Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

Résumé

Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.

Résumé

L’épithélium intestinal joue un rôle essentiel dans la santé humaine, fournissant une barrière entre l’hôte et l’environnement extérieur. Cette couche cellulaire très dynamique fournit la première ligne de défense entre les populations microbiennes et immunitaires et aide à moduler la réponse immunitaire intestinale. La perturbation de la barrière épithéliale est une caractéristique de la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) et présente un intérêt pour le ciblage thérapeutique. Le système de culture colonoïde en 3 dimensions est un modèle in vitro extrêmement utile pour étudier la dynamique des cellules souches intestinales et la physiologie des cellules épithéliales dans la pathogenèse des MII. Idéalement, l’établissement de colonoïdes à partir du tissu épithélial enflammé des animaux serait le plus bénéfique pour évaluer les influences génétiques et moléculaires sur la maladie. Cependant, nous avons montré que les changements épithéliaux in vivo ne sont pas nécessairement retenus chez les colonoïdes établis à partir de souris présentant une inflammation aiguë. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé un protocole pour traiter les colonoïdes avec un cocktail de médiateurs inflammatoires qui sont généralement élevés pendant les MII. Bien que ce système puisse être appliqué de manière omniprésente à diverses conditions de culture, ce protocole met l’accent sur le traitement à la fois sur les colonoïdes différenciés et sur les monocouches à 2 dimensions dérivées de colonoïdes établis. Dans un environnement de culture traditionnel, les colonoïdes sont enrichis en cellules souches intestinales, offrant un environnement idéal pour étudier la niche des cellules souches. Cependant, ce système ne permet pas une analyse des caractéristiques de la physiologie intestinale, telles que la fonction de barrière. De plus, les colonoïdes traditionnels n’offrent pas la possibilité d’étudier la réponse cellulaire des cellules épithéliales différenciées en phase terminale aux stimuli pro-inflammatoires. Les méthodes présentées ici fournissent un cadre expérimental alternatif pour remédier à ces limitations. Le système de culture monocouche en 2 dimensions offre également la possibilité de cribler des médicaments thérapeutiques ex vivo. Cette couche polarisée de cellules peut être traitée avec des médiateurs inflammatoires sur la face basale de la cellule et en concomitance avec des thérapies putatives apicalement pour déterminer leur utilité dans le traitement des MII.

Introduction

La maladie inflammatoire de l’intestin (MII) est une maladie chronique, rémittente et récurrente caractérisée par des épisodes d’inflammation et de quiescence clinique. L’étiologie de la MII est multifactorielle, mais les principales caractéristiques de la maladie comprennent une fonction de barrière défectueuse et une perméabilité accrue de l’épithélium intestinal, en plus des cascades de signalisation pro-inflammatoires activées dans le compartiment épithélial ^1,2. Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été utilisés pour récapituler la réponse épithéliale au cours de la MII, y compris la....

Protocole

Toutes les expériences utilisant des tissus murins décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Review Board de l’Université de Pittsburgh et menées conformément aux directives établies par le Comité de recherche et de soins des animaux de l’Université de Pittsburgh et de l’UPMC.

1. Préparation à la culture

REMARQUE : Tous les réactifs sont répertoriés dans la section Tableau des matériaux et toutes les compositions de solution se trouvent dans le tableau de composition de la solution (Tableau 1).

1. Préparer le produit de lavage de la souris comme ....

Discussion

Le développement organoïde a révolutionné la façon dont la communauté scientifique étudie les systèmes d’organes in vitro avec la capacité de récapituler partiellement la structure cellulaire et la fonction d’un animal ou d’un humain dans une boîte. De plus, les systèmes organoïdes dérivés de maladies humaines offrent un outil prometteur pour la médecine personnalisée qui pourrait guider la prise de décision thérapeutique. Ici, nous décrivons un protocole d’isolation de crypte qui fon.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)