange échantillon-gouttelettes d’huile des puits de gouttelettes de la cartouche génératrice de gouttelettes vers une plaque PCR de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanal.
      REMARQUE: Transférer délicatement le mélange échantillon-gouttelettes d’huile tout en faisant un angle par rapport aux puits à travers les extrémités de la pipette multicanal pour éviter de casser les gouttelettes lors de leur transfert sur la plaque dd-PCR 96 puits.
   2. Scellez la plaque PCR à 96 puits avec le scellant en aluminium, placez-la dans le bloc machine d’étanchéité à plaques préchauffé à 80 ° C et cliquez sur le joint pour sceller la plaque PCR.
   3. Maintenant, placez la plaque dans le thermocycleur dd-PCR et réglez le programme comme mentionné dans le tableau 2 avec la température du couvercle réglée à 105 °C et une vitesse de rampe de 2 °C / s.
4. Comptage des gouttelettes.
   1. Une fois la PCR terminée, placez la plaque sur le compteur de gouttelettes dd-PCR avec le porte-plaque dans la position correcte pour compter les gouttelettes.
   2. Ouvrez le logiciel d’analyse des gouttelettes et configurez l’exécution en saisissant les informations de l’échantillon.
   3. Cliquez sur l’option de configuration. Ensuite, cliquez sur l’option de modèle pour ouvrir un nouveau modèle.
   4. Définissez chaque puits en mettant les détails de l’expérience, tels que le nom de l’échantillon (ADNc utilisé ou témoin négatif ou NTC), le nom de la cible (nom de l’amorce circRNA) et le type (inconnu), et le type d’expérience comme ABS (quantification absolue) et Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilisés, etc.
   5. Enfin, enregistrez le modèle et démarrez l’exécution en cliquant sur l’option d’exécution et sélectionnez le comptage par ligne ou par colonne. Laissez la machine terminer le comptage des gouttelettes, qui prend environ 1 min / puits.
   6. Cliquez sur le bouton Analyser pour analyser les données une fois la lecture de la gouttelette terminée.
   7. Cliquez sur le bouton Amplitude 1D pour voir les gouttelettes positives et négatives
   8. Pour séparer les gouttelettes positives des gouttelettes négatives, placez une ligne de seuil commune pour tous les échantillons ayant la même cible.
      REMARQUE : Le nombre total de gouttelettes dans chaque échantillon doit être supérieur à 10 000 pour être pris en compte pour la quantification absolue. Le CNT ne devrait pas montrer de nombre de gouttelettes positif. La présence de gouttelettes positives dans le CNT indique une contamination des réactifs ou une amplification des dimères d’amorce. Il est difficile de savoir si les gouttelettes positives ont des dimères d’amorce ou des produits non spécifiques dans NTC. Il est conseillé de vérifier les amorces et d’éviter toute contamination des réactifs en tant que pratique générale pour toute PCR, y compris la dd-PCR.
   9. Cliquez sur le bouton Exporter pour exporter les données de comptage circRNA sous forme de fichier .csv. Les données exportées montrent le nombre de circRNA présents dans chaque échantillon.
   10. Calculez manuellement le nombre de circRNA dans chaque échantillon par nanogramme d’ARN en considérant la quantité totale d’ADNc utilisée dans chaque réaction.

Résultats

Le nombre absolu de circRNA dans chaque échantillon peut être dérivé des données dd-PCR exportées. L’analyse quantitative par PCR en temps réel a suggéré une expression différentielle de circBnc2 dans les myotubes C2C12 différenciés (données non présentées). Ici, nous voulions vérifier le nombre absolu de copies de circBnc2 dans les myoblastes et myotubes C2C12 proliférants. Puisque l’expression de circBnc2 est comparée dans deux conditions, il est vraiment important de tr...

Discussion

La recherche sur l’ARNcirc s’est développée au cours de la dernière décennie avec la découverte de technologies de séquençage à haut débit. En conséquence, il a été considéré comme une molécule potentielle pour les futurs traitements à ARN. En outre, il est connu pour agir comme biomarqueur dans plusieurs maladies, y compris le cancer et les maladies cardiovasculaires ^4,8. Cependant, l’identification du circRNA est délicate en raison de sa ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/