Conception et mise en œuvre d’un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat

Résumé

Les poumons ex vivo sont utiles pour une variété d’expériences afin de recueillir des données physiologiques tout en excluant les variables confondantes des expériences in vivo. Les configurations commerciales sont souvent coûteuses et limitées dans les types de données qu’elles peuvent collecter. Nous décrivons une méthode de construction d’une configuration entièrement modulaire, adaptable à divers modèles d’étude.

Résumé

Les préparations pulmonaires ex vivo sont un modèle utile qui peut être transposé à de nombreux domaines de recherche différents, en complément des modèles in vivo et in vitro correspondants. Les laboratoires qui souhaitent utiliser des poumons isolés doivent être conscients des étapes importantes et des défis inhérents pour établir une configuration abordable, fiable et qui peut être facilement adaptée au sujet d’intérêt. Cet article décrit un modèle DIY (do it yourself) pour la ventilation et la perfusion pulmonaires ex vivo chez le rat afin d’étudier les effets des médicaments et des gaz sur le tonus vasculaire pulmonaire, indépendamment des changements dans le débit cardiaque. La création de ce modèle comprend a) la conception et la construction de l’appareil, et b) la procédure d’isolement pulmonaire. Ce modèle aboutit à une configuration plus rentable que les alternatives commerciales et pourtant suffisamment modulaire pour s’adapter aux changements de questions de recherche spécifiques. Divers obstacles ont dû être surmontés pour garantir un modèle cohérent capable d’être utilisé pour une variété de sujets de recherche différents. Une fois établi, ce modèle s’est avéré très adaptable à différentes questions et peut facilement être modifié pour différents domaines d’études.

Introduction

Les techniques de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP)¹ ont connu une augmentation de leur utilisation au cours de la dernière décennie comme moyen d’étudier les transplantations pulmonaires², l’ischémie/reperfusion³, le métabolisme pulmonaire⁴ et les réponses immunitaires⁵. Les poumons isolés, mais intacts, ventilés et perfusés offrent la capacité d’évaluer directement la réponse des poumons, y compris le système vasculaire pulmonaire, à des interventions et/ou des traitements potentiels sans facteurs de confusion potentiels, tels que des apports neuronaux et hormonaux ou une modification de l’hémodynamique in vivo. En même temps, ils maintiennent l’interaction physiologique de la ventilation et de la perfusion, contrairement aux conditions in vitro. Une proposition portant sur les réponses immunitaires dans les poumons⁵, par exemple, nécessite la même qualité de données qu’une étude axée sur l’augmentation de la taille du groupe de donneurs⁶ pour les transplantations pulmonaires. L’EVLP peut être utilisé sur une variété d’espèces, y compris les souris³, les rats^{7, 8, 9, 10, 11, 12}, les porcs¹³ et les humains². Par conséquent, il est nécessaire d’établir un modèle capable de produire des données fiables à partir d’une variété de paramètres expérimentaux différents. La pertinence clinique sera générée dans les études ultérieures en utilisant le modèle EVLP comme outil.

Bien que des installations commerciales soient disponibles à l’achat pour la plupart des espèces, elles peuvent souvent être prohibitives et confiner les chercheurs à une marque spécifique d’équipement et de logiciels propriétaires. Tout écart par rapport à la configuration prête à l’emploi (par exemple, passer d’une espèce à une autre) nécessite de la prévoyance et de contourner la configuration fournie, ce qui peut s’avérer difficile ou impossible. Dans ce qui suit, une configuration de bricolage (à faire soi-même) pour les poumons isolés chez le rat qui est à la fois modulaire et rentable, ainsi que la procédure chirurgicale pour isoler les poumons, sont décrites.

Protocole

La partie in vivo des expériences (de l’anesthésie générale à l’euthanasie) nécessite l’approbation préalable de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) concerné. Toutes les procédures décrites dans le présent document ont été approuvées (numéro de protocole M1700168) par l’IACUC au centre médical de l’Université Vanderbilt, à Nashville, dans le Tennessee, et ont été effectuées conformément aux directives ARRIVE¹⁴. Avant l’expérimentation, tous les rats étaient hébergés dans l’installation de soins pour animaux de l’institut, avec un accès gratuit à l’eau et à la nourriture. En incluant différentes études en dehors du cadre de ce manuscrit, nous avons utilisé un total de 148 rats Sprague Dawley mâles, âgés de 7 à 10 semaines, avec un poids compris entre 250 g et 400 g jusqu’à présent.

1. Construction de l’appareil

REMARQUE : Toutes les pièces, y compris les fabricants respectifs, sont répertoriées dans le tableau des matériaux.

1. Pour maintenir chaque pièce d’équipement en place, construisez un treillis sur mesure pour permettre une configuration et une incorporation faciles des nouveaux dispositifs (Figure 1). Fixez les poteaux en aluminium (1 à 2 pieds de longueur, 1 cm de diamètre, disponibles dans n’importe quelle quincaillerie) les uns aux autres à l’aide de pinces transversales pour créer un treillis 3D, et placez-les sur un plateau en plastique (30 po x 21 po) pour éviter le déversement de fluides.
2. Montez les transducteurs de pression à une hauteur égale à celle des poumons et connectez-les aux lignes de l’artère pulmonaire (PA), de la veine pulmonaire (PV) et du tube de ventilation.
   REMARQUE : Ces transducteurs transmettent des données à leurs bioamplificateurs respectifs connectés au système d’acquisition de données (DAQ) et à son logiciel.
3. Plutôt que d’utiliser des canules disponibles dans le commerce, fabriquez des canules personnalisées (figure 2) à partir de segments de tubes en plastique dur de 2 mm de large qui sont évasés à l’extrémité, en utilisant une flamme nue pour permettre d’attacher en toute sécurité les sutures. Pliez-les en forme de U pour réduire le stress sur les poumons lors de la suspension et pour qu’ils s’insèrent dans la chambre pulmonaire.
4. Pour faire la chambre dans laquelle les poumons doivent être ventilés et perfusés, placez un bécher de 1 000 ml à l’intérieur d’un bécher de 1 500 ml avec un bain-marie entre les deux et à l’intérieur du bécher de 1 000 ml, créant ainsi un bain-marie. Placez ces béchers sur une plaque chauffante réglée à 48 °C, créant ainsi une chambre pour les poumons à la fois humide et résistante aux fluctuations de température.
5. Conserver la mémoire tampon de l’expérience dans une fiole jaugée de 150 mL placée sur une plaque chauffante réglée à 37 °C. À l’aide d’une barre d’agitation magnétique, le tampon circule à l’intérieur du bécher. Placez le ménisque du tampon à une hauteur telle qu’il soit à 4 cm au-dessus du poumon, afin de créer une pression innée de 4 cmH₂O sur le PV. Pendant la chirurgie, assurez-vous que les poumons de l’animal sont à la même hauteur que le tampon pour réduire la formation d’œdème hydrostatique.
   REMARQUE : L’utilisation d’un flacon minimise la surface en contact avec l’air ambiant, ce qui minimise la diffusion de gaz.
6. À l’aide d’une pompe à rouleau, déplacez le tampon à travers un circuit composé d’un serpentin chauffant et d’un piège à air avant de perfuser le poumon. Recyclez l’effluent du PV dans la fiole jaugée. Connectez le serpentin de chauffage et le siphon à un bain-marie en circulation également réglé à 37 °C. Ajustez la température du bain-marie en fonction de la vitesse de la pompe, de sorte que le perfusat ait une température constante de 37 °C.

2. Procédure

1. Avant le début de l’expérience, préparez la configuration.
   1. Assurez-vous que le logiciel fonctionne (voir ci-dessous) et qu’il collecte correctement les données.
   2. Étalonnez tous les transducteurs de pression quotidiennement pour vous assurer qu’ils ne dérivent pas.
   3. Préparez le tampon (voir le tableau 1 pour les ingrédients d’une solution saline physiologique avec de l’albumine sérique bovine à 4 % [BSA]) et assurez-vous que le pH est à 7,4, en utilisant du HCl pour ajuster en conséquence. Installez le système de perfusion avec un tampon chauffé (tableau 1) circulant partout, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Ajoutez BSA au moins 30 minutes avant le début de l’expérience pour lui donner suffisamment de temps pour se dissoudre. En l’absence d’oxygénateur, introduire du gaz à bulles dans le tampon de perfusion avant l’ajout de BSA avec une composition gazeuse de 65 % de N₂, 30 % d’O₂ et 5 % de CO₂ pour imiter les niveaux de CO₂ des poumons in vivo . Cela empêche la solution de mousser une fois que le BSA est ajouté.
   4. Préparez la zone d’opération avec tous les outils chirurgicaux, les sutures et le ruban adhésif nécessaires. Inclinez la planche d’opération à un angle de 15°, de sorte que le rat anesthésié puisse être positionné avec la tête surélevée au-dessus du reste du corps, et que la trachée et le bloc cœur-poumon puissent être manipulés facilement.
   5. En portant un équipement de protection individuelle approprié, pesez le rat et administrez une injection intrapéritonéale de pentobarbital (65 mg/^kg-1). Après 10 min, utilisez une pince d’orteil pour vous assurer que le plan chirurgical de l’anesthésie générale a été atteint. Administrez plus d’anesthésique si nécessaire.
2. Transférez le rat dans la zone d’opération et fixez-le à la planche d’opération en collant ses pattes avant séparément, puis les pattes arrière ensemble, en vous assurant que les pattes avant sont suffisamment lâches pour permettre de visualiser un réflexe de douleur si l’anesthésie n’est pas assez profonde (Figure 3A).
3. Fixez la tête du rat en collant la bouche avec une longue et fine bande derrière les dents de devant, sans restreindre la langue ou le flux d’air pour le rat qui respire encore spontanément (Figure 3B).
4. Effectuez une trachéotomie en pinçant la peau au-dessus de la trachée à l’aide d’une pince et en coupant avec des ciseaux chirurgicaux. À l’aide d’une pince incurvée, disséquez brutalement le muscle et le tissu pour atteindre la trachée. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement pendant cette étape.
   1. Passez des pinces incurvées sous la trachée et ouvrez-les pour laisser de la place pour passer des sutures 3-0 en dessous qui peuvent ensuite être pré-nouées en un nœud carré (Figure 3B). Faites une petite incision entre les anneaux cartilagineux de la trachée et insérez la canule trachéale (aiguille 18 G modifiée avec tube de 1 mm de diamètre collée autour de l’extrémité pour créer une encoche). Attachez la suture en vous assurant qu’aucun air ne peut s’échapper de l’incision trachéale et que la canule n’exerce aucune pression sur la trachée.
5. Régler le ventilateur pour qu’il fonctionne avec un mélange gazeux de 30 % d’O₂, 5 % de CO₂ et 65 % d’N₂, avec un volume courant (VT) de 10 mL/kg, une pression expiratoire positive (PEP) de 0 cmH₂O et un débit de 60 respirations/min.
6. Une fois que la canule trachéale est fixée avec la suture, commencez à ventiler le rat avec les paramètres ci-dessus.
   REMARQUE : La méthode chirurgicale utilisée a été adaptée de Nelson et ^al.9 et est décrite étape par étape.
7. Retirez la fourrure de l’abdomen du rat à l’aide de gros ciseaux chirurgicaux et de pinces.
   REMARQUE : Les pommades dépilatoires peuvent également être utilisées avant le début de l’expérience.
8. Tout en tenant l’apophyse xiphoïde avec une pince, faites une petite incision horizontale sous les côtes, en veillant à ce que le diaphragme reste intact. Une fois que les organes internes peuvent être visualisés en toute sécurité, élargissez la coupe horizontale pour exposer l’ensemble du diaphragme.
9. En prenant des précautions extrêmes pour éviter de perforer les poumons, injectez de l’héparine (3 000 U/^kg-1) dans la veine cave inférieure (VCI) avec une seringue de 22 G.
10. Encore une fois, tenez l’apophyse xiphoïde avec des pinces et coupez crânienne le long du sternum tout en visualisant constamment les poumons pour éviter de les couper.
11. Pour bien voir le bloc cœur-poumon, écartez la cage thoracique à l’aide de deux grosses pinces et assurez-vous d’éviter de casser les côtes, ce qui peut entraîner la perforation d’un fragment d’os pointu (Figure 3C).
    REMARQUE : Une fois la cage thoracique ouverte, utilisez une PEP de 2-3 cmH₂O, réglée par un sas d’eau fixé à la branche expiratoire du ventilateur, pour éviter l’atélectasie.
12. À ce moment-là, coupez l’IVC pour euthanasier le rat par exsanguination. Assurez-vous soigneusement qu’au moins 1 minute s’est écoulée depuis l’injection d’héparine (voir étape 2.9) pour lui donner suffisamment de temps pour circuler et éviter les microcaillots dans les poumons.
13. Lors de la mise en place des canules de perfusion, vérifiez constamment les pressions pour vous assurer qu’aucun changement soudain ne se produit.
    REMARQUE : Un pic soudain de pression alors que la pompe fonctionne à une vitesse constante indique la formation d’un blocage, tandis qu’une diminution soudaine peut indiquer une fuite.
14. Coupez tout excès de thymus pour permettre une visualisation plus facile du système vasculaire pulmonaire. Localisez l’AP, passez une petite pince incurvée en dessous, puis passez à nouveau une suture 3-0 en dessous et pré-attachez en un nœud carré.
15. Faites une petite incision dans le ventricule droit du cœur et insérez la canule PA (faite d’un tube en plastique de 2 mm de diamètre évasé à l’extrémité à l’aide d’une flamme nue pour permettre d’attacher des sutures), en étant doux pour éviter de rompre l’artère adjacente. Fixez la canule à l’aide de la suture et de la perfuse, en commençant à 1,5 mL/^min-1 (figure 3D).
16. Excise immédiatement l’apex du cœur pour éviter une accumulation de pression dans les poumons. À l’aide de petites pinces incurvées, rompez la valve mitrale et assurez-vous visuellement que les pinces peuvent pénétrer dans l’oreillette gauche sans restriction.
17. Placez une suture pré-nouée 3-0 autour du cœur sous l’oreillette (Figure 3E).
18. Insérez la canule PV (construction similaire à la canule PA) dans l’oreillette gauche et assurez-vous que le tampon peut s’écouler de celle-ci avant de fixer la suture.
    REMARQUE : Il est essentiel que la canule PV soit placée au-delà de la valve mitrale pour s’assurer qu’elle peut être correctement attachée, tout en n’étant pas placée trop profondément pour ne pas endommager le PV ou encombrer l’écoulement (Figure 3E). Faites très attention à l’attache de la suture, car l’attacher trop lâche entraîne une perte de flux, tandis que l’attacher trop serré peut endommager le cœur, affaiblir le placement de la canule et potentiellement provoquer des fuites.
19. Coupez l’excès de tissu entre la cavité thoracique et l’incision de la trachéotomie à l’aide de ciseaux à bout émoussé pour éviter d’endommager la trachée. Assurez-vous que toute la trachée sous la canule trachéale et tout le bloc cœur-poumon sont visibles.
20. Retirez le bloc cœur-poumon et la trachée en tenant la canule trachéale et en excisant le tissu conjonctif derrière la trachée à l’aide d’une paire de ciseaux incurvés à bout émoussé, en laissant l’œsophage attaché pour un soutien structurel supplémentaire (Figure 3F).
21. Augmentez progressivement le débit jusqu’à un débit maximal de 40 mL/^kg-1/^min-1. Laissez les premiers 50 ml de tampon s’écouler hors du système pour éliminer les cytokines inflammatoires qui pourraient être libérées (figure 3G).
22. Déplacez doucement les poumons isolés dans la chambre à double chaudière créée avec les deux béchers. Assurez-vous que l’AP, le PV ou la canule trachéale ne se tordent à aucun moment lors du déplacement des poumons ou de leur suspension.
    REMARQUE : La prévention de l’atélectasie lors de la récupération pulmonaire et de la connexion à la configuration est importante, en particulier lorsque l’EVLP est utilisé pour des poumons déjà endommagés ou lorsque des interventions avant l’EVLP sont prévues. Cela peut se faire, par exemple, en plaçant une petite pince sur la trachée après l’inspiration avant le transfert vers le ventilateur¹⁵.

3. Acquisition de données

1. Pour la collecte de données, utilisez n’importe quel convertisseur analogique-numérique et système d’acquisition de données disponibles dans le commerce.
2. Faites attention à ce que la fréquence d’échantillonnage soit suffisante pour l’objectif donné (200 Hz ici) et que tous les paramètres dépendants pertinents des bioamplificateurs et autres dispositifs d’entrée soient collectés simultanément (pression des voies aériennes, PA et pression PV choisies pour ce protocole)¹⁶.
3. Enregistrer des paramètres indépendants (p. ex., vitesse de perfusion, taux de ventilation, composition des gaz ventilés, composition de l’électrolyte tampon et poids pulmonaire).

Résultats

Après 10 minutes de stabilisation et des lectures de base, nous avons randomisé un premier groupe de 10 rats Sprague Dawley mâles en cinq petits groupes : ischémie globale sans flux pendant 5, 7,5, 8, 9 ou 10 min (n = 2 par groupe) suivie d’une reperfusion ; Ces expériences préliminaires limitées de détermination de la dose ont été menées afin d’identifier le temps d’ischémie le plus long possible pour permettre une ventilation et une reperfusion suffisantes avant le développement éventuel d’une aug...

Discussion

Plus de 100 expériences ont été réalisées avec succès dans notre laboratoire en utilisant cette configuration. La conception modulaire de cette configuration personnalisée a donné une grande flexibilité aux changements potentiels des exigences expérimentales. Alors que d’autres configurations utilisent un désoxygénateur¹⁸ pour imiter la consommation constante d’oxygène et la production de CO₂ par les organes finaux, ce modèle simplifié n’a pas utilisé cette fonctio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1