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Résumé

Ce protocole étudie les effets protecteurs de la platycodine D sur la stéatose hépatique non alcoolique dans un modèle in vitro induit par l’acide palmitique.

Résumé

L’apparition de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a augmenté à un rythme alarmant dans le monde entier. Platycodon grandiflorum est largement utilisé comme ethnomédecine traditionnelle pour le traitement de diverses maladies et est un aliment fonctionnel typique qui peut être incorporé dans l’alimentation quotidienne. Des études ont suggéré que la platycodine D (), l’un des principaux ingrédients actifs de Platycodon grandiflorum, a une biodisponibilité élevée et atténue considérablement la progression de la NAFLD, mais le mécanisme sous-jacent de ceci n’est pas encore clair. Cette étude vise à étudier l’effet thérapeutique de la MP contre la NAFLD in vitro. Les cellules AML-12 ont été prétraitées avec de l’acide palmitique (PA) 300 μM pendant 24 heures pour modéliser la NAFLD in vitro. Ensuite, les cellules ont été traitées avec la MP ou n’ont reçu aucun traitement de MP pendant 24 heures. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été analysés à l’aide d’une coloration au diacétate de 2′,7′-dichloro-dihydrofluorescéine (DCFH-DA), et le potentiel de membrane mitochondriale a été déterminé par la méthode de coloration JC-1. De plus, les niveaux d’expression protéique de LC3-II/LC3-I et p62/SQSTM1 dans les lysats cellulaires ont été analysés par transfert Western. La MP a permis de réduire de manière significative les niveaux de ROS et de potentiel de membrane mitochondriale dans le groupe traité par PA par rapport au groupe témoin. Pendant ce temps, la MP a augmenté les taux de LC3-II/LC3-I et diminué les taux de p62/SQSTM1 dans le groupe traité par PA par rapport au groupe témoin. Les résultats ont indiqué que la MP améliorait la NAFLD in vitro en réduisant le stress oxydatif et en stimulant l’autophagie. Ce modèle in vitro est un outil utile pour étudier le rôle de la MP dans la NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), qui est la racine séchée de Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., est utilisé dans la médecine traditionnelle chinoise (MTC). Il est principalement produit dans les régions du nord-est, du nord, de l’est, du centre et du sud-ouest de la Chine1. Les composants PG comprennent les saponines triterpénoïdes, les polysaccharides, les flavonoïdes, les polyphénols, les polyéthylèneglycols, les huiles volatiles et les minéraux2. PG a une longue histoire d’être utilisé comme un aliment et un médicament à base de plantes en Asie. Traditionnellement, cette plante était utilisée pour fabriquer des médicaments contre les maladies pulmonaires. La pharmacologie moderne fournit également des preuves de l’efficacité du PG pour le traitement d’autres maladies. Des études ont montré que PG a un effet thérapeutique sur une variété de modèles de lésions hépatiques induites par les médicaments. La supplémentation alimentaire en extraits de PG ou de platycodine peut améliorer l’obésité induite par un régime riche en graisses et ses maladies métaboliques connexes 3,4,5. Les polysaccharides de PG peuvent être utilisés pour le traitement des lésions hépatiques aiguës causées par le LPS/D-GalN chez la souris6. De plus, les saponines des racines de PG améliorent la stéatohépatite non alcoolique induite par un régime riche en graisses (NASH)7. De plus, la platycodine D (), l’un des composants thérapeutiques les plus importants du PG, peut améliorer l’expression des récepteurs des lipoprotéines de basse densité et l’absorption des lipoprotéines de basse densité dans les cellules du carcinome hépatocellulaire humain (HepG2)8. De plus, la MP peut également induire l’apoptose et inhiber l’adhésion, la migration et l’invasion dans les cellules HepG2 9,10. Ainsi, dans cette étude, les cellules AML-12 de l’hépatome de souris sont utilisées pour la construction de modèles in vitro et pour étudier plus en détail les effets pharmacologiques et les mécanismes sous-jacents de la MP dans ce modèle.

Le terme stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) fait référence à un groupe de maladies du foie qui comprend la stéatose simple, la NASH, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire11. Bien que la pathogenèse de la NAFLD ne soit pas complètement comprise, de la théorie classique des « deux coups » à la théorie actuelle des « coups multiples », la résistance à l’insuline est considérée comme centrale dans la pathogenèse de la NAFLD12,13,14. Des études ont démontré que la résistance à l’insuline dans les hépatocytes pourrait entraîner une augmentation des acides gras libres, qui forment des triglycérides qui se déposent dans le foie et rendent le foie gras15,16. L’accumulation de graisse peut entraîner une lipotoxicité, un dysfonctionnement mitochondrial induit par le stress oxydatif, un stress du réticulum endoplasmique et la libération de cytokines inflammatoires, entraînant la pathogenèse et la progression de NAFLD17,18. En outre, l’autophagie joue également un rôle dans la pathogenèse de la NAFLD, car elle est impliquée dans la régulation de la sensibilité cellulaire à l’insuline, du métabolisme des lipides cellulaires, des lésions hépatocytes et de l’immunité innée 19,20,21.

Une variété de modèles animaux et de modèles cellulaires ont été établis pour fournir une base pour explorer la pathogenèse et les cibles thérapeutiques potentielles de NAFLD22,23. Cependant, les modèles animaux uniques ne peuvent pas imiter complètement tous les processus pathologiques de NAFLD24. Les différences individuelles entre les animaux conduisent à des caractéristiques pathologiques différentes. L’utilisation de lignées cellulaires hépatiques ou d’hépatocytes primaires dans les études in vitro de la NAFLD assure une cohérence maximale dans les conditions expérimentales. La dérégulation du métabolisme lipidique hépatique peut entraîner des niveaux plus élevés d’accumulation de gouttelettes lipidiques hépatocytes dans NAFLD25. Les acides gras libres tels que l’acide oléique et l’huile de palme ont été utilisés dans le modèle in vitro pour imiter la NAFLD causée par un régime richeen graisses 26,27. La lignée cellulaire d’hépatoblastome humain HepG2 est souvent utilisée in vitro dans la construction de modèles NAFLD, mais, en tant que lignée cellulaire tumorale, le métabolisme des cellules HepG2 est significativement différent de celui des cellules hépatiques dans des conditions physiologiques normales28. Par conséquent, l’utilisation d’hépatocytes primaires ou d’hépatocytes primaires de souris pour construire le modèle NAFLD in vitro pour le dépistage de médicaments est plus avantageuse que l’utilisation de lignées cellulaires tumorales. En comparant l’examen synergique des effets des médicaments et des cibles thérapeutiques dans les modèles animaux et les modèles d’hépatocytes in vitro, il semble que l’utilisation d’hépatocytes de souris pour construire le modèle NAFLD in vitro ait un meilleur potentiel d’application.

Les acides gras libres qui pénètrent dans le foie sont oxydés pour produire de l’énergie ou stockés sous forme de triglycérides. De manière significative, les acides gras libres ont une certaine lipotoxicité et peuvent induire un dysfonctionnement cellulaire et l’apoptose12. L’acide palmitique (PA) est l’acide gras saturé le plus abondant dans le plasma humain29. Lorsque les cellules du tissu non adipeux sont exposées à des concentrations élevées de PA pendant une longue période, cela stimule la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et provoque un stress oxydatif, une accumulation de lipides et même une apoptose30. Par conséquent, de nombreux chercheurs utilisent l’AP comme inducteur pour stimuler les cellules hépatiques à produire des ROS et, ainsi, construire le modèle in vitro de la stéatose hépatique et évaluer les effets protecteurs de certaines substances actives sur les cellules31,32,33,34. Cette étude introduit un protocole pour étudier les effets protecteurs de la MP sur un modèle cellulaire de NAFLD induite par PA.

Protocole

Les cellules AML-12 (une lignée cellulaire d’hépatocytes de souris normale) sont utilisées pour les études cellulaires. Les cellules proviennent d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Prétraitement des cellules AML-12 pour modéliser la NAFLD in vitro

  1. Maintenir les cellules dans des milieux de culture cellulaire normaux (DMEM plus F12 de Ham [1:1] contenant 0,005 mg/mL d’insuline, 5 ng/mL de sélénium, 0,005 mg/mL de transferrine, 40 ng/mL de dexaméthasone et 10 % de sérum fœtal bovin [FBS], voir le tableau des matières) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2.
  2. Ensemencer les cellules dans des plaques de 12 puits (1 mL/puits) d’une densité de 2,8 x 105 cellules/puits.
    REMARQUE: Toutes les opérations de digestion cellulaire et d’échange de milieu sont effectuées dans une enceinte de biosécurité pour éviter de contaminer les cellules.
  3. Retirer le milieu de culture des cellules après la nuit d’incubation (~10 h), puis laver les cellules deux fois avec 1 mL de milieu sans sérum (par puits).
  4. Divisez la plaque cellulaire à 12 puits en quatre groupes de traitement différents de gauche à droite, y compris (1) le groupe témoin, (2) le groupe traité par MP, (3) le groupe traité par AP et (4) le groupe traité AP +.
    REMARQUE : Trois répétitions de chaque groupe de traitement expérimental sont disposées de haut en bas sur la même plaque cellulaire à 12 puits.
  5. Ajouter le milieu de culture cellulaire normal (1 mL/puits) au groupe témoin et au groupe traité par MP, et ajouter le milieu de culture cellulaire normal (1 mL/puits) supplémenté de 300 μM de PA au groupe traité par PA et au groupe traité PA +.
  6. Retirer le milieu de culture des cellules après 24 h d’incubation, puis laver les cellules avec 1 mL de milieu sans sérum (par puits) deux fois.
  7. Ajouter un milieu de culture cellulaire normal (1 mL/puits) complété par un véhicule (diméthylsulfoxyde, DMSO, 0,1 % v/v) au groupe témoin; ajouter des milieux de culture cellulaire normaux (1 mL/puits) supplémentés de 1 μM de MP au groupe traité par MP; ajouter des milieux de culture cellulaire normaux (1 mL/puits) supplémentés en 300 μM d’AP dans le groupe traité par AP; ajouter des milieux de culture cellulaire normaux (1 mL/puits) supplémentés de 300 μM d’AP et de 1 μM de DP au groupe traité PA + MP.
  8. Après une incubation supplémentaire de 24 heures, étudier les effets protecteurs de la MP sur les cellules en utilisant la coloration au diacétate de 2′,7′-dichloro-dihydrofluorescéine (DCFH-DA) (étape 2), la coloration JC-1 (étape 3) et le transfert Western (étape 4).
    NOTE: Toutes les opérations d’incubation se font à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2.

2. Mesure de l’évolution de la production de ROS

REMARQUE: Les niveaux intracellulaires de ROS dans les cellules sont évalués sur la base du test de coloration DCFH-DA.

  1. À la fin de la période de traitement (étape 1.8), laver les cellules avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate par puits (1x PBS, pH 7,4) trois fois, puis colorer les cellules avec 100 μL de 10 μM DE DCFH-DA par puits (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules dans l’obscurité pendant 30 min.
    REMARQUE: Si aucune fluorescence verte évidente n’est observée après 30 minutes d’incubation, le temps d’incubation de la sonde et des cellules peut être augmenté de manière appropriée (30-60 min). Si une surexposition de la valeur de fluorescence verte est observée après 30 minutes d’incubation, le temps d’incubation de la sonde et des cellules peut être réduit de manière appropriée (15-30 min).
  2. Lavez les cellules avec 1x PBS (1 mL/puits) trois fois. Ajouter 1 mL de 1x PBS à chaque puits.
  3. Placez la plaque à 12 puits sur la platine du microscope (voir Tableau des matériaux), puis utilisez un objectif 20x pour observer la morphologie des cellules (grossissement: 200x).
  4. Capturez trois images de fluorescence représentatives (grossissement: 200x) pour chaque puits sur le microscope à fluorescence en utilisant le canal fluorescent vert avec une longueur d’onde d’excitation de 480 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
    REMARQUE: Le canal fluorescent vert avec une longueur d’onde d’excitation de 480 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm est recommandé pour détecter le DCFH-DA. De plus, DCFH-DA peut être détecté avec les paramètres pour GFP et FITC dans le microscope à fluorescence35,36.
  5. Enfin, traitez les images avec un logiciel d’acquisition d’images (voir Tableau des matériaux), puis utilisez le logiciel ImageJ pour calculer l’intensité de fluorescence moyenne de chaque groupe ou les rapports des différents groupes.
    NOTE: Les détails techniques du microscope à fluorescence et du logiciel Image J utilisés pour le travail d’imagerie ont été décrits précédemment37,38.

3. Mesure de la modification du potentiel de membrane mitochondriale

REMARQUE: Les changements dans le potentiel de la membrane mitochondriale sont surveillés par le test de coloration JC-1.

  1. À la fin de la période de traitement (étape 1.8), laver les cellules avec 1 mL de 1x PBS par puits trois fois, puis colorer les cellules avec 100 μL de solution de travail JC-1 à 5 μg/mL (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes à 37 °C dans l’obscurité.
    REMARQUE: Si aucune fluorescence verte évidente n’est observée après 30 minutes d’incubation, le temps d’incubation de la sonde et des cellules peut être augmenté de manière appropriée (30-60 min). Si une surexposition de la valeur de fluorescence verte est observée après 30 minutes d’incubation, le temps d’incubation de la sonde et des cellules peut être réduit de manière appropriée (15-30 min).
  2. Lavez les cellules avec 1x PBS (1 mL/puits) trois fois. Ajouter 1 mL de 1x PBS à chaque puits.
  3. Placez la plaque à 12 puits sur la platine du microscope, puis utilisez un objectif 20x pour observer la morphologie des cellules (grossissement: 200x).
  4. Capturez trois images de fluorescence représentatives (grossissement : 200x) pour chaque puits au microscope à fluorescence en utilisant le canal fluorescent vert avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 nm et 535 nm, respectivement, et le canal fluorescent rouge avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 550 nm et 600 nm, respectivement.
    NOTE: Le canal fluorescent vert avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 535 nm est utilisé pour détecter le monomère JC-1, qui est traité comme mitochondrie dépolarisée 39,40,41, et le canal fluorescent rouge avec une longueur d’onde d’excitation de 550 nm et une longueur d’onde d’émission de 600 nm est utilisé pour détecter le dimère JC-1, qui est traitée comme des mitochondries polarisées 39,40,41.
  5. Enfin, traitez les images avec un logiciel d’acquisition d’images, puis utilisez le logiciel Image J pour calculer l’intensité de fluorescence moyenne de chaque groupe ou les rapports des différents groupes.
    NOTE: Les détails techniques du microscope à fluorescence et du logiciel Image J utilisés pour le travail d’imagerie ont été décrits précédemment37,38.

4. Mesure des niveaux d’expression protéique de CL3-II/LC3-I et p62/SQSTM1

  1. Après le traitement (étape 1.8), laver les cellules trois fois avec 1x PBS (1 mL/puits) qui a été prérefroidi à 4 °C.
  2. Ajouter un tampon de lyse RIPA (100 μL/puits) complété par de la protéase et un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase (1x) (voir le tableau des matières) à la plaque de 12 puits, et lyser sur glace pendant 5 min.
  3. Recueillir le lysat cellulaire dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL et centrifuger à 12 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Déterminer la concentration protéique des surnageants par la méthode BCA en suivant les procédures standard42.
  4. Ajouter un tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE (5x, voir Tableau des matériaux) aux surnageants de lysat cellulaire (rapport volumique = 1:4).
  5. Mélanger par vortex (à grande vitesse pendant ~15 s), et chauffer les échantillons mélangés à 100 °C pendant 5 min pour dénaturer la protéine.
  6. Mettez le gel SDS-PAGE à 12% bien préparé à 12% dans le réservoir d’électrophorèse, puis ajoutez le tampon d’échantillon SDS (1x) dilué avec de l’eau ultra-pure à la position limite de hauteur.
    REMARQUE : Le gel FDS-PAGE est préparé à l’aide d’une trousse commerciale (voir le tableau des matériaux) conformément aux instructions du fabricant.
  7. Ajouter le marqueur protéique (5 μL/puits) et les échantillons (20 μg/puits) dans différents puits du gel SDS-PAGE.
  8. Réglez le mode de tension stable à 100 V et effectuez l’électrophorèse pendant 80 min.
  9. Après l’électrophorèse SDS-PAGE, effectuer l’électrotransfert des protéines vers une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) (0,45 μM, voir tableau des matériaux) à la suite des rapports précédemment publiés43,44.
  10. Après l’électrotransfert des protéines, laver la membrane PVDF avec 10 mL de TBST (1x TBS, 0,1% Tween 20) deux fois (5 min/temps) dans un agitateur à température ambiante.
  11. Bloquer la membrane PVDF avec 5 mL d’albumine sérique bovine (BSA, 5%) dans un agitateur à température ambiante pendant 1 h.
  12. Lavez la membrane PVDF avec 10 mL de TBST trois fois (10 min/temps). Ensuite, incuber la membrane PVDF dans 5 mL des anticorps primaires spécifiques dilués dans un tampon de blocage pour LC3 (AcM de souris, 1:2 000), p62/SQSTM1 (ci-après appelé p62, AcM de souris, 1:2 000) et β-actine (AcM de souris, 1:2 000) (voir Tableau des matières) pendant une nuit à 4 °C.
  13. Lavez la membrane PVDF avec 10 ml de TBST trois fois (10 min/temps) à température ambiante. Ensuite, incuber la membrane PVDF avec un anticorps secondaire IgG anti-souris lapin (HRP) dilué dans un tampon bloquant (1:10 000) (voir tableau des matériaux) à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 2 h.
  14. Lavez la membrane PVDF avec 10 ml de TBST trois fois (10 min/temps) à température ambiante. Ensuite, placez la membrane de PVDF sur la pellicule de plastique, ajoutez une quantité appropriée de solution de travail ECL (200 μL/membrane) (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 2 min.
  15. Après l’incubation, retirez la solution de travail ECL et exposez la membrane PVDF dans le système d’imagerie pour le développement d’images. Enfin, utilisez le logiciel Image J pour analyser les valeurs de gris de chaque bande.
    REMARQUE : Les détails techniques du Western blot et du logiciel Image J utilisés pour les travaux d’imagerie ont été décrits précédemment45,46.

5. Analyse statistique

  1. Présenter les données des expériences sous forme d’écart type moyen ± (ET).
  2. Effectuer l’analyse de la signification à l’aide de l’outil logiciel statistique décrit précédemment47.
  3. Calculez les différences statistiques entre les deux groupes à l’aide d’un test t. Une valeur de P inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative : *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,005.

Résultats

ROS intracellulaires dans les cellules
Les cellules AML-12 ont été induites avec 300 μM PA pendant 24 h, et un modèle de cellules NAFLD a été établi. Par la suite, les cellules ont été traitées avec pendant 24 h. Les cellules ont été marquées avec une sonde fluorescente DCFH-DA, et la production de ROS a été observée au microscope à fluorescence. Les résultats de la coloration DCFH-DA des ROS intracellulaires dans les cellules sont présentés à la figure 1

Discussion

Des études ont mis en évidence le fait que la NAFLD est un syndrome clinicopathologique, allant de la stéatose hépatique à la NASH, qui peut évoluer vers la cirrhose et le cancer du foie51. Un régime riche en graisses et un mode de vie inactif sont des facteurs de risque typiques de la NAFLD. Les thérapies non médicamenteuses et les thérapies médicamenteuses pour le traitement de la NAFLD ont fait l’objet de recherches51,52,53...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par des subventions de la Commission des sciences et technologies de Chongqing (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 et jbky20210029) et de la China Postdoctoral Science Foundation (n ° 2021MD703919).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
5% BSA Blocking BufferSolarbio, Beijing, ChinaSW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell lineProcell Life Science&Technology Co., Ltd, ChinaAML12
Beyo ECL PlusBeyotime, Shanghai, ChinaP0018S
Bio-safety cabinetEsco Micro Pte Ltd, SingaporeAC2-5S1 A2 
cellSensOlympus, Tokyo, Japan1.8
Culture CO2 IncubatorEsco Micro Pte Ltd, SingaporeCCL-170B-8
DexamethasoneBeyotime, Shanghai, ChinaST125
Dimethyl sulfoxideSolarbio, Beijing, ChinaD8371
DMEM/F12Hyclone, Logan, UT, USASH30023.01
Foetal Bovine SerumHyclone, Tauranga, New ZealandSH30406.05
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)ABclonal, Wuhan, ChinaAS003
Hydrophobic PVDF Transfer MembraneMerck, Darmstadt, GermanyIPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×Beyotime, Shanghai, ChinaC0341
MAP LC3β AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1Solarbio, Beijing, ChinaM8650
Olympus Inverted Microscope IX53Olympus, Tokyo, JapanIX53
Palmitic AcidSigma, GermanyP0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)Hyclone, Logan, UT, USASV30010
Phenylmethanesulfonyl fluorideBeyotime, Shanghai, ChinaST506
Phosphate Buffered SolutionHyclone, Logan, UT, USABL302A
Platycodin DChengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, ChinaCSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100xBeyotime, Shanghai, ChinaP1005
Protein MarkerSolarbio, Beijing, ChinaPR1910
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbio, Beijing, ChinaCA1410
RIPA Lysis BufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotime, Shanghai, ChinaP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime, Shanghai, ChinaP0015
Sigma CentrifugeSigma, Germany3K15
SQSTM1/p62 AntibodySanta Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., LtdSC-28359
Tecan Infinite 200 PRO  Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
WB Transfer Buffer,10xSolarbio, Beijing, ChinaD1060
β-Actin Mouse mAbABclonal, Wuhan, ChinaAC004

Références

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