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  • Protocole
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole fournit une stratégie de combinaison de deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le protocole fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la médecine traditionnelle chinoise (MTC).

Résumé

Compte tenu des avantages de la combinaison de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) dans le traitement de l’ischémie cérébrale, nous avons étudié les différences d’efficacité et de mécanisme entre la combinaison de préparation et la combinaison de composants afin d’explorer la stratégie de combinaison à deux herbes pour traiter les cellules PC12 blessées. Le chlorure de cobalt (CoCl2) combiné à un milieu sans glucose a été utilisé pour induire des dommages oxydatifs des cellules PC12. Ensuite, la combinaison optimale d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) injection a été sélectionnée et combinée selon des méthodes de conception uniformes après criblage de leur concentration sûre et efficace sur les cellules PC12. En outre, la combinaison de composants criblés comprend 10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarine et 75 μM d’acide chlorogénique dans deux herbes. Ensuite, le MTT, l’annexine V-FITC/PI, l’immunofluorescence et l’analyse par transfert Western ont été utilisés pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la combinaison de préparations et de la combinaison de composants sur les cellules PC12 lésées. Les résultats ont montré que la combinaison de préparation optimale pour la survie cellulaire pro-était l’injection d’Ast et la capsule d’Eri avec une concentration de 6: 1,8 (μM). La combinaison de composants (10 μM d’astragaloside A, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique) était plus efficace que la combinaison de préparation. Les deux combinaisons ont remarquablement réduit le taux apoptotique, l’intensité de fluorescence de la caspase-3 et le niveau intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS); pendant ce temps, ils ont régulé à la hausse les niveaux d’expression de p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax et Nrf2. Ces effets étaient plus évidents dans la combinaison de composants. En conclusion, les deux combinaisons peuvent inhiber la lésion induite par CoCl2 combiné avec un milieu sans glucose sur les cellules PC12, favorisant ainsi la survie cellulaire. Cependant, l’efficacité de la combinaison de composants par rapport à la combinaison de préparation peut être due à sa régulation plus forte de la voie de signalisation PI3K / Akt / Nrf2 liée au stress oxydatif et à l’apoptose.

Introduction

L’ischémie cérébrale chronique, causée par l’hypoperfusion cérébrale, est une maladie fréquente chez les personnes d’âge moyen et les personnes âgées1. En tant que maladie d’ischémie occulte à long terme, elle peut entraîner un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant. Les principaux mécanismes pathologiques comprennent l’apoptose cellulaire et les dommages oxydatifs, conduisant à un dysfonctionnement neurologique progressif ou persistant; c’est la base pathologique de la maladie d’Alzheimer, de la démence vasculaire et d’autres maladies, et affecte gravement la qualité de vie des patients. Cependant, il y a encore un manque de médicaments idéaux dans la médecine moderne pour traiter l’ischémie cérébrale chronique2. Dans le même temps, la combinaison d’Astragalus mongholicus (Ast) et d’Erigeron breviscapus (Eri) a été largement utilisée dans la pratique clinique de la médecine traditionnelle chinoise (MTC)4. La stratégie de combinaison s’est remarquablement améliorée pour favoriser la récupération de la fonction nerveuse après une ischémie cérébrale, ce qui est meilleur que celui d’un seul médicament; Cependant, il existe de grandes différences dans le rapport posologique dans la combinaison des deux médicaments4. Les composants efficaces et le mécanisme d’action ne sont pas bien définis, ce qui est la question clé limitant son application clinique.

Des études antérieures ont démontré l’effet synergique de la combinaison de préparation d’Ast injection et d’Eri injection dans le traitement de l’ischémie cérébrale chez le rat. Il peut réguler positivement l’expression de la protéine p-Akt et réguler à la baisse l’expression dela protéine 5,6 promotrice de la mort associée à Bcl-2 (BAD), qui est l’une des protéines de la famille B-lymphoblastome 2 (Bcl-2) et a pour effet de favoriser l’apoptose. Cependant, la base matérielle et le mécanisme de son effet synergique ne sont pas clairs. En outre, le modèle de lésion des cellules PC12 a été établi avec un milieu sans glucose combiné CoCl2, et la combinaison optimale de composants dans Ast et Eri a été examinée et définie7.

Dans cette étude, les doses efficaces d’Ast et d’Eri sont examinées à l’aide du modèle de cellules PC12 blessées. La combinaison optimale des deux médicaments est examinée à l’aide de ce modèle combiné à la méthode de conception homogène. Le modèle cellulaire est utilisé pour évaluer davantage la différence dans les effets et les mécanismes de la combinaison de préparation et de la combinaison de composants dans les cellules PC12 lésées. Cette stratégie vise à explorer l’effet protecteur et le mécanisme de régulation des deux types de combinaisons sur les cellules PC12 lésées par la voie du signal PI3K / Akt / Nrf2 afin de déterminer le meilleur mode de combinaison. Cette étude fournit une référence pour optimiser le meilleur mode d’application de la MTC.

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Protocole

1. Préparation du réactif

  1. Préparer le milieu complet en ajoutant 90 mL de DMEM à teneur élevée en sucre, 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 mL de solution de pénicilline-streptomycine dans une fiole de culture stérile de 125 mL. Mélanger le milieu complet et conserver à 4 °C dans des conditions fermées.
  2. Préparer la solution de CoCl 2 en ajoutant 0,02 g de poudre de CoCl2 (pesée avec précision) dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM (complètement dissous) pour obtenir une solution mère de 8,4 mM. Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,22 μm, la sceller et la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.
    NOTE: CoCl2 est instable et doit être stocké dans un récipient hermétique, à l’abri de la lumière; la durée de validité de la solution CoCl2 est de 7 jours.
  3. Préparer la solution de sel tamponné Tris-Hcl (TBST).
    1. Peser avec précision 8 g de chlorure de sodium, 0,2 g de chlorure de potassium et 3 g de Tris-base. Ajoutez-les dans un bécher de 1 L, puis ajoutez 1 000 mL d’eau osmosée pour dissoudre le mélange.
    2. Ajuster le pH à 7,4, ajouter 1 mL de Tween 20 et bien mélanger pour obtenir la solution TBST.
      REMARQUE: Tween 20 agit comme un tensioactif pour réduire la liaison non spécifique des anticorps aux antigènes et fonctionne mieux à une concentration de 0,1%.
  4. Préparer la solution de MTT (sel de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2)-2,5-diphényltétrazolium) en pesant 0,1 g de poudre de MTT dans 20 mL de solution de PBS pour obtenir une solution mère à 5 mg/mL. Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,22 μm, la sceller et la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière, placée en veille.
    REMARQUE: La poudre MTT est instable et absorbe facilement l’humidité, elle doit donc être stockée dans un endroit fermé et sec à l’abri de la lumière. La solution MTT expire après 7 jours. Le MTT a un effet cancérigène, évitez donc tout contact direct avec la peau.
  5. Préparer la solution de gélule d’Eri en retirant l’enveloppe de la gélule et en pesant avec précision 0,18 g du contenu dans 10 mL de milieu sans sucre DMEM pour préparer une solution mère de 100 μM (basée sur la concentration de scutellarin). Filtrer la solution avec un filtre bactérien de 0,2 μm, la sceller et la conserver dans un récipient hermétique à 4 °C.
    REMARQUE: La scutellarine est le principal ingrédient actif d’Erigeron breviscapus. La concentration de scutellarine dans les capsules a été déterminée par CLHP-UV à 2,56 mg/g, soit 5,54 μmol/g8. La concentration de la préparation est calculée en fonction de la concentration en scutellarine. Ceci est pratique pour évaluer l’activité pharmacologique de la préparation et du composant.
  6. Préparer la solution de l’injection d’Ast en ajoutant 5 mL d’injection et 5 mL de milieu DMEM sans sucre dans un tube centrifuge stérile de 15 mL pour préparer une solution mère de 60 μM (basée sur la concentration d’astragaloside A). Filtrer la solution à travers un filtre bactérien de 0,2 μm et la conserver dans un récipient hermétique à 4 °C.
    REMARQUE : Le volume d’injection est de 10 mL chacun, et la concentration d’astragaloside A dans l’injection a été déterminée par CLHP-ELSD à 0,094 mg/mL (c.-à-d. 120 μM)9. La préparation doit être effectuée dans une enceinte de biosécurité et opérée de manière étanche à la lumière tout au long du processus. Le volume de la solution injectable et du milieu sans sucre doit être mesuré avec précision et bien mélangé.
  7. Préparer une solution d’astragaloside A en pesant avec précision 7,85 mg d’étalon d’astragaloside A et en la dissolvant complètement dans 2 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
    NOTE: La poudre d’astragaloside A est insoluble dans le milieu sans sucre. Lors de la préparation de la solution, dissoudre avec la quantité appropriée de DMSO pour maintenir la concentration expérimentale finale de DMSO en dessous de 0,1% et éviter toute cytotoxicité.
  8. Préparer la solution de scutellarine en pesant 11,56 mg d’étalon de scutellarine avec précision et en la dissolvant complètement avec 5 ml de milieu DMEM sans sucre pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
  9. Préparer la solution d’acide chlorogénique en pesant 8,86 mg d’acide chlorogénique étalon avec précision et en la dissolvant complètement avec 5 mL de milieu DMEM sans sucre pour préparer une solution mère de 5 000 μM. Filtrez-le avec un filtre bactérien de 0,22 μm et conservez-le hermétiquement à 4 °C.
    REMARQUE: La poudre d’acide chlorogénique est instable et absorbe facilement l’eau. Il doit être scellé et conservé à 4 °C à l’abri de la lumière; Le temps d’exposition doit être réduit au minimum pendant la pesée.

2. Essai de viabilité cellulaire

  1. Obtenir des cellules PC12 et les cultiver dans du DMEM supplémenté avec 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
    REMARQUE: Dans cette étude, les cellules sont obtenues auprès de l’Académie chinoise des sciences. Les cellules PC12 sont des cellules adhérentes qui ont les caractéristiques générales des cellules neuroendocrines et sont largement utilisées en neurophysiologie et en neuropharmacologie.
  2. Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur supplémenté en 5% de CO 2 et sous-culture tous les2-3 jours. Utilisez des cellules aux passages 4 à 8 pour toutes les expériences.
  3. Culture cellulaire
    1. Traiter les cellules PC12 dans la phase de croissance logarithmique (confluence cellulaire de 70% à 80%) avec 1 mL de trypsine (0,25%) et observer les cellules au microscope. Lorsque les cellules deviennent rondes, arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL du milieu complet.
    2. Transférer les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 ml et centrifuger les cellules à 840 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension avec le milieu complet et transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Comptez ensuite le nombre de cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
      1. Démarrez le logiciel de cytométrie en flux, sélectionnez le multiple de dilution correspondant de la solution cellulaire dans le paramètre de comptage, puis cliquez sur Tableau de densité après avoir chargé l’échantillon de cellule à partir du tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      2. Encerclez la population cellulaire loin des axes X et Y, cliquez avec le bouton droit sur le tableau de données sous la figure, puis sélectionnez X, Y, Nombre et Nombre d’abs. Les données sous Abs Count dans le tableau de données donnent le résultat du comptage des cellules.
    3. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 5 cellules/mL, inoculer 100 μL/puits dans des plaques de 96 puits, et cultiver à 37 °C et5 % de CO2 dans un incubateur pendant 24 h.
  4. Dépistage des concentrations sécuritaires de deux médicaments sur des cellules PC12 normales
    1. Culture des cellules comme décrit aux étapes 2.1-2.2. Jeter le surnageant et traiter les cellules normales avec différentes concentrations finales d’injection d’Ast (4, 8, 12, 16, 20 et 24 μM) et de capsule d’Eri (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 et 20 μM). Traiter six puits répliqués de chaque groupe pendant 24 h.
      REMARQUE : Les médicaments sont ajoutés au milieu pour atteindre la concentration finale du médicament (mentionnée à l’étape 2.4.1), puis un volume égal de milieu est ajouté à chaque puits. Lors de l’aspiration du surnageant, l’extrémité de la pipette doit être placée doucement contre la paroi du puits pour éviter tout contact avec les cellules au fond du puits. Lors de l’ajout de différentes solutions, ajoutez-les doucement et rapidement le long des bords des puits, et faites attention lors du changement de tête de pistolet de pipette pour éviter d’affecter les résultats expérimentaux.
    2. Jeter le surnageant, ajouter 120 μL de solution de MTT (1 mg/mL) dans chaque puits et incuber les cellules pendant 4 h à 37 °C.
    3. Après l’incubation, jetez à nouveau le surnageant et ajoutez 150 μL de DMSO à chaque puits. Secouer la plaque pendant 10 min à une vitesse de 240 fois/min (nombre de vibrations horizontales par minute) à l’aide d’un oscillateur vortex.
    4. Mesurer l’absorbance de chaque échantillon à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Calculer la viabilité cellulaire (%), qui est l’absorbance du groupe traité/absorbance du groupe normal (témoin) x 100.
      REMARQUE: Assurez-vous que la solution MTT est dans la période de validité; Si la couleur a changé (en vert foncé), elle ne peut pas être utilisée. Lors de l’essai de l’absorbance des cellules, un puits blanc (milieu de culture et MTT, sans cellules ni médicaments) doit être réglé pour éliminer l’interférence des autres réactifs. Un volume de 150 μL de DMSO est ajouté à chaque puits et agité pendant 10 min pour mieux dissoudre les cristaux bleu-violet. L’absorbance doit être détectée dès que possible pour assurer l’exactitude des résultats.
  5. Dépistage des concentrations efficaces de deux médicaments sur des cellules PC12 lésées
    1. Cultivez les cellules pendant 24 h comme mentionné aux étapes 2.1-2.2, jetez le surnageant, puis traitez les cellules avec 20 μL/puits de CoCl2 (0,4 mM) combiné avec le milieu sans sucre.
    2. Traiter simultanément les cellules avec 100 μL/puits d’injection d’Ast (les concentrations finales sont de 2, 6, 8, 10 et 12 μM) ou 100 μL de capsule d’Eri (les concentrations finales sont de 1, 2, 3, 4 et 5 μM) à 37 °C pendant 24 heures supplémentaires. Ajouter 120 μL/puits de milieu complet au groupe témoin.
      REMARQUE: CoCl2 induit des conditions hypoxiques dans les cellules.
    3. Mesurer l’absorbance de chaque échantillon par la méthode MTT et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
  6. Criblage de la combinaison optimale de deux médicaments sur la base de la méthode de conception homogène
    NOTE: Après avoir obtenu la plage de concentration efficace de l’injection d’astragale et de la capsule de breviscapus, le tableau de la méthode de conception uniforme U 7 (7 4) a été utilisé pour obtenir six combinaisons différentes des deux médicaments. Injection d’Ast : capsule Eri : 1) 2:2,6 μM, 2) 4:5 μM, 3) 6:1,8 μM, 4) 8:4,2 μM, 5) 10:1 μM et 6)12:3,4 μM.
    1. Cultiver les cellules comme décrit ci-dessus à l’étape 2.3.1, et traiter les cellules PC12 lésées avec six concentrations proportionnelles d’Ast injection:Eri capsule comme mentionné ci-dessus.
    2. Traiter les cellules pendant 24 h et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.
  7. Evaluation de l’effet protecteur de deux combinaisons optimales sur les cellules PC12 lésées
    NOTE: Après avoir obtenu la combinaison de préparation optimale (injection d’Ast: capsule Eri de 6: 1,8 μM) et la combinaison de composants optimale7 (astragaloside A 10 μM, 40 μM de scutellarin, et 75 μM d’acide chlorogénique), une évaluation plus approfondie est effectuée pour vérifier leurs effets protecteurs sur les cellules PC12 lésées.
    1. Cultiver les cellules comme décrit ci-dessus à l’étape 2.3.1, et traiter les cellules PC12 lésées avec les deux types de combinaisons de médicaments dont il est question dans la NOTE ci-dessus.
    2. Traiter les cellules pendant 24 h et calculer la viabilité cellulaire comme décrit précédemment aux étapes 2.4.2 et 2.4.3.

3. Dosage de l’annexine V-FITC/PI pour le taux d’apoptose

  1. Ensemencer les cellules PC12 dans une plaque de 12 puits à une concentration de 1,3 x 105 cellules/puits et les cultiver à 37 °C pendant 24 h.
  2. Regroupez les cellules : groupe témoin, groupe modèle et deux combinaisons de médicaments. Ajouter 1,2 mL/puits de milieu complet au groupe témoin, ajouter 1,2 mL/puits de milieu contenant 0,4 mM de CoCl2au groupe modèle et ajouter 1,2 mL/puits de chacune des deux combinaisons contenant 0,4 mM de CoCl2. Incuber les cellules à 37 °C pendant encore 24 h.
  3. Après un traitement médicamenteux, traiter les cellules avec 250 μL/puits de trypsine, transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 840 xg pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL du tampon de liaison.
    1. Incuber les cellules dans l’obscurité avec 5 μL d’annexine V-FITC et 10 μL d’iodure de propidium (PI) pendant 15 minutes à TA, puis vérifier l’apoptose par cytométrie en flux. Définissez trois puits de réplication dans chaque groupe.
      NOTE: La trypsine utilisée dans ce test ne peut pas contenir d’EDTA parce que l’EDTA est un agent chélatant des ions métalliques qui entre en compétition avec l’annexine V pour lier les ions calcium et affecte l’affinité de l’annexine pour PI. Lorsque l’apoptose se produit, la phosphosérine, à l’origine sur la face interne de la membrane cellulaire, se tourne vers l’extérieur vers la surface cellulaire, et l’annexine V-FITC se lie sélectivement à la phosphosérine à l’extérieur de la membrane pour montrer une fluorescence verte.
    2. Cliquez sur Compensation automatique dans le menu Démarrer, sélectionnez FITC, PE, PerCP et APC dans le canal Sélectionner, puis sélectionnez Compensation à : Hauteur. Cliquez sur OK dans l’élément statistique : médiane. Avec la même méthode de comptage cellulaire mentionnée à l’étape 2.3.2, prélevez les échantillons de cellules, cliquez sur la carte de densité et encerclez la population cellulaire effective.
    3. Avec la fluorescence FITC comme paramètre de l’axe X et d’autres paramètres de fluorescence comme paramètre de l’axe Y, créez une carte de densité. Cliquez sur Matrice de compensation dans le menu Démarrer et Coefficient dans la matrice de débordement. Les informations de la carte de densité sont affichées pour l’analyse du taux d’apoptose.

4. Détection par immunofluorescence de la génération de caspase-3

  1. Ensemencer les cellules PC12 sur des lamelles de couverture à une densité de 8 x 104 cellules/lamelle de couverture et les placer dans des plaques de 24 puits à 37 °C pendant 24 h. Regroupez les cellules comme mentionné ci-dessus à l’étape 3.2; Configurez trois fiches de recouvrement répliquées pour chaque groupe.
  2. Après le traitement médicamenteux, rincer les lames de couverture deux fois avec du PBS (37 °C) pendant 5 min chacune, les fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes et perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,5% pendant 20 min à TA.
  3. Rincez à nouveau les cellules et bloquez-les avec du sérum de chèvre à 10% pendant 1 h à TA.
  4. Incuber chaque lamelle de couverture avec 200 μL d’anticorps primaire caspase-3 (une protéine exécutive clé de l’apoptose) dilué à une concentration de 1:250 dans 1x TBST, pendant une nuit à 4 °C. Laver avec 1x TBST (trois fois pendant 3 min chacune) et incuber avec 200 μL d’anticorps secondaire (dilution 1:300 dans 1x TBST) pendant 1 h à TA dans l’obscurité.
    NOTE: La fluorescence est facilement éteinte; Ainsi, après l’incubation de l’anticorps secondaire, les lames doivent être tenues à l’écart de la lumière. Les anticorps primaires et secondaires doivent être conservés à 4 °C à l’abri de la lumière.
  5. Ajouter 300 μL de DAPI (0,5 μg/mL) aux lamelles de couverture (pour détecter les noyaux) pendant 10 min et laver les cellules trois fois avec 1x TBST pendant 5 min chacune.
  6. Observez les lamelles de couverture au microscope à fluorescence et capturez des images10. Effectuer une analyse statistique de l’intensité de fluorescence à l’aide du logiciel d’imagerie.
    NOTE: Les lames et les lames de couverture utilisées doivent être propres et stériles. Lors de la coloration, faites attention au pH, à la concentration et à la température de la solution de teinture et évitez la trempe par fluorescence. Le microscope fluorescent doit être allumé au moins 15 minutes à l’avance pour préchauffer la lampe au mercure et éteint pendant 30 minutes avant d’être rallumé. Lors de l’acquisition d’images, les paramètres d’exposition du même colorant dans le même lot d’expériences doivent être cohérents pour assurer l’exactitude des résultats.

5. Dosage d’immunofluorescence du niveau de ROS

  1. Culture et traitement des cellules comme indiqué à l’étape 4.1.
  2. Après le traitement médicamenteux, laver chaque lamelle de couverture trois fois avec du PBS pendant 3 minutes et incuber avec 400 μL de DCFH-DA (10 μM) à 37 °C pendant 20 min.
    NOTE: DCFH-DA est un indicateur universel du stress oxydatif. Il a une perméabilité de la membrane cellulaire et aucune fluorescence. Une fois qu’il pénètre dans la cellule, il est hydrolysé par l’estérase pour produire de la 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH), puis rapidement oxydé pour produire un produit fluorescent puissant.
  3. Lavez à nouveau les cellules avec du DMEM sans sérum (deux fois pendant 3 minutes chacune) et observez immédiatement la lamelle de couverture après avoir ajouté l’agent de trempe à fluorescence au microscope à fluorescence. Calculez l’intensité relative de fluorescence à l’aide du logiciel d’imagerie.
    REMARQUE: Après avoir chargé la sonde DCFH-DA, assurez-vous de nettoyer la sonde résiduelle qui ne pénètre pas dans la cellule, sinon l’arrière-plan deviendra élevé.

6. Détection par transfert Western de l’expression protéique de Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 et Bax11,12

  1. Inoculer les cellules PC12 dans des plaques à 6 puits à une concentration de 1 x 106 cellules/puits et les cultiver à 37 °C pendant 24 h. Regroupez et traitez les cellules comme indiqué ci-dessus à l’étape 4.1, et définissez trois puits de réplication dans chaque groupe.
  2. Après un traitement médicamenteux pendant 24 h, laver les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune et incuber sur de la glace pendant 30 minutes dans un tampon de lyse préparé. Après lyse, centrifuger les cellules pendant 20 min à 16 000 x g et 4 °C et recueillir les surnageants.
  3. Détectez la concentration de protéines et ajustez-la selon les instructions du test Bradford. Diluer les échantillons et les dénaturer à 100 °C pendant 10 min.
    REMARQUE: Le tampon de lyse est composé d’inhibiteur de phosphatase, d’inhibiteur de protéase et de lysat RIPA dans un rapport volumique de 1: 1: 50. Dans le groupe témoin, 200 μL/puits de tampon de lyse sont nécessaires, et 100 μL/puits de tampon de lyse sont nécessaires dans les autres groupes. En général, les concentrations de protéines des groupes témoin, modèle et deux types de combinaisons sont respectivement de 0,45 mg/mL, 0,25 mg/mL et 0,32-0,39 mg/mL; leurs concentrations de protéines après dilution avec le tampon de charge sont respectivement de 0,36, 0,2 et 0,256-0,312 mg/mL.
  4. Pour détecter des protéines de poids moléculaire différents, chargez 25 μg de protéines dans chaque voie, exécutez une électrophorèse SDS-PAGE à 12% et transférez le gel sur des membranes PVDF.
    REMARQUE: Lors de la préparation du gel SDS, il doit être complètement mélangé sans bulles ni particules insolubles; sinon, des bandes inégales ou irrégulières peuvent se produire. Lors du transfert des membranes, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles entre la membrane PVDF et le gel; Sinon, des taches blanches apparaîtront dans la bande. De plus, cette étape doit être effectuée à basse température et le sac de glace doit être changé toutes les 30 minutes.
  5. Bloquer les membranes avec du lait écrémé à 5 % pendant 1,5 h à TA et incuber avec 5 mL des anticorps primaires correspondants (Nrf2 1:1 000, Akt 1:2 000, p-Akt 1:2 000, Bcl-2 1:5 000 et Bax 1:1 000) pendant 24 h à 4 °C. Utiliser l’anticorps β-actine (1:5 000) comme contrôle interne.
  6. Laver les membranes avec du TBST (trois fois pendant 10 minutes chacune), puis incuber avec 5 mL d’anticorps secondaires conjugués HPR (1:5 000) à TA pendant 2 h.
    NOTE: Le taux de dilution des anticorps ne doit pas être modifié arbitrairement et les membranes doivent être lavées avec TBST suffisamment en stricte conformité avec les exigences pour éviter que la couleur de fond de la bande ne soit trop noire.
  7. Enfin, lavez à nouveau la membrane avec du TBST et traitez-la avec un substrat HRP chimiluminescent (selon les instructions du fabricant) pour la détection des bandes protéiques. Capturez les images à l’aide du système d’imagerie par chimiluminescence et quantifiez les valeurs de gris des protéines à l’aide du logiciel d’imagerie, avec la β-actine comme contrôle interne comparatif.

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Résultats

Le dépistage de la combinaison optimale d’Ast injection et de capsule Eri est illustré à la figure 1. Le taux de survie cellulaire de l’injection d’Ast et de la capsule Eri sur les cellules PC12 normales est illustré à la figure 1A. La viabilité cellulaire était inférieure à 95 % avec l’injection d’Ast à des concentrations supérieures à 12 μM (figure 1A) et la capsule Eri à des concentrations supérieures à 5 μM (f...

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Discussion

Il y a encore un manque de médicaments idéaux pour le traitement de l’ischémie cérébrale dans la pratique clinique moderne2. Sous la direction de la supplémentation en qi et de l’activation de la méthode de circulation sanguine, Ast, Eri et d’autres préparations ont été utilisés en combinaison dans la pratique clinique de la MTC et ont obtenu de bons avantages complets13,14,15. Un grand n...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été financée par des projets clés de R & D du Département provincial de la science et de la technologie du Sichuan (2020YFS0325).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

Références

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