Transplantation cardiaque abdominale hétérotopique modifiée et nouveau modèle de régurgitation aortique chez le rat

Résumé

Cette étude démontre une technique de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique reproductible chez le rat que les débutants peuvent apprendre et effectuer. De plus, un nouveau modèle de régurgitation aortique chez le rat est généré en effectuant une transplantation cardiaque abdominale hétérotopique et en endommageant la valve aortique du donneur à l’aide d’un fil guide après la récolte.

Résumé

Au cours des 50 dernières années, de nombreux chercheurs ont signalé une transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris et le rat, avec quelques variations dans la technique chirurgicale. Modifier la procédure de transplantation pour renforcer la protection myocardique pourrait prolonger le temps d’ischémie tout en préservant la fonction cardiaque du donneur. Les points clés de cette technique sont les suivants : transecter l’aorte abdominale du donneur avant la récolte pour décharger le cœur du donneur ; perfusion des artères coronaires du donneur avec une solution cardioplégique froide; et le refroidissement topique du cœur du donneur pendant la procédure d’anastomose. Par conséquent, étant donné que cette procédure prolonge le temps d’ischémie acceptable, les débutants peuvent facilement l’effectuer et atteindre un taux de réussite élevé.

De plus, un nouveau modèle de régurgitation aortique (AR) a été établi dans ce travail en utilisant une technique différente de celle existante, qui est créée en insérant un cathéter de l’artère carotide droite et en perforant la valve aortique native sous guidage échocardiographique continu. Une transplantation cardiaque abdominale hétérotopique a été réalisée à l’aide du nouveau modèle AR. Dans le protocole, après la récolte du cœur du donneur, un fil guide rigide est inséré dans l’artère brachiocéphalique du donneur et avancé vers la racine aortique. La valve aortique est perforée en poussant le fil guide plus loin même après que la résistance a été ressentie, induisant ainsi la RA. Il est plus facile d’endommager la valve aortique en utilisant cette méthode qu’avec la procédure décrite dans le modèle AR conventionnel. De plus, ce nouveau modèle d’EI ne contribue pas à la circulation du receveur; par conséquent, cette méthode devrait produire un modèle d’EI plus sévère que la procédure conventionnelle.

Introduction

La transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez le rat a été signalée pour la première fois en 1964 par Abbott et ^coll.1 et a été utilisée pour étudier le rejet aigu et chronique de l’allogreffe, la vasculopathie par allogreffe cardiaque, les lésions d’ischémie-reperfusion et le remodelage cardiaque 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Certaines modifications ont été apportées à la procédure au cours des 50 dernières années. Les principes fondamentaux de la procédure actuelle sont les suivants. L’aorte ascendante et l’artère pulmonaire (AP) du donneur sont anastomosées d’un bout à l’autre de l’aorte abdominale et de la veine cave inférieure du receveur, respectivement. Bien que l’oreillette gauche et le ventricule du donneur ne reçoivent aucun flux intracavitaire, le sang circule vers le système coronaire du donneur; Par conséquent, le cœur du donneur recommence à battre après le déserrage.

Certains experts ayant de l’expérience dans des centaines ou des milliers d’opérations ont signalé un taux de réussite élevé avec un temps d’ischémie court pour la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique 2,3,4,5; Cependant, il est difficile pour les débutants d’atteindre le temps d’ischémie court dès le début. Une cardioprotection suffisante est un facteur important pour obtenir une bonne contraction cardiaque du cœur du donneur. Une protection myocardique insuffisante peut raidir le cœur du donneur. Par conséquent, nous avons modifié la procédure de transplantation pour renforcer la protection du cœur du donneur. L’un des objectifs de cette étude est de démontrer une procédure de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique reproductible que les débutants peuvent facilement effectuer car elle prolonge le temps d’ischémie acceptable.

De plus, certains chercheurs ont rapporté un modèle de régurgitation aortique (AR) chez le rat, qui a été utilisé pour examiner les effets des agents sur le remodelage ventriculaire gauche (VG)^12,13,14,15. La procédure conventionnelle comprend les éléments suivants: (1) une incision latérale droite du col est faite pour exposer l’artère carotide droite après l’anesthésie; 2° un cathéter est canulé de ce vaisseau et avancé vers la racine aortique; et (3) la RA est induite par la perforation de la valve aortique native sous guidage échocardiographique continu.

Cependant, perforer la valve aortique tout en tenant la sonde d’échocardiographie et obtenir une bonne vue de l’aorte ascendante, de la valve aortique et du cathéter avec un échocardiogramme est difficile. De plus, l’insuffisance cardiaque consécutive à une RA aiguë est une autre complication. Par conséquent, un nouveau modèle de RA, qui peut être facilement créé et ne contribue pas à la circulation du destinataire, a été établi dans ce travail pour résoudre ces défis. L’autre objectif de cette étude est de créer un modèle AR en utilisant la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique et en endommageant la valve aortique du donneur à l’aide d’un fil guide après la récolte.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux « Grandes lignes de la loi sur le bien-être et la gestion des animaux » et aux « Normes relatives aux soins, à la garde et à la réduction de la douleur des animaux de laboratoire » du ministère de l’Environnement du gouvernement du Japon et aux « Directives pour la bonne conduite de l’expérimentation animale » du Conseil scientifique du Japon^{16, 17,18}. Les protocoles sur les animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Tokyo (M-P19-065).

1. Transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez le rat

REMARQUE: Des transplantations cardiaques abdominales hétérotopiques ont été effectuées chez des rats Jcl:Wistar mâles âgés de 7 à 9 semaines. Un microscope avec un grossissement de 6,7x à 45x a été utilisé pour effectuer la procédure. Les instruments chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilisation.

1. Récolte du cœur du donneur
   1. Anesthésier le rat donneur par injection intrapéritonéale de médétomidine (0,15 mg/kg), de midazolam (2,0 mg/kg) et de butorphanol (2,5 mg/kg).
   2. Placez le rat en décubitus dorsal sur un coussin chauffant au-dessus de la planche opératoire et fixez les membres à l’aide de bandes élastiques. Enlevez autant de fourrure que possible avec un rasoir électrique et une crème dépilatoire. Ensuite, nettoyez la zone d’opération avec de l’iode et un gommage à l’alcool à 70% trois fois pour la désinfection.
   3. Faites une petite incision d’environ 1 cm avec des ciseaux, suivie de l’administration d’héparine à l’abdomen (100 U).
   4. Étendre l’incision abdominale longitudinalement au-dessus du méat urétral externe jusqu’au processus sous-xiphoïde avec des ciseaux.
   5. Exposez l’aorte abdominale avec des cotons-tiges stérilisés et transectez avec des ciseaux pour décharger le cœur du donneur.
   6. Inciser le diaphragme le long de la paroi thoracique antérieure et ouvrir la paroi thoracique avec une incision en forme de V à l’aide de ciseaux. Élevez la paroi thoracique antérieure à côté de la tête et fixez-la avec des épingles.
   7. Initier le refroidissement topique du cœur à l’aide de glace fondue.
   8. Collez la veine cave inférieure avec une suture en soie 5-0.
   9. Retirez le thymus avec des ciseaux, puis identifiez l’aorte ascendante et l’AP provenant du cœur. L’aorte ascendante et l’AP sont respectivement à droite et à gauche.
   10. Transecter l’artère brachiocéphalique provenant de l’arc aortique avec des ciseaux Potts pour une exsanguination supplémentaire.
   11. Insérez une aiguille de 23 G dans la veine cave inférieure et administrez 2 à 3 mL de solution cardioplégique de Krebs-Henseleit modifiée à froid. Après l’administration, le cœur cesse progressivement de battre. Simultanément, assurez-vous que le sang dans le cœur est drainé autant que possible.
   12. Liférez la veine cave inférieure avec de la soie 5-0 et divisez-la distalement à la ligature à l’aide de ciseaux Potts.
   13. Après avoir disséqué le tissu conjonctif entre le poumon droit et l’œsophage avec des ciseaux, ligaturez le hile du poumon droit avec de la soie 5-0 et divisez-le distalement à la ligature avec des ciseaux.
   14. Libellez la veine cave supérieure droite avec de la soie 5-0 et divisez-la distalement à la ligature avec des ciseaux Potts.
   15. Insérez une lame des ciseaux de Potts dans le sinus transversal et divisez l’aorte ascendante et le PA en bloc aussi distalement que possible.
   16. Libellez la veine cave supérieure gauche avec une suture de soie 5-0, et divisez-la distalement à la ligature et proximale à la veine azygos avec des ciseaux de Potts.
   17. Après avoir disséqué le tissu conjonctif entre le poumon gauche et l’œsophage avec des ciseaux, ligaturez le hile du poumon gauche avec une suture en soie 5-0 et divisez-le distalement à la ligature avec des ciseaux.
   18. Liférez la base du cœur avec une suture en soie 5-0 et divisez-la distalement à la ligature avec des ciseaux. Cette soie est utilisée pour rétracter le cœur du donneur lors de l’anastomose du cœur du donneur. À ce stade, retirez le cœur du donneur de la cavité péricardique.
   19. Après avoir placé le cœur du donneur sur l’assiette remplie de glace fondante et de solution saline froide normale, disséquez le tissu conjonctif entre l’aorte ascendante et l’AP à l’aide de micro-pincettes.
   20. Perfuser 2-3 mL de solution cardioplégique de Krebs-Henseleit modifiée à froid de l’aorte ascendante dans les artères coronaires en serrant l’ostium de l’aorte ascendante avec une pince à épiler jusqu’à ce que la couleur rouge des artères coronaires soit diminuée.
   21. Conservez le cœur du donneur dans une solution cardioplégique Krebs-Henseleit modifiée à froid.
2. Préparation du bénéficiaire
   REMARQUE : Avant de prélever le cœur du donneur, complétez la préparation du receveur.
   1. Anesthésier le rat receveur par injection intrapéritonéale de médétomidine (0,15 mg/kg), de midazolam (2,0 mg/kg) et de butorphanol (2,5 mg/kg). Après intubation endotrachéale à l’aide d’un cathéter intraveineux de 16 G, maintenir l’anesthésie par inhalation de sévoflurane (induction à 5,0% et entretien à 2,5% avec un débit_O2 de 0,3 L/min).
   2. Placez le rat en décubitus dorsal sur un coussin chauffant posé sur la planche opératoire et fixez les membres à l’aide de bandes élastiques. Enlevez autant de fourrure que possible avec un rasoir électrique et une crème dépilatoire. De plus, nettoyez le site chirurgical avec de l’iode et un gommage à 70% d’alcool trois fois pour la désinfection.
   3. À l’aide de ciseaux, pratiquer une incision abdominale médiane d’environ 6 à 7 cm au-dessus du méat urétral externe jusqu’au processus sous-xiphoïde.
   4. Rétractez l’intestin grêle vers le côté supérieur droit du receveur avec des cotons-tiges stérilisés et enveloppez-le de gaze imbibée d’une solution saline chaude normale.
   5. Disséquer le tissu conjonctif entre l’intestin grêle et le côlon avec des ciseaux.
   6. Disséquez la région avasculaire du côlon avec des ciseaux et collez avec deux morceaux de gaze en forme de bande pour rétracter le côlon vers la gauche.
   7. Exposez l’aorte abdominale et la veine cave inférieure avec des cotons-tiges stérilisés. Liférez les branches relativement grosses des deux vaisseaux avec du nylon 9-0 et divisez.
3. Transplantation cardiaque hétérotopique
   1. Administrer de l’héparine à l’abdomen du receveur (100 U) avant d’entreprendre la transplantation cardiaque du donneur.
   2. Serrez l’aorte abdominale et la veine cave inférieure en bloc avec des pinces à pince latérale.
   3. Percez l’aorte abdominale avec une aiguille de 23 G pliée à 90° et étendez le trou longitudinalement avec des ciseaux Potts au moins jusqu’au diamètre de l’aorte ascendante du donneur. Ensuite, rincer la lumière avec une solution saline normale héparinée (10 U/mL) pour enlever les caillots.
   4. Placez la petite assiette stérilisée sur le côté droit de l’aorte abdominale du receveur et de la veine cave inférieure. Placez le cœur du donneur sur l’assiette remplie de glace fondante et de solution saline froide normale, qui doit être réapprovisionnée toutes les 5 minutes.
   5. Attachez l’aorte ascendante du donneur à l’aorte abdominale du receveur avec deux points de suture en nylon 9-0 aux positions 12 heures et 6 heures.
   6. Faites pivoter la carte opératoire de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre.
   7. Anastomose le côté gauche de l’aorte abdominale du receveur et l’aorte ascendante du donneur en utilisant une suture en nylon 9-0 de la caudale à la direction crânienne, et attacher avec une suture de séjour en nylon 9-0 à la position 12 heures (total de sept à huit sutures).
   8. Faites pivoter la carte opératoire dans le sens inverse des aiguilles d’une montre de 180°. Translocaliser le cœur du donneur à gauche de l’aorte abdominale et de la veine cave inférieure du receveur. Il est facile de rétracter le cœur du donneur vers le côté gauche avec la suture en soie 5-0 qui a été utilisée lors de la ligature de la base du cœur du donneur (étape 1.1.18).
   9. Anastomose le côté droit de l’aorte abdominale du receveur et l’aorte ascendante du donneur en utilisant une suture en nylon 9-0 de la direction crânienne à la direction caudale, et attacher avec une suture de séjour en nylon 9-0 à la position 6 heures (total de sept à huit sutures).
   10. Percer la veine cave inférieure à l’aide d’une aiguille de 23 G pliée à 90° distalement à l’anastomose entre l’aorte ascendante du donneur et l’aorte abdominale du receveur, et étendre le trou longitudinalement avec des ciseaux Potts jusqu’à un diamètre supérieur au diamètre de l’AP du donneur. Par la suite, rincer la lumière avec une solution saline normale héparinée pour éliminer les caillots.
   11. Attachez l’AP du donneur à la veine cave inférieure du receveur à l’aide d’une suture de séjour en nylon 9-0 à la position 6 heures.
   12. Anastomose le côté gauche de la veine cave inférieure du receveur et l’AP du donneur avec une suture en nylon 9-0 de la caudale à la direction crânienne (total de sept à huit sutures).
   13. Attachez l’AP du donneur à la veine cave inférieure du receveur avec une suture de séjour en nylon 9-0 à la position 12 heures. De plus, attachez cette suture de séjour au nylon 9-0 du côté gauche de l’anastomose entre l’AP du donneur et la veine cave inférieure du receveur.
   14. Anastomose le côté droit de la veine cave inférieure du receveur et l’AP du donneur en utilisant une suture en nylon 9-0 de la direction crânienne à la direction caudale, et attacher avec la suture de séjour de 6 heures (total de 10-12 sutures).
   15. Appliquez des agents hémostatiques sur les deux anastomoses et placez de la gaze autour d’eux.
   16. Après avoir relâché les pinces à pince latérales, comprimez doucement les anastomoses avec des cotons-tiges stérilisés pour faciliter l’hémostase. Par la suite, appliquez une solution saline chaude normale sur le cœur du donneur pour lui procurer de la chaleur. Le cœur du donneur commence à se fibriller en quelques dizaines de secondes et récupère au rythme sinusal après quelques minutes.
   17. Retournez l’intestin grêle dans l’abdomen du receveur à l’aide de cotons-tiges stérilisés. Des précautions doivent être prises pour éviter de comprimer le cœur du donneur ou de tordre l’intestin grêle.
   18. Fermez la paroi abdominale à l’aide d’une suture en soie 4-0. Après avoir administré de l’atipamézole (0,75 mg / kg) dans l’abdomen, fermez la peau avec une suture de soie 4-0.
   19. Arrêtez l’anesthésie par inhalation et injectez 1 mL de lidocaïne à 1 % sous l’incision. De plus, injectez 2 mL de solution saline chaude normale par voie sous-cutanée pour compenser la perte de sang.
   20. Réchauffer le rat récepteur à l’aide d’une lampe à diodes électroluminescentes. Le rat receveur reprend conscience et peut être extubé environ 30 à 40 minutes après l’arrêt de l’anesthésie par inhalation.

2. Nouveau modèle de RA utilisant la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez le rat

REMARQUE: Un nouveau modèle d’AR utilisant la transplantation cardiaque abdominale hétérotopique a été généré à partir de rats Jcl:Wistar mâles âgés de 7 à 9 semaines. Un microscope avec un grossissement de 6,7x à 45x a été utilisé pour effectuer la procédure. Les instruments chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilisation.

1. Récolte du cœur du donneur
   REMARQUE : une boîte de Petri modifiée avec un trou au centre, une pince et un fil guide rigide est nécessaire pour créer le nouveau modèle AR (Figure 1).
   1. Comme décrit ci-dessus, prélever le cœur du donneur en utilisant une procédure similaire à la greffe normale chez le rat, à l’exception des étapes concernant l’aorte ascendante et la transsection PA (1.1.1-1.1.14, 1.1.16-1.1.17)
   2. Avant de transecter l’aorte ascendante et l’AP, retirez le tissu adipeux à l’avant des deux vaisseaux à l’aide de ciseaux Potts. Par la suite, disséquez le tissu conjonctif entre les deux vaisseaux à l’aide d’une pince à épiler.
   3. Insérez une lame des ciseaux Potts dans le sinus transversal. Tirez les ciseaux Potts vers l’opérateur et insérez la lame entre l’aorte ascendante et le PA. Par la suite, transecter uniquement l’AP (Figure 2A), puis transecter l’aorte distale à l’artère brachiocéphalique à l’aide de ciseaux Potts (Figure 2B).
   4. Après avoir ligaturé la base du cœur à l’aide d’une suture en soie 5-0 et l’avoir divisée distalement à la ligature avec des ciseaux, disséquer le tissu conjonctif entre l’aorte ascendante et l’AP et perfuser la solution cardioplégique de Krebs-Henseleit modifiée à froid dans les artères coronaires en utilisant une procédure similaire à la greffe normale (étapes 1.1.18-1.1.20).
   5. Fixez le cœur du donneur à l’aide d’une pince (figure 2C). Ensuite, couvrez le cœur du donneur avec une boîte de Petri modifiée avec un trou au centre et immobilisez l’aorte ascendante avec un clip vasculaire.
   6. Insérez un fil guide rigide dans l’artère brachiocéphalique (Figure 2D). Poussez le fil guide plus loin même après que la résistance est rencontrée, et percez la valve aortique si une perte de résistance est confirmée. Effectuez plusieurs perforations si un modèle d’AR sévère doit être créé.
   7. Transecter l’aorte proximale à l’artère brachiocéphalique pour enlever la partie serrée avec le clip vasculaire (Figure 2E). Par la suite, conserver le cœur du donneur dans une solution cardioplégique de Krebs-Henseleit modifiée à froid en utilisant une procédure similaire à la greffe normale (étape 1.1.21).
2. Préparation du bénéficiaire
   REMARQUE : Avant de prélever le cœur du donneur, complétez la préparation du receveur.
   1. Comme décrit ci-dessus, la procédure de préparation du receveur est similaire à celle de la greffe normale (étapes 1.2.1-1.2.7).
3. Transplantation cardiaque hétérotopique
   1. Comme décrit ci-dessus, la procédure de transplantation cardiaque du donneur est similaire à la transplantation normale (étapes 1.3.1-1.3.20).

Résultats

En ce qui concerne le modèle normal, une bonne contraction du VG a été établie avec succès après le déserrage. Le temps d’ischémie du cœur transplanté et le temps d’anesthésie du receveur étaient d’environ 60 minutes et 130 minutes, respectivement (tableau 1).

Une bonne contraction du BT a également été obtenue après le dé-clampage dans le nouveau modèle AR. Le temps ischémique du cœur transplanté et le temps d’anesthésie du receveur dans le modè...

Discussion

Des étapes clés ont été découvertes pour empêcher le cœur du donneur de se raidir pendant l’implantation. Tout d’abord, il est essentiel de transecter l’aorte abdominale du donneur avant de prélever pour décharger le cœur du donneur ^4,7. Si l’intervention chirurgicale du donneur est réalisée sans intubation endotrachéale, la respiration cesse après la thoracotomie, ce qui obstrue la circulation pulmonaire du donneur. Par conséquent, le cœu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antisedan (atipamezole)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Domitor (medetomidine)	Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
Dormicum (midazolam)	Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.
heparin	AY Pharmaceuticals Co.,Ltd.
Jcl:Wistar rats	CLEA Japan, Inc.
microscope	Orinpas Co., Ltd.	SZ61
modified Krebs-Henseleit cardioplegic solution	Merck KGaA
sevoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation
SURGICEL FIBRILLAR	Johnson & Johnson K.K.
Vetorphale (butorphanol)	Meiji Animal Health Co., Ltd.