Synthèse d’hydrogels de matrice extracellulaire de cartilage décellularisé

Résumé

Cet article présente une nouvelle méthode pour la synthèse d’hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée (DC-ECM). Les hydrogels DC-ECM ont une excellente biocompatibilité et fournissent un microenvironnement supérieur pour la croissance cellulaire. Par conséquent, ils peuvent être des échafaudages cellulaires et des systèmes d’administration biologique idéaux.

Résumé

Les hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée (DC-ECM) sont des biomatériaux prometteurs pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en raison de leur biocompatibilité et de leur capacité à imiter les propriétés naturelles des tissus. Ce protocole vise à produire des hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM natif du tissu cartilagineux. Le protocole implique une combinaison de perturbation physique et chimique et de digestion enzymatique pour éliminer le matériel cellulaire tout en préservant la structure et la composition de l’ECM. Le DC-ECM est réticulé à l’aide d’un agent chimique pour former un hydrogel stable et biologiquement actif. L’hydrogel DC-ECM a une excellente activité biologique, une structure spatiale et une fonction d’induction biologique, ainsi qu’une faible immunogénicité. Ces caractéristiques sont bénéfiques pour favoriser l’adhésion, la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires et pour créer un microenvironnement supérieur à la croissance cellulaire. Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs et les cliniciens dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Les hydrogels biomimétiques peuvent potentiellement améliorer le développement de stratégies efficaces d’ingénierie tissulaire pour la réparation et la régénération du cartilage.

Introduction

L’ingénierie du tissu cartilagineux est un domaine en plein développement qui cherche à régénérer le tissu cartilagineux endommagé ou malade¹. L’un des principaux défis dans ce domaine est le développement d’échafaudages biomimétiques capables de soutenir la croissance et la différenciation des chondrocytes, les cellules responsables de la production du cartilage². L’ECM du tissu cartilagineux joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement des chondrocytes. DC-ECM est un échafaudage efficace pour les applications d’ingénierie tissulaire³.

Un certain nombre de techniques ont été développées pour produire de la DC-ECM à partir de tissu cartilagineux, y compris des méthodes chimiques, enzymatiques et physiques. Cependant, ces méthodes aboutissent souvent à la génération d’hydrogels ECM insuffisamment biomimétiques, ce qui limite leur potentiel d’utilisation dans les applications d’ingénierie tissulaire ^4,5. Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode plus efficace pour produire des hydrogels DC-ECM.

Le développement de cette technique est important car il peut faire progresser le domaine de l’ingénierie tissulaire en fournissant une nouvelle approche pour créer des échafaudages biomimétiques qui peuvent soutenir la régénération et la réparation des tissus. De plus, cette technique pourrait être facilement adaptée pour produire des hydrogels ECM à partir d’autres tissus, élargissant ainsi ses applications potentielles.

Dans l’ensemble de la littérature, il y a eu un intérêt croissant pour l’utilisation de la DC-ECM comme échafaudage pour les applications d’ingénierie tissulaire⁶. De nombreuses études ont démontré l’efficacité des hydrogels DC-ECM dans la promotion de la croissance et de la différenciation cellulaires dans divers tissus, dont le cartilage ^7,8. Par conséquent, le développement d’un protocole pour la production d’hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM naturelle du tissu cartilagineux est une contribution significative au domaine.

Le protocole présenté dans cet article répond à ce besoin en fournissant une nouvelle méthode de production d’hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM naturelle du tissu cartilagineux. Le protocole consiste à décellulariser le tissu cartilagineux, à isoler l’ECM résultante et à créer un hydrogel en réticulant l’ECM avec un polymère biocompatible. L’hydrogel qui en résulte a montré des résultats prometteurs dans le soutien de la croissance et de la différenciation des chondrocytes.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Tongde de la province du Zhejiang.

1. Préparation de l’hydrogel DC-ECM

NOTE : Dans cette étude, le cartilage a été obtenu à partir des articulations du genou de porcs miniatures Bama âgés de 12 mois, évitant ainsi la collecte de tissu osseux.

1. Prenez le cartilage collecté, bloquez-le et coupez-le en³ morceaux de 1 à 2 mm avec un scalpel.
2. Placez 20 g de cartilage haché dans un tube à centrifuger de 50 mL et ajoutez 20 mL de tampon hypotonique Tris-HCl (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0) pour immerger complètement le tissu. Placez le tube à centrifuger dans un congélateur à −80 °C pendant 3 h, puis dans un four à 37 °C pendant 3 h. Répétez l’étape de congélation et de chauffage six fois. Dans cette étape, le tampon hypotonique Tris-HCl n’a pas besoin d’être remplacé.
3. Agiter le tube de centrifugation pendant 30 s à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min. Placez un tamis en acier inoxydable (taille des pores : ~250 μm) sur un nouveau tube à centrifuger de 50 ml.
4. Décantez lentement le cartilage décellularisé dans le tamis en acier inoxydable, lavez le tissu trois fois avec du PBS stérile et collectez le cartilage.
5. Ajouter 10 mL de solution de trypsine (0,25 % de trypsine dans le PBS) et placer le tube sur un shaker à 37 °C pendant 24 h. Pendant cette période, remplacez la trypsine toutes les 4 h. Filtrez la suspension à l’aide du tamis en acier inoxydable et conservez les tissus. La trypsine peut être traitée pendant la nuit pendant l’un des processus de digestion, et cela n’affectera pas la digestion finale.
6. Laver le tissu trypsinisé avec un tampon hypertonique (1,5 M de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6).
7. Ajouter 10 mL de solution de nucléase (50 U/mL de désoxyribonucléase et 1 U/mL de ribonucléase dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5) et placer le tube sur un agitateur à 37 °C pendant 4 h.
8. Retirez la solution de nucléase, lavez le cartilage trois fois avec du PBS stérile et ajoutez une solution hypotonique de Tris-HCl. Placez le tube à centrifuger sur un shaker et rincez pendant 20 h à température ambiante (RT).
9. Retirez la solution hypotonique de Tris-HCl, lavez le cartilage trois fois avec du PBS stérile et ajoutez une solution de Triton X-100 à 1 % pour immerger le tissu pendant 24 h.
10. Retirez la solution Triton X-100 et rincez abondamment le cartilage décellularisé avec de l’eau distillée pendant 3 jours, en changeant l’eau distillée toutes les 12 h.
11. Faire tremper le cartilage dans une solution d’acide peracétique (0,1 % d’AAP dans 4 % d’éthanol) pendant 4 h. Retirez la solution d’acide peracétique et lavez le cartilage trois fois avec de l’eau distillée stérile.
12. Placez le tamis en acier inoxydable (taille des pores : ~250 μm) sur un tube à centrifuger de 50 ml. Décantez lentement le cartilage décellularisé dans le tamis en acier inoxydable et collectez le cartilage. Testez le degré de décellularisation et la rétention matricielle du cartilage en estimant la teneur en ADN, en collagène et en glycosaminoglycane (GAG).
13. Mettez le cartilage décellularisé dans un bol de broyage, ajoutez de l’azote liquide et broyez le cartilage décellularisé pour former une poudre. Prélever 2 g de poudre de cartilage décellularisé, ajouter 80 mL d’acide acétique 0,5 M et 20 mg de pepsine, et digérer pendant 24 h. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min ; jeter le sédiment et recueillir la solution surnageante (solution DC-ECM).
14. Décanter 1 mL de solution DC-ECM par puits dans des plaques à 6 puits. Placez les plaques à 6 puits dans un lyophilisateur. Congelez la solution DC-ECM. Une fois que la température dans le lyophilisateur descend à −40 °C, allumez la pompe à vide et maintenez le degré de vide à 10 Pa pendant 22 h.
15. Retirez la solution DC-ECM lyophilisée, placez-la dans des tubes à centrifuger et conservez-la à −20 °C. La durée minimale de stockage de la solution DC-ECM lyophilisée dépasse six mois.
16. Ajouter 1 mL d’eau distillée stérile pour dissoudre 20 mg de solution DC-ECM lyophilisée dans le tube à centrifuger. Agiter pendant 1 min à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min à RT. Ajouter 1 mg de vitamine B2 (0,1 % p/v) à la solution DC-ECM, incuber à 37 °C pendant 60 min et irradier avec une lumière UV (370 nm, 3,5 mW/cm²) pendant 3 min pour former un hydrogel (hydrogel DC-ECM).

2. Détection du cartilage décellularisé

1. Détection du contenu en ADN du cartilage décellularisé
   REMARQUE : Extrayez l’ADN à l’aide du kit de sang et de tissus DNEasy.
   1. Tout d’abord, prenez 20 mg de cartilage DC-ECM dans un tube à centrifuger. Ajouter 180 μL de Buffer GTL et 20 μL de Protéinase K par oscillation vortex, et incuber le cartilage à 56 °C pendant 4 h jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
   2. Agiter le tube de centrifugation pendant 15 s à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min à RT. Ensuite, ajoutez 200 μL de Buffer GL et d’éthanol anhydre, et mélangez soigneusement par vibration vortex. Centrifuger les échantillons pendant 1 min à une vitesse de 6 000 x g à 4 °C.
   3. Ajouter 500 μL de tampon GW1 dans la colonne d’adsorption et centrifuger les échantillons pendant 1 min à une vitesse de 12 000 x g à 4 °C. Ajouter 500 μL de tampon GW2 dans la colonne d’adsorption et centrifuger à 20 000 x g à 4 °C pendant 1 min. Enfin, ajoutez 50 μL d’eau stérilisée dans la colonne d’adsorption et centrifugez pendant 1 min à une vitesse de 6 000 x g à 4 °C pour recueillir la solution d’ADN. Déterminer la teneur en ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
2. Détection de la teneur en collagène dans le cartilage décellularisé
   1. Pour détecter la teneur en collagène dans le cartilage décellularisé, utilisez l’hydroxyproline comme marqueur d’acides aminés de collagène. Acidifier 5 mg de cartilage décellularisé avec 5 mL d’acide chlorhydrique 6 M à 100 °C pendant 20 min, puis le neutraliser avec 5 mL d’une solution d’hydroxyde de sodium 6 M.
   2. Calculer la teneur en hydroxyproline en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Obtenir une régression linéaire concentration-absorption à l’aide de l’échantillon standard d’hydroxyproline.
3. Détection du contenu en GAG dans le cartilage décellularisé
   REMARQUE : La teneur en GAG dans le cartilage DC-ECM a été détectée à l’aide d’un kit de détection quantitative colorimétrique GAG tissulaire. Tous les réactifs ci-dessous sont disponibles dans le kit.
   1. Prenez 200 mg de poudre de cartilage DC-ECM et ajoutez 500 μL de réactif A par oscillation vortex. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 16 h, puis centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min.
   2. Prélever 50 mL de solution d’échantillon et ajouter 50 μL de solution à haute teneur en sel (réactif B) et 50 μL de solution acide (réactif C) par oscillation vortex. Incuber l’échantillon pendant 10 min.
   3. Ajouter 750 μL de solution colorante (réactif D) par oscillation vortex, et incuber l’échantillon pendant 30 min dans des conditions d’obscurité. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 10 min, puis jeter le surnageant.
   4. Ajouter 1 μL de solution de nettoyage (réactif E) et bien mélanger. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 10 min et jeter le surnageant.
   5. Ajouter 1 μL de solution de dissociation (réactif F) à l’échantillon et bien mélanger. Incuber l’échantillon pendant 30 min dans des conditions d’obscurité. Enfin, déterminer la teneur en GAG à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nm.
4. Analyse au microscope électronique à balayage (MEB) et au microscope électronique à transmission (MET) du cartilage décellularisé
   1. Comparez le cartilage décellularisé et le tissu cartilagineux normal. Placez l’échantillon dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 %, incubez à 4 °C pendant la nuit, puis lavez-le trois fois avec du PBS.
   2. Fixez l’échantillon dans de l’OsO4 à 1 % pendant 1 h, puis lavez-le trois fois avec du PBS.
   3. Déshydrater l’échantillon par immersion séquentielle dans de l’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %, ainsi que de l’acétone à 100 % pendant 15 min chacun. Placer l’échantillon dans une solution mixte d’hexaméthyldisilazane et d’éthanol (1 :1) pendant 15 min, suivi d’une immersion dans de l’hexaméthyldisilazane pur pendant 15 min.
   4. Placez l’échantillon dans un séchoir HCP-2, puis séchez-le à l’aide d’azote liquide. Ensuite, enduisez l’échantillon entièrement séché d’une fine couche d’or-palladium à l’aide d’un revêtement par pulvérisation cathodique et imagez à l’aide d’un MEB. Le revêtement par pulvérisation cathodique a été effectué à une puissance de 120 W pendant 5 min. L’expérience a été réalisée dans les conditions suivantes : une tension de fonctionnement de 15 kV et un degré de vide inférieur à 5 x 10⁻⁵ Pa.
   5. Pour l’analyse MET, placer l’échantillon dans un mélange d’acétone anhydre et de résine (1 :1) pendant 1 h, suivi d’un mélange d’acétone anhydre et de résine (1 :3) pendant 3 h. Ensuite, placez l’échantillon dans de la résine pendant la nuit.
      1. Placez l’échantillon dans des capsules remplies de milieu et chauffez à 70 °C pendant 9 h.
      2. Après l’enrobage, coupez l’échantillon en tranches minces de 70 nm à l’aide d’un microtome ultrafin et placez-le sur une maille de cuivre.
      3. Pipeter 20 μL de solution de coloration à l’acétate d’uranyle sur la maille de cuivre et colorer pendant 15 min à RT. Retirez la solution de coloration en lavant doucement la maille deux fois avec de l’eau distillée.
      4. Ensuite, appliquez 20 μL de solution de coloration au citrate de plomb sur la maille de cuivre et colorez pendant 15 minutes à RT. Lavez la maille trois fois avec de l’eau distillée.
      5. Placez la maille de cuivre sur une boîte de Pétri propre tapissée de papier filtre. Après le séchage à l’air libre, photographiez les sections à l’aide de la MET et de la MET. La sonde a été appliquée avec une force descendante de 500 nN, balayée à une vitesse de 1 Hz et avait une constante élastique (valeur k) de 40 ^Nm-1. Le rayon de la pointe de la sonde a été mesuré à 8 nm.

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Résultats

Pour préparer un meilleur hydrogel de cartilage DC-ECM, nous avons étudié et passé en revue la littérature précédente et comparé les différents protocoles de décellularisation en termes de taux de décellularisation, d’immunogénicité et de fonctionnalité mécanique⁹.

Sur cette base, nous avons préparé l’hydrogel cartilagineux DC-ECM et exploré l’effet d’une bio-encre d’exosome de cellules souches mésenchymateuses à matrice extractive orienté...

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Discussion

Ce protocole fournit une approche systématique pour la préparation d’hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée qui imitent étroitement la MEC native du tissu cartilagineux. Le protocole implique une combinaison de perturbations physiques, chimiques et enzymatiques pour éliminer le matériel cellulaire tout en préservant la structure et la composition de l’ECM. Les étapes critiques du protocole comprennent l’ajustement du temps et des méthodes de décellularisation et la garantie d?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1