Hyperthermie générée par ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique: une méthode de traitement réalisable dans un modèle de rhabdomyosarcome murin

Résumé

Un protocole d’utilisation de l’hyperthermie contrôlée, générée par des ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique, pour déclencher la libération de médicaments à partir de liposomes sensibles à la température dans un modèle murin de rhabdomyosarcome.

Résumé

Les ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique (MRgHIFU) sont une méthode établie pour produire une hyperthermie localisée. Compte tenu de l’imagerie en temps réel et de la modulation acoustique de l’énergie, cette modalité permet un contrôle précis de la température dans une zone définie. De nombreuses applications thermiques sont explorées avec cette technologie non invasive et non ionisante, telle que la génération d’hyperthermie, pour libérer des médicaments à partir de transporteurs liposomaux thermosensibles. Ces médicaments peuvent inclure des chimiothérapies telles que la doxorubicine, pour lesquelles une libération ciblée est souhaitée en raison des effets secondaires systémiques limitant la dose, à savoir la cardiotoxicité. La doxorubicine est un pilier pour le traitement d’une variété de tumeurs malignes et est couramment utilisée dans le rhabdomyosarcome (RMS) récidivant ou récurrent. RMS est la tumeur extracrânienne des tissus mous solides la plus courante chez les enfants et les jeunes adultes. Malgré une thérapie multimodale agressive, les taux de survie au RMS sont restés les mêmes au cours des 30 dernières années. Pour explorer une solution pour répondre à ce besoin non satisfait, un protocole expérimental a été développé pour évaluer la libération de doxorubicine liposomale thermosensible (TLD) dans un modèle murin RMS syngénique immunocompétent en utilisant MRgHIFU comme source d’hyperthermie pour la libération de médicaments.

Introduction

Le rhabdomyosarcome (RMS) est une tumeur musculaire squelettique qui survient le plus souvent chez les enfants et les jeunes adultes¹. La maladie localisée est souvent traitée par un traitement multimodal, y compris la chimiothérapie, les rayonnements ionisants et la chirurgie. L’utilisation de schémas de chimiothérapie multimédicaments est plus fréquente chez les patients pédiatriques, avec de meilleurs résultats par rapport à leurs homologues adultes²; Cependant, malgré les efforts de recherche en cours, le taux de survie à 5 ans reste autour de 30% dans la forme la plus agressive de la maladie ^3,4. La norme de soins de chimiothérapie est un régime multimédicamenteux qui comprend la vincristine, le cyclophosphamide et l’actinomycine D. En cas de récidive ou de récidive, d’autres chimiothérapies sont utilisées, notamment la doxorubicine standard (libre) et l’ifosfamide¹. Alors que toutes ces chimiothérapies ont des toxicités systémiques, la cardiotoxicité de la doxorubicine impose une limitation de dose à vie ^5-7. Pour augmenter la quantité de médicament délivrée à la tumeur et minimiser la toxicité systémique, des formulations alternatives ont été développées, y compris l’encapsulation liposomale. Il peut s’agir de doxorubicine non thermosensible, qui a été approuvée pour le traitement du cancer du sein et du carcinome hépatocellulaire, ou de doxorubicine thermosensible, pour laquelle des essais cliniques sont en cours 8,9,10,11,12,13. Des méthodes alternatives pour administrer des médicaments encapsulés liposomaux tels que les liposomes multi-vésiculaires et les liposomes ciblés par ligand ont été évaluées et sont prometteuses pour le traitement des tumeurs⁹. Dans cette étude, l’ajout de chaleur a des impacts multifactoriels, y compris la libération de médicaments¹⁴. La combinaison de l’hyperthermie (HT) générée par des ultrasons focalisés de haute intensité guidés par résonance magnétique (MRgHIFU) et de la doxorubicine liposomale thermosensible (TLD) est une nouvelle approche thérapeutique multimodale pour utiliser ce médicament toxique mais efficace pour traiter les RMS, tout en minimisant la toxicité limitant la dose et en augmentant potentiellement la réponse immunitaire à la tumeur.

La doxorubicine libère rapidement de TLD à des températures de >39 °C, bien supérieures à la température moyenne du corps humain de 37 °C, mais pas assez élevées pour causer des lésions tissulaires ou une ablation; cela commence à se produire à 43 °C, mais se produit plus rapidement lorsque les températures approchent 60 °C¹⁵. Diverses méthodes ont été utilisées pour générer l’HT in vivo, y compris les lasers, les micro-ondes, l’ablation par radiofréquence et les ultrasons focalisés, dont beaucoup sont des méthodes de chauffage invasives¹⁶. MRgHIFU est une méthode de chauffage non invasive et non ionisante qui facilite les réglages précis de la température dans le tissu cible in situ. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) fournit une imagerie en temps réel, où un logiciel informatique peut être utilisé, pour calculer une mesure thermométrique du tissu tout au long du traitement; Par la suite, ces données peuvent être utilisées pour contrôler la thérapie par ultrasons en temps réel afin d’atteindre et de maintenir un point de consigne de température souhaité¹⁷. MRgHIFU a été testé dans différents types de tissus et peut être utilisé pour une large gamme de traitements thermiques, de l’HT légère à l’ablation, ainsi que cliniquement pour traiter avec succès les métastases osseuses douloureuses¹⁸. De plus, il a été démontré que l’HT provoque une cytotoxicité tumorale, module l’expression des protéines et modifie la réponse immunitaire dans le microenvironnement tumoral 19,20,21,22. Une étude a combiné une HT légère avec TLD, suivie d’une ablation avec MRgHIFU, dans un modèle de rat R1 synergique²³, entraînant une nécrose dans le noyau tumoral et l’administration de médicaments à la périphérie. Traditionnellement, la radiothérapie a été utilisée comme traitement d’appoint pour endommager les cellules tumorales et diminuer la récurrence locale de la maladie. Cependant, son utilisation est limitée par le dosage à vie et les dommages hors cible¹. Ainsi, l’HT est unique en ce sens qu’elle peut causer certains des mêmes effets sans les mêmes toxicités ou limitations.

Les modèles animaux précliniques pour RMS comprennent des modèles immunocompétents syngéniques et des xénogreffes dérivées de patients (PDX) chez des hôtes immunodéprimés. Bien que les modèles immunodéprimés permettent la croissance des tumeurs humaines, ils manquent du microenvironnement tumoral approprié et sont limités dans leur capacité à étudier la réponse immunitaire²⁴. La mutation activant le FGFR4 est un marqueur prometteur d’un mauvais pronostic et une cible thérapeutique potentielle chez les RMS ^1,25 chez l’adulte et l’enfant. Dans les modèles RMS syngéniques développés dans le laboratoire de Gladdy, les tumeurs sont capables de se développer chez un hôte immunocompétent, qui développe des réponses immunitaires innées et adaptatives à la tumeur²⁶. Comme l’HT influence la réponse immunitaire, l’observation du changement de la réponse immunitaire murine est un avantage précieux de ce modèle tumoral. Pour tester à la fois la réponse tumorale à la TLD par rapport à la DF, ainsi que le changement de la réponse immunitaire de la tumeur à la chimiothérapie et à l’HT, un protocole a été développé et utilisé pour traiter les tumeurs RMS murines syngéniques in vivo en utilisant MRgHIFU et TLD, qui est l’objet de cette étude.

Protocole

La recherche a été effectuée conformément aux protocoles approuvés d’utilisation des animaux par les comités de protection des animaux sous la direction d’un vétérinaire superviseur dans les installations de recherche sur les animaux du Centre de phénogénomique (TCP) et du Centre de ressources animales (CEI) du Réseau universitaire de santé (RUS). Toutes les procédures, à l’exception de l’UFHIg, impliquant les animaux ont été effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) afin de minimiser l’exposition des animaux à l’air extérieur ou aux infections sensibles.

1. Elevage de souris

REMARQUE : Au total, 65 souris (souche B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J) ont été incluses dans l’étude pilote (mâles : n = 23; femelles : n = 42). Des souris mâles et femelles ont été utilisées à l’âge de 7 à 9 semaines. Leurs petits ont été sevrés et génotypés, et les souris hétérozygotes p53 ont été utilisées pour les expériences.

1. Hébergez deux souris femelles avec chaque souris mâle pour créer des cages de reproduction. Compter l’âge de leurs chiots depuis la naissance (naissance = jour 0).
2. Au jour 10, identifiez les chiots avec une encoche auriculaire. Recueillir des extraits de queue pour le génotypage avant l’injection de lignées cellulaires.

2. Génotypage de la souris

1. Extraire l’ADN des rognures de queue de 2 mm prélevées à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN commerciale (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant.
2. Déterminer la concentration et la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance à 260-280 nm sur un spectrophotomètre (voir le tableau des matériaux).
3. Effectuer une réaction en chaîne de la polymérase (PCR).
   1. Créer un mélange principal contenant un mélange PCR commercial (contenant de la Taq polymérase, du dNTPS et du MgCl 2; voir le tableau des matériaux), un apprêt etdH₂ O dans un rapport de 12,5:0,25:10,75 (μL) pour le nombre d’échantillons requis. Ajouter 1 μL d’échantillon d’ADN à chaque tube de PCR et inclure dH₂O, un échantillon nul (homozygote pour la mutation p53), un échantillon hétérozygote (hétérozygote pour la mutation p53) et un échantillon de type sauvage (homozygote pour p53 normal) comme témoins PCR.
   2. Ajouter 24 μL du mélange principal à chaque tube de PCR contenant de l’ADN. Pipeter la solution dans chaque tube de PCR de haut en bas pour répartir l’ADN dans tout le mélange maître.
   3. Placer les tubes de réaction dans un thermocycleur et effectuer un cycle selon les spécifications suivantes : 95 °C pendant 2 min, 40 cycles de 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 1 min, puis maintenir à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à analyser sur le gel.
4. Analyser les produits PCR à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose.
   1. Préparer un gel à 2 % (50 mL de 1x TAE et 1 g d’agarose) en chauffant l’agarose dans le TAE et en mélangeant jusqu’à dissolution. Une fois refroidi et encore liquide, ajoutez 2,5 μL de coloration de gel d’ADN à l’agarose et mélangez. Jetez le gel dans une boîte de gel avec un peigne. Placer le gel dans l’appareil électrophorétique (voir tableau des matériaux) et couvrir de 1x TAE.
   2. Chargez 10 μL d’échelle d’ADN de 1 kB sur le gel. Charge 12,5 μL de chaque échantillon. Faites couler le gel pendant 25 min à 135 V.
   3. Imagez le gel en utilisant les réglages appropriés pour la coloration de gel d’ADN utilisée sur un imageur de gel (voir le tableau des matériaux), conformément aux instructions du fabricant.

3. Préparation du modèle tumoral (Figure 1)

1. Cultiver la lignée cellulaire M25FV24C (passage 12-15) 1 semaine avant la date d’injection dans un milieu de culture complet (milieu Eagle modifié [DMEM] de Dulbecco avec additifs : 10 % FBS, 1 % Pénicilline/streptomycine et 2 mM de dipeptide de L-alanyl-L-glutamine) dans une fiole de 75 mL, à 37 °C et 5 % de CO₂. Une fois que les cellules sont ~80% confluentes, aspirer le média et laver les cellules 1x avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS).
   REMARQUE: M25FV24C est une lignée cellulaire murine conçue pour surexprimer le FGFR4^V550E mutant, qui est observée chez RMS ^1,26 pédiatrique et adulte.
2. Soulevez les cellules en ajoutant 0,5 mL de solution de trypsine à 0,25% sur le côté de la plaque et en incubant le récipient pendant 2-3 minutes à température ambiante. Une fois que les cellules semblent détachées, ajouter 2,5 mL de milieu de culture complet à température ambiante pour inactiver la trypsine. Utiliser une aliquote d’échantillon de 10 μL pour déterminer la concentration cellulaire des cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et d’une exclusion du bleu de trypan.
3. Préparer le volume correct de cellules en suspension de DPBS pour injection et les placer dans un tube à microcentrifuger de 1,5 mL : volume à centrifuger = (nombre de souris × nombre de cellules par souris)/ (concentration de cellules), où le nombre de souris = les souris à injecter + 10 souris supplémentaires pour erreur, et le nombre de cellules par souris = 10⁴.
4. Centrifuger pendant 5 min à 153 x g. Resuspendre la pastille cellulaire dans le volume approprié (10 μL par souris × nombre de souris) de tampon de myo-injection (milieu F10 + 0,5% FBS) et injecter les souris dans les 1 h suivant la préparation de cette suspension.

4. Injection intramusculaire de cellules

REMARQUE: Les cellules M25FV24C sont injectées dans le membre postérieur droit de souris âgées de 4 à 6 semaines. L’injection à 4 semaines produit une petite souris avec une tumeur qui peut être plus difficile à traiter car il y a moins de tissu environnant pour la dispersion HT; Attendre jusqu’à 6 semaines donne une souris plus grande, ce qui facilite le traitement de la tumeur.

1. Inversez la suspension cellulaire plusieurs fois avant l’aspiration pour aider à répartir uniformément les cellules dans la solution. Aspirer 10 μL (10 à 4 cellules)^à l’aide d’une seringue de microlitre (voir le tableau des matières). Scruff la souris; Une fois maîtrisé, l’accès aux muscles caudales de la cuisse peut être obtenu en étendant la patte postérieure. Rasez la jambe à l’aide de tondeuses et essuyez avec de l’éthanol à 70%.
2. Injectez la suspension cellulaire M25FV24C (10 μL, 10 4 cellules) dans la musculature de la cuisse du membre postérieur droit d’une souris âgée de⁴ à 6 semaines à l’aide d’une seringue de microlitre étanche aux gaz avec une aiguille de 26s G.
   REMARQUE: L’aiguille doit être insérée parallèlement au fémur vers le genou, en prenant soin de ne pas frapper le nerf sciatique. N’insérez que la pointe de l’aiguille (environ 2 mm) en raison de la petite masse musculaire du membre postérieur.
3. Administrer la solution dans un mouvement régulier. Retirez l’aiguille et assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement. Remettez la souris dans une deuxième cage.
4. Évaluez quotidiennement les animaux et surveillez leurs membres postérieurs pour la croissance tumorale par palpation. Euthanasier les souris en utilisant du dioxyde de carbone si l’un des critères d’évaluation précoces suivants est rencontré: taille de la tumeur supérieure à 1,5 cm de diamètre, ulcération de la tumeur ou signes systémiques de maladie (piloérection, posture voûtée, inactivité ou diminution de la consommation de nourriture ou d’eau).

5. Dépistage de l’IRM

1. Anesthésier la souris, à un niveau où il n’y a pas de mouvement avec la compression des pattes, avec de l’isoflurane sous les paramètres suivants: induire dans une chambre avec 4% à 1,5 LPM, puis transférer dans le cône de nez sur le traîneau du scanner IRM et continuer le maintien de l’isoflurane sur le cône nasal avec 1,5%-2% à 0,75 LPM. Fixez le moniteur respiratoire. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Imagez la souris anesthésiée à l’aide du scanner IRM (voir le tableau des matériaux). Sur l’image pondérée en T2 (Ax_Screen acquisition, tableau 1), notez les dimensions dans le plan et le nombre de tranches axiales dans lesquelles la tumeur apparaît. Notez l’emplacement de la tumeur par rapport au fémur et à la surface latérale de la cuisse, où l’onde ultrasonore entrerait.
   REMARQUE: La tumeur apparaît comme une masse hyperintense dans le muscle qui est asymétrique du côté opposé. Une bonne taille de tumeur de départ pour plusieurs traitements est de 2 mm x 2 mm x 2 mm pour les études aiguës ou de survie. S’il est beaucoup plus grand, il ne sera bon que pour les études aiguës car la tumeur atteindra un point final de taille avant de terminer trois traitements hebdomadaires. Les critères d’exclusion pour le traitement HIFU comprennent: enroulé autour du fémur, trop près du fémur, trop postérieur sur la souris, médial au fémur, trop près du rectum.
3. Retirez la souris du scanner et obtenez un poids de référence. Rasez la souris du milieu du corps jusqu’aux pieds sous anesthésie avec un rasoir électrique.
   REMARQUE: Idéalement, le rasage est effectué 1 jour avant le traitement, car il permet à la souris d’effectuer un toilettage, ce qui permet à la crème dépilatoire de fonctionner plus efficacement.
4. Récupérez la souris dans l’ESB à l’aide d’un coussin chauffant sous une extrémité de la cage. Remettez la souris dans sa cage lorsqu’elle retrouve sa position couchée sternale.

6. Expérience : Préparation animale de jour de traitement HIFU

1. Pour préparer le système HIFU de petit calibre (voir le tableau des matériaux), allumez le générateur et remplissez le transducteur avec suffisamment d’eau désionisée jusqu’à ce que la membrane soit dilatée sous le transducteur, mais pas au point de comprimer la souris. Dégazer l’eau dans le circuit du transducteur pendant 30 min pour éliminer l’oxygène dissous du milieu.
2. Préparez le système informatique associé.
   1. Allumez l’ordinateur de contrôle et assurez-vous qu’il est connecté via Ethernet au générateur HIFU et via USB à l’écran de la sonde thermique. Démarrez le logiciel et cliquez sur Home to home the transducter avant d’insérer la souris.
   2. Calibrer les sondes thermiques à fibre optique : Obtenez les températures ambiantes de base et notez le changement de température dans la salle d’IRM. Notez l’ampleur de la dérive de température pour chaque sonde due à l’intensité du champ magnétique. Insérez la sonde de température du tube de dérive dans un tube en verre rempli de gadolinium pour l’étalonnage de la température pendant le balayage et fixez le tube de dérive avec du ruban adhésif.
      REMARQUE: La température ambiante de base (tube de dérive) est ajoutée manuellement en tant que paramètre de thermométrie dans l’interface graphique du logiciel. Une région d’intérêt (ROI) est définie dans le tube de dérive dans l’image MR pour détecter toute dérive de température et corrigera automatiquement les images thermométriques.
   3. Prélever le médicament à injecter dans une seringue de 1 mL et le placer dans la pompe d’administration automatique (voir le tableau des matériaux). Amorcez la ligne qui se connectera au cathéter de la veine de la queue de la souris jusqu’à ce que le médicament ait complètement rempli la ligne en appuyant sur le bouton d’administration manuelle de la pompe d’administration automatique.
   4. Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer les souris dans les cages pendant ~20 minutes avant le transfert dans la chambre anesthésique.
      NOTE: Le préchauffage favorise la vasodilatation, qui se rencontrera dès que la souris est anesthésiée et aide à la mise en place du cathéter.
3. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (induction : 4 % à 1,5 LPM ; entretien : 1,5 %-2 % à 0,75 LPM) et transférer dans un cône nasal. Appliquez un lubrifiant cornéen sur les yeux pour éviter les dommages dus à l’absence de réflexe de clignement sous anesthésie.
4. Appliquez de la crème dépilatoire sur la zone rasée, y compris tout le membre postérieur droit, et suivez les instructions du fabricant pour l’épilation.
   REMARQUE: Placez la souris sous une lampe chauffante pendant l’ESB pour aider à la thermorégulation pendant l’épilation sous anesthésie.
5. Après avoir lavé la crème dépilatoire à l’eau tiède, pesez la souris sur une balance numérique et enregistrez le dosage du médicament.
6. Déplacez la souris vers un cône nasal compatible IRM sur le traîneau IRM. Placez une lampe chauffante sur la souris pour la garder au chaud pendant la préparation de l’IRM. Placez la souris en position de décubitus latéral avec le côté porteur non tumoral vers le bas et la tumeur supérieure à l’intérieur d’un porte-souris imprimé en 3D sur le traîneau (Figure 1 et Figure 2 supplémentaires). Assurer le bon positionnement de la tumeur (c’est-à-dire au centre de la bobine horizontalement et verticalement, avec la hauteur juste au-dessus des bords du porte-souris pour tenir compte de la compression par le transducteur à ultrasons).
   REMARQUE: Si nécessaire, coupez un segment de tampon de gel à ultrasons comprimé à placer sous la souris, tapissant le bas du support, avec une épaisseur pour niveler la tumeur vers le haut du support.
7. Éloignez la jambe non impliquée de la jambe tumorale, soit sous la souris, soit étendue avec la jambe tumorale fléchie. Assurez-vous que les pieds ne sont pas dans le champ proche ou éloigné de la tumeur et le chemin du faisceau d’ultrasons. Placez la lampe chauffante à 15 cm de la queue pour la réchauffer pour l’insertion du cathéter dans la veine de la queue.
8. Insérez la sonde de température œsophagienne.
   1. Enfilez la sonde œsophagienne à travers le cône nasal et frottez le cou de la souris. Inclinez le nez de la souris vers le haut pour créer une ligne de sa bouche directement à son estomac en étendant la tête. Faites glisser la sonde thermique au-dessus de la langue d’environ 0,5 cm dans l’œsophage de la souris et replacez le cône nasal autour du nez de la souris. Fixez la sonde œsophagienne et le cône nasal au sommet du traîneau.
      REMARQUE: Surveillez les signes de détresse respiratoire immédiatement après l’insertion, car il peut être mal inséré dans la trachée.
9. Insérez la sonde de température rectale.
   REMARQUE : Les sondes de température rectale et œsophagienne doivent être à moins de 3 °C l’une de l’autre.
10. Placez le moniteur respiratoire avec le câble de connexion vers la tête de la souris afin qu’il n’interfère pas avec le placement du transducteur à ultrasons. Sécurisez avec des bandes.
11. Insérez un cathéter veineux de queue à aiguille papillon de 27 G dans une veine latérale de la queue fixée à un microtube avec 20 μL d’espace mort et du ruban adhésif solidement. Après le bandage, assurez-vous que le cathéter est toujours bien rincé.
12. Utilisez deux personnes pour transporter la souris préparée, le traîneau de souris, la ligne d’anesthésie, la ligne respiratoire, le cathéter de la veine de la queue et les cordons de sonde thermique dans le scanner IRM et placez-les dans le support de traîneau IRM.
13. Demander à l’opérateur du logiciel HIFU (voir tableau des matériaux) de déplacer le ménisque du transducteur directement au-dessus de la tumeur par inspection visuelle pour un alignement initial²⁷. Appliquez un lubrifiant pour les yeux ou un gel à ultrasons dégazé sur la peau glabre au-dessus de la tumeur et couplez le transducteur HIFU à la zone tumorale.
14. Connectez la conduite d’administration du médicament de la pompe automatique au cathéter de la veine de la queue. Calculez la quantité d’espace mort dans la ligne de veine de queue et la ligne de connexion. Faites glisser le traîneau HIFU de la souris sur des rails IRM au centre de l’IRM.
15. Réglez la quantité de perfusion de médicament sur la pompe, en fonction du type de médicament, de la concentration et du poids de l’animal, et ajoutez la quantité d’espace mort. Réglez la pompe à un débit de perfusion de 200 μL/min.
    REMARQUE : Dans cette étude, la FD et la TLD ont été utilisées à une concentration de 2 mg/mL et à une dose de 5 mg/kg de poids corporel.
16. Enregistrez les températures de base de la sonde thermique.
17. Placez le dispositif de réchauffement par convection d’air (voir le tableau des matériaux) sur le réglage le plus chaud. Pointez le tube soufflant de l’air vers la souris au centre de l’alésage IRM et fixez-le avec du ruban adhésif. Le dispositif de réchauffement sera ensuite tourné à son réglage le plus bas (32 ° C) pour éviter la surchauffe de la souris pendant la sonication.
18. Acquérir les images IRM de l’enquête (Ax_Loc, Sag_Loc; Tableau 1) pour déterminer l’emplacement de la tumeur pour le ciblage de la sonication, y compris la profondeur. Ajustez la position du transducteur en conséquence à l’aide du logiciel HIFU en insérant la distance de mouvement souhaitée telle que mesurée sur l’image, puis en cliquant sur la direction de la flèche pour vous déplacer (Figure 3A). Notez également l’emplacement du tube de dérive. Répétez l’opération si nécessaire.
19. Déterminez l’emplacement de la tache focale du transducteur dans le plan coronal en effectuant une brève sonication continue de 5 s x 50 mV pendant l’acquisition de la thermométrie Test_Shot (Tableau 1).
20. Alignez les images de l’enquête IRM avec la vue coronale du point focal dans le logiciel HIFU. Examinez les images pour l’emplacement de la tumeur, par rapport à la structure osseuse et au rectum, et révisez le positionnement du transducteur si nécessaire.
21. Répétez la sonication de tir d’essai pendant l’imagerie thermique à neuf répétitions (tableau 1) pour confirmer s’il y a un échauffement uniforme et précis dans le volume de la tumeur avec un chauffage hors cible minimal. Ajustez l’emplacement de la tranche, l’emplacement du transducteur et la profondeur de direction, et confirmez les performances de chauffage en répétant les « tirs d’essai » si nécessaire.
22. À l’aide du logiciel de surveillance du traitement HIFU, définissez le retour sur investissement pour la surveillance thermométrique dans le profil de chauffage final en mesurant la distance à parcourir, puis en modifiant les coordonnées de la grille dans le programme. Définissez un retour sur investissement autour du tube de dérive pour la correction de la dérive. Entrez la température de base en fonction de la température de la sonde rectale pour les mesures thermométriques. Le système HIFU est utilisé pour initier la sonication du traitement HIFU et pour la surveillance thermométrique.
23. Ouvrez les spécifications de traitement de l’hyperthermie de 20 minutes dans le logiciel et démarrez la sonication une fois que les images RM de référence sont collectées et que la thermométrie commence.
24. Effectuez un traitement de 20 minutes (Figure 3B) pendant l’imagerie thermique (Tableau 1) à l’aide du logiciel de contrôleur intégré à dérivée proportionnelle intégrative (PID). Injectez le médicament sélectionné à 1,5 min, après que la température dans le ROI se réchauffe à la température souhaitée (40 ° C).
25. Surveiller la température à cœur tout au long du traitement. Si la température rectale augmente rapidement pendant le traitement, un repositionnement de la souris peut être nécessaire pour éviter le réchauffement rectal pendant la durée du traitement de 10 ou 20 minutes. Arrêtez le traitement si la température rectale augmente à >40 °C.

7. Expérience : Imagerie de modèle murin et procédure de sonication pour les études aiguës

1. Une fois le traitement terminé, retirez la souris de l’alésage IRM, en assurant l’hémostase au site d’insertion du cathéter de la veine de la queue. Transférez la souris à l’ESB et placez-la sur le cône nasal pour une anesthésie continue.
2. Placez la souris sur son dos sur un tampon absorbant bleu avec ses membres retenus et le cœur exposé.
3. Euthanasier les souris par exsanguination par ponction cardiaque suivie de l’ablation du cœur. Prélever le sang immédiatement et centrifuger pour la séparation plasmatique à 10 621 x g pendant 10 min.
4. Effectuer une nécropsie et entreposer les organes au besoin pour l’analyse. Congeler les organes dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C pendant plusieurs mois ou à long terme dans un réservoir d’azote liquide.
5. Homogénéiser mécaniquement le tissu tumoral en ajoutant un excès neuf fois (p / p) d’eau désionisée et en décomposant le tissu à l’aide d’un homogénéisateur battant les perles. Extraire la doxorubicine de 600 μL de tissu homogénéisé en ajoutant séquentiellement 75 μL de nitrate d’argent à 300 mg/mL, 75 μL d’acide sulfurique 10 mM et 2,5 mL d’isopropanol:chloroforme 1:1. Vortex pendant 20 min et conserver à −20 °C pendant la nuit.
6. Pour préparer les échantillons pour la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), centrifuger la solution de l’étape 7.5 à 4 500 x g, retirer la couche de solvant organique et sécher l’isopropanol:chloroforme sous un flux d’azote gazeux. Resuspendre dans 100 μL de 2:1 MeOH:H₂O. Mesurer la concentration de doxorubicine à l’aide de la CLHP-MS/^{MS 28}.

8. Expérience : Imagerie de modèle murin et procédure de sonication pour les études de survie

REMARQUE : Pour les études de survie, suivre la procédure de préparation de jour du traitement HIFU chez l’animal (étapes 6.1 à 6.25).

1. Une fois le traitement terminé, placez la souris sous une lampe chauffante pour lui permettre de récupérer et surveillez sa respiration et ses mouvements jusqu’à ce qu’elle retrouve une position couchée sternale. Ensuite, remettez l’animal dans sa cage.
   REMARQUE: Assurez-vous que la moitié de la cage est alignée avec une lampe chauffante, car la régulation thermique des animaux est affectée par l’anesthésie et le traitement HT.
2. Surveillez quotidiennement le comportement, les habitudes alimentaires et la fréquence respiratoire des souris pour détecter tout signe de détresse.
3. Effectuez des traitements une fois par semaine en suivant les étapes 6.1 à 6.25 pendant 3 semaines consécutives.
4. Deux fois par semaine, effectuez une imagerie IRM des souris pour la mesure de la tumeur. Pendant les semaines de traitement, effectuez une IRM et une échographie chaque semaine. Une fois le traitement terminé, effectuez une imagerie échographique bihebdomadaire.
5. Euthanasier la souris 60 jours après la fin de la série de traitements, ou lorsqu’un critère d’évaluation humain a été atteint (taille de la tumeur >1,5 cm³ ou morbidité de la tumeur), suivi d’une nécropsie avec prélèvement de la tumeur et des organes pour analyse.

Résultats

En utilisant le protocole d’hyperthermie généré par MRgHIFU, les tumeurs du membre postérieur ont pu être chauffées de manière constante à la température de consigne souhaitée pendant la durée du traitement (la figure 4 montre un traitement représentatif, 10 ou 20 min, n = 65). Pour considérer qu’un traitement est réussi, le retour sur investissement devait être maintenu au-dessus de 39 °C pendant toute la durée du traitement, avec une variation de <6 °C tout au long du...

Discussion

Le protocole développé ici a été utilisé pour cibler les tumeurs des membres postérieurs en utilisant MRgHIFU pour un traitement HT léger et libérer des médicaments encapsulés à partir de liposomes in vivo. Plusieurs étapes critiques ont été rencontrées dans ce protocole au cours de l’étude pilote, et l’optimisation de ces étapes critiques explique l’amélioration du succès du traitement par rapport à l’étude pilote. Le premier est l’élimination complète des poils sur la zone à s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08