Imagerie de cellules vivantes de globes ex vivo intacts à l’aide d’un nouveau support imprimé en 3D

Résumé

Le présent travail décrit un nouveau protocole expérimental qui utilise un support imprimé en 3D pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution de globes énucléés. Grâce à ce protocole, l’activité de signalisation cellulaire du calcium dans l’épithélium cornéen blessé des globes ex vivo peut être observée en temps réel.

Résumé

La cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes est un processus migratoire initié par l’activation des récepteurs purinergiques exprimés sur les cellules épithéliales. Cette activation entraîne des événements de mobilisation du calcium qui se propagent de cellule en cellule, ce qui est essentiel pour initier la motilité cellulaire dans le lit de la plaie, favorisant une cicatrisation efficace de la plaie. Le laboratoire Trinkaus-Randall a développé une méthodologie pour imager la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes dans des globes murins ex vivo en temps réel. Cette approche consiste à énucléer un globe intact d’une souris qui a été euthanasiée selon les protocoles établis et à incuber immédiatement le globe avec un colorant indicateur de calcium. Une contre-coloration qui colore d’autres caractéristiques de la cellule peut être appliquée à ce stade pour aider à l’imagerie et montrer les points de repère cellulaires. Le protocole a bien fonctionné avec plusieurs colorants de cellules vivantes utilisés pour la contre-coloration, y compris l’actine SiR pour colorer l’actine et la coloration de membrane plasmique rouge foncé pour colorer la membrane cellulaire. Pour examiner la réponse à une plaie, l’épithélium cornéen est blessé à l’aide d’une aiguille de 25 G et les globes sont placés dans un support imprimé en 3D. Les dimensions du support imprimé en 3D sont calibrées pour assurer l’immobilisation du globe pendant toute la durée de l’expérience et peuvent être modifiées pour accueillir des yeux de différentes tailles. L’imagerie cellulaire vivante de la réponse de la plaie est réalisée en continu à différentes profondeurs dans tout le tissu au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole nous permet de générer des images haute résolution et de qualité publication à l’aide d’un objectif d’air 20x sur un microscope confocal. D’autres objectifs peuvent également être utilisés pour ce protocole. Il représente une amélioration significative de la qualité de l’imagerie des cellules vivantes dans les globes murins ex vivo et permet l’identification des nerfs et de l’épithélium.

Introduction

Cornée
La cornée est une structure avasculaire claire recouvrant la surface antérieure de l’œil qui réfracte la lumière pour permettre la vision et protéger l’intérieur de l’œil contre les dommages. Comme la cornée est exposée à l’environnement, elle est sensible aux dommages causés à la fois par des causes mécaniques (rayures) et par une infection. Une lésion cornéenne chez un patient par ailleurs en bonne santé guérit généralement en 1 à 3 jours. Cependant, chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, notamment un déficit en cellules souches limbiques et un diabète de type II, le processus de cicatrisation des plaies cornéennes peut être considérablement prolongé¹. La cornée étant fortement innervée, ces ulcères cornéens non cicatrisants et ces érosions cornéennes récurrentes sont très douloureux et diminuent grandement la qualité de vie des patients qui en souffrent¹.

Signalisation cellulaire
Lorsqu’une cornée par ailleurs saine est blessée, les événements de signalisation calcique dans les cellules adjacentes à la plaie précèdent et provoquent la migration cellulaire dans le lit de la plaie, où ils ferment la blessure sans risque de cicatrisation ^2,3. Ces événements de signalisation ont été bien caractérisés dans des modèles de culture de cellules épithéliales cornéennes utilisant l’imagerie de cellules vivantes². Des expériences préliminaires démontrent significativement plus de signalisation calcique après une lésion dans les cellules non diabétiques par rapport aux cellules diabétiques. Cependant, la caractérisation des événements de signalisation cellulaire dans les globes ex vivo s’est avérée être un défi technique.

Imagerie de cellules vivantes
Des études antérieures ont enregistré avec succès des événements de signalisation du calcium à partir de modèles de culture cellulaire in vitro de cicatrisation des plaies cornéennes ^4,5,6. Le développement d’une méthodologie pour produire des images de haute qualité de ces événements de signalisation dans des tissus ex vivo est d’un grand intérêt car cela permettrait l’étude de ces événements dans un système plus complexe et réaliste. Les approches précédentes ont impliqué la dissection de la cornée suivie d’une immobilisation dans un gel PEG induit par UV ^7,8,9. L’immobilisation est une étape essentielle mais difficile lorsque l’on travaille avec des tissus vivants, car ils doivent rester viables et hydratés tout au long de l’expérience. De plus, l’immobilisation ne doit pas endommager le tissu. Bien que la solution de PEG ait immobilisé le tissu, la résolution et la qualité des images produites n’étaient pas cohérentes. Par conséquent, les supports imprimés en 3D ont été développés pour immobiliser les globes intacts afin de produire des images de meilleure qualité avec moins de risque de lésions tissulaires.

L’approche
Un support unique imprimé en 3D a été développé pour immobiliser des globes ex vivo intacts pour l’imagerie de cellules vivantes. Ce support prévient les dommages provenant de deux sources principales: il permet l’imagerie d’un globe énucléé sans avoir besoin de disséquer la cornée, et il élimine l’exposition à la lumière UV. Sans ces sources de dommages, les images obtenues représentaient plus précisément la réponse aux blessures par égratignures faites expérimentalement. De plus, le support imprimé en 3D a été calibré aux dimensions précises de l’œil murin. Cela a fourni un bien meilleur ajustement que l’immobilisation dans la solution PEG, conduisant à une image de meilleure qualité à des objectifs de puissance inférieure en raison de la diminution du mouvement des tissus. Une barre de couverture fixée au sommet du support garantit que le globe reste immobile pendant toute la durée de l’expérience et qu’il n’y a pas de déplacement du globe lorsque le milieu de croissance est appliqué pour maintenir l’hydratation et la viabilité. La possibilité d’imprimer le support à des dimensions précises nous permet également de générer un ajustement optimal pour les yeux murins de différentes tailles en raison de l’âge ou de l’état de la maladie. Cette technologie peut être appliquée plus largement pour développer des supports pour les yeux de différentes espèces en fonction de leurs dimensions.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research et le protocole IACUC de l’Université de Boston (201800302).

1. Conception des supports imprimés en 3D et de la barre de couverture

1. Concevoir les supports imprimés en 3D et la barre de couverture en tenant compte du diamètre moyen des globes de souris et imprimer la conception en 3D (Figure 1A, B).
2. Gardez le diamètre de la paroi interne du support légèrement plus grand que le diamètre moyen du globe pour tenir compte des différentes tailles de souris individuelles. Maintenez la hauteur du support à environ la moitié du diamètre du globe, en assurant un ajustement serré du globe lorsqu’il est fixé par la barre de couverture imprimée en 3D.
3. Dimensionnez la barre de couverture du support à la longueur du diamètre extérieur du support avec une largeur comprise entre 1/4 et 1/2 du diamètre du support. La barre de couverture est dimensionnée pour permettre l’accès au globe lorsqu’il est fixé dans le support pour l’hydratation et le retrait de l’œil à la fin de l’expérience.
4. Imprimez le support et la barre de couverture.

2. Prélèvement d’échantillons

1. Euthanasier des souris (des souris mâles C57BL/6 âgées de 9 à 12 semaines et de 27 semaines ont été utilisées pour cette étude) en utilisant des protocoles établis conformément aux lignes directrices de l’établissement. Pour ce protocole, pratiquer l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une décapitation.
2. Retirez la tête de souris et placez-la immédiatement sur de la glace pour préserver la viabilité du tissu. Énucléez les globes à l’aide d’outils de dissection tout en prévenant les lésions tissulaires.
3. Proptose le globe à l’aide d’une pince à épiler. Coupez le nerf optique à l’aide de ciseaux à dissection juste en dessous de l’endroit où il est maintenu par la pince à épiler.
   REMARQUE: Pour plus de précautions, effectuez les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire.
4. Incuber les globes dans 2 mL de milieu dans une boîte de culture cellulaire p35 comprenant un indicateur de calcium et/ou une coloration de membrane cellulaire pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ dans des conditions de faible luminosité. Assurez-vous que les globes sont immergés dans le milieu de coloration pour une coloration uniforme.
   1. Pour les expériences réalisées ici, utilisez l’indicateur de calcium, Fluo4-AM (1:100)2, et la coloration de compteur de membrane cellulaire, coloration de membrane plasmique rouge foncé (1:10 000)2, avec une concentration finale de 1 % (v/v) de DMSO et 0,1 % (p/v) d’acide pluronique dans ² mL de milieu sans sérum kératinocytaire (KSFM) avec les suppléments de croissance suivants : extrait hypophysaire bovin de 25 μg/mL, 0,02 nM de facteur de croissance épidermique, 0,3 mM CaCl2 et pénicilline-streptomycine (100 unités/mL et 100 μg/mL, respectivement).
      REMARQUE: Les conditions et les temps d’incubation sont variables en fonction de l’indicateur de calcium, du type de tissu et du volume de l’échantillon. Lors de l’utilisation de l’acide pluronique, la prudence est recommandée car il rend les tissus perméables. Ce protocole fait appel à 10% d’acide pluronique. Des concentrations plus faibles d’acide pluronique ont été déterminées expérimentalement comme étant inefficaces, et des concentrations plus élevées risquent d’endommager les tissus.

3. Préparation des porte-échantillons

1. Collez les supports à un couvercle à fond de verre propre avec de la colle qui n’a pas été utilisée auparavant. La colle utilisée dans ce protocole provient de contenants à usage unique pour assurer la stérilité et un nouveau récipient non ouvert est utilisé à chaque fois.
2. Lavez le support dans de l’éthanol à 70%. Placez la colle sur le support et collez le support au couvercle inférieur en verre. Assurez-vous qu’aucune colle ne se trouve dans la zone interne du support, car la colle peut devenir fluorescente, ce qui complique l’imagerie.
3. Attendez que la colle se solidifie. Vérifiez que le support est bien fixé contre le bordereau.
   NOTE: Des plaques de cellules P35 avec des lamelles de couverture à fond de verre ont été utilisées pour les expériences présentées dans ce manuscrit. D’autres lames et/ou plaques à fond de verre peuvent être remplacées en fonction des besoins de l’expérience.

4. Blessure des globes oculaires

1. Retirez les globes de la solution de coloration à l’aide de compte-gouttes oculaires stériles, en prenant soin d’éviter d’endommager les tissus de la région d’intérêt. Laver les globes pendant 5 minutes à température ambiante en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile pour éliminer l’excès de tache, et placer les globes dans le milieu pour le transport au microscope.
2. Enrouler les globes à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G dans la région d’intérêt.
   1. À l’aide d’un compte-gouttes stérile, ramasser et tenir le globe à l’arrière de l’œil. Cela gardera le globe stable, l’empêchera de rouler et permettra de faire des blessures constantes. En utilisant cette configuration, le nerf optique sera à l’intérieur de la buse du compte-gouttes et la cornée sera tournée vers l’extérieur.
   2. Pour une plaie en cas d’égratignure, déplacez doucement une aiguille stérile de 25 G sur la cornée exposée. Pour une plaie perforante, appuyez doucement l’aiguille directement dans la cornée centrale. Assurez-vous que la plaie ne perce pas la cornée.
      REMARQUE : ignorez cette étape si une réponse de plaie ou un environnement blessé n’est pas requis pour l’expérience. Des études antérieures ont montré que les plaies par égratignures et les plaies perforantes sur les cornées murines réalisées à l’aide de cette méthode sont cohérentes en diamètre et en profondeur¹⁰. La confirmation des dimensions de la plaie entre des globes indépendants a été réalisée à l’aide d’une analyse de région d’intérêt.

5. Placement de l’échantillon sur le support

1. Placez la cornée ou la région limbique sur la lamelle de couverture dans la zone interne du support et stabilisez-la à l’aide du couvercle imprimé en 3D (Figure 1C-H).
2. Vérifiez que le globe est correctement positionné et que le site d’intérêt est en contact avec la lamelle de couverture en verre. Une fois que le globe a été placé dans le support, n’essayez pas de retirer le globe car cela pourrait causer des dommages aux tissus.
3. Collez le couvercle imprimé en 3D au support à l’aide de colle, assurant ainsi la stabilisation. Assurez-vous que la barre de couverture adhère au support et non au globe.
   REMARQUE: La zone à imager est placée vers le bas car le protocole est écrit pour être utilisé sur un microscope inversé. Le protocole peut être adapté pour les microscopes verticaux en utilisant des supports avec un rayon intérieur plus petit et le retrait de la barre de couverture. Cela se traduira par moins de stabilisation du globe.

6. Imagerie des échantillons

1. Allumez le microscope et la chambre environnementale et vérifiez que la chambre est humidifiée. Régler la chambre environnementale à 35 °C et 5 % de CO₂ pendant toute la durée de l’expérience.
   REMARQUE: Les microscopes avec chambres environnementales sont préférables pour cette procédure afin de prévenir la déshydratation et de maintenir le globe à des températures optimales, mais ne sont pas nécessaires.
2. Placez la lamelle de couverture, le support et le globe stabilisé sur la platine du microscope dans la chambre environnementale et l’image à l’aide de techniques d’imagerie de cellules vivantes⁹.
3. Pipeter un milieu de croissance supplémentaire sur la lamelle de couverture pour prévenir la déshydratation et maintenir la viabilité des tissus. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de milieu dans le puits pour couvrir le globe dans le support. Selon la durée de l’imagerie, ajoutez un nouveau milieu au besoin tout au long de l’expérience.
4. Commencez des expériences à l’aide de techniques et de protocoles d’imagerie de cellules vivantes. Utilisez des réglages laser de faible puissance pour préserver le tissu et prévenir les dommages tissulaires dans les expériences de longue durée. Utilisez des objectifs appropriés pour les longues distances de travail. Les expériences de ce manuscrit ont été réalisées à l’aide d’un objectif 20x.
   REMARQUE: La puissance et le gain du laser, la durée expérimentale, l’emplacement et le plan d’imagerie sont tous des variables dépendant des paramètres expérimentaux. Des expériences d’imagerie sur des globes intacts d’une durée allant de 1 h à 4 h ont été réalisées avec succès dans des publications antérieures¹⁰.
5. Enregistrez et sauvegardez les données dans le format de fichier préféré. Le logiciel utilisé par le microscope produit des fichiers .czi pour l’enregistrement des données.
6. Éliminez les globes conformément aux protocoles institutionnels standard à la fin du protocole.

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour produire systématiquement des données et des images de qualité publication¹⁰. Les images obtenues représentent une amélioration significative par rapport aux approches précédentes (Figure 2). À l’aide du support imprimé en 3D, des images peuvent être capturées à travers les couches de la cornée, et la mobilisation du calcium dans différents plans z peut être observée (Figure 3). Cette a...

Discussion

Ce protocole décrit une technique d’imagerie de cellules vivantes qui utilise un support imprimé en 3D pour stabiliser et immobiliser les yeux intacts des animaux. Il est conçu pour contourner plusieurs inconvénients importants reconnus avec les protocoles précédents d’imagerie de cellules vivantes du tissu cornéen ex vivo . Ce protocole offre de nombreux avantages pour l’imagerie de cellules vivantes de globes intacts. Il réduit considérablement les dommages tissulaires inutiles qui pourraient in...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic	Creality (Shenzen, China)	N/A	Material for holder
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	Well for imaging.
Autodesk Fusion 360 software	Autodesk (San Rafael, CA).	N/A	Software used for printing the holders.
BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	For experimentally-induced wounds to the globes
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Complete Home Super Glue	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	For attaching the holder to the imaging well
Ender 3 Pro 3D printer	Creality (Shenzen, China)	N/A	For printing the holder
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	License Number: GPL2	Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid
Keratinocyte Serum-Free Medium	Gibco (Waltham, MA)	17005042	25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium
Phophate-Buffered Saline (PBS)	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	Used to wash excess stain off of corneas before imaging
Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	20x magnification objective was used