Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

Résumé

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés pour une application potentielle dans les études de biologie moléculaire, y compris les analyses d’expression génique. Dans le contexte de la régulation de la croissance oculaire et de la myopie, l’EPR joue probablement un rôle de relais cellulaire pour les signaux modulateurs de croissance, car il est situé entre la rétine et les deux parois de l’œil, telles que la choroïde et la sclérotique. Bien que des protocoles d’isolement de l’EPR aient été développés pour les poussins et les souris, ces protocoles se sont avérés ne pas être directement transposables au cobaye, qui est devenu un modèle de myopie de mammifère important et largement utilisé. Dans cette étude, des outils de biologie moléculaire ont été utilisés pour examiner l’expression de gènes spécifiques afin de confirmer que les échantillons étaient exempts de contamination par les tissus adjacents. La valeur de ce protocole a déjà été démontrée dans une étude RNA-Seq de l’EPR de jeunes cobayes pigmentés exposés à un défocalisation optique induisant la myopie. Au-delà de la régulation de la croissance oculaire, ce protocole a d’autres applications potentielles dans les études des maladies de la rétine, y compris la maculopathie myopique, l’une des principales causes de cécité chez les myopes, dans laquelle l’EPR a été impliquée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et, une fois perfectionnée, donne des échantillons d’EPR de haute qualité adaptés aux études de biologie moléculaire, y compris l’analyse de l’ARN.

Introduction

L’EPR comprend une monocouche unique de cellules pigmentées situées entre la rétine neurale et la choroïde vasculaire, et l’EPR a des rôles bien reconnus dans le développement et le maintien de la fonction rétinienne normale, y compris la phototransduction ^1,2. Plus récemment, l’EPR s’est vu attribuer un rôle clé supplémentaire dans la régulation de la croissance oculaire³ et, par conséquent, dans le développement de la myopie⁴. Cette assignation est basée sur l’emplacement critique de l’EPR, interposé entre la rétine et la choroïde et l’acceptation désormais large que la croissance oculaire et, par conséquent, les erreurs de réfraction sont régulées localement⁵. On pense que le RPE joue un rôle clé en tant que relais de signaux, reliant la rétine, source supposée de signaux modulateurs de croissance, à la choroïde et à la sclérotique, les deux cibles des signaux relayés ^6,7,8.

L’augmentation de la longueur axiale qui caractérise la plupart des myopies ne peut pas être considérée comme bénigne, les changements physiopathologiques impliquant la rétine, la choroïde et / ou la sclérotique représentant des conséquences inévitables et désormais bien reconnues d’un allongement oculaire excessif ^7,9. Dans ce contexte, l’EPR est peut-être le plus vulnérable, car, étant un tissu non mitotique, il ne peut accueillir la chambre vitrée en expansion que par l’étirement et l’amincissement de cellules individuelles. Bien que son rôle dans les pathologies liées à la myopie, telles que la dégénérescence maculaire myope, n’ait pas encore été entièrement compris, l’EPR a été impliqué dans la pathogenèse d’un certain nombre d’autres maladies de la rétine, y compris l’atrophie géographique, l’une des principales causes de cécité, qui est associée à des anomalies documentées de la rétine, de l’EPR et de la choroïde^{10,11, 12}.

L’isolement réussi des cellules EPR, exemptes de contamination par les tissus oculaires adjacents, ouvre potentiellement de nombreuses possibilités de recherche pour acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes sous-jacents à diverses maladies oculaires et rétiniennes. Cependant, l’isolement de l’EPR s’est avéré difficile, de nombreuses études publiées utilisant des échantillons combinés de rétine/EPR ou d’EPR/choroïde pour cette raison13,14,15. Les études impliquant l’isolement réussi de l’EPR d’une qualité adaptée aux études de biologie moléculaire ont été limitées aux yeux de poussins et de souris^16,17. Par exemple, la méthode d’isolement simultané de l’EPR et de stabilisation de l’ARN (SRIRS) décrite par Wang et ^coll.18. Isoler les cellules EPR chez la souris ne semble pas bien fonctionner dans les yeux des cobayes. Le protocole décrit ici représente un raffinement d’une approche qui a été initialement prototypée avec des yeux de musaraigne arboricole par l’un des auteurs (M.F.) et qui s’est avérée produire des échantillons d’EPR de haute qualité, appropriés pour les analyses d’ARN et d’autres analyses de biologie moléculaire, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés¹⁹.

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Protocole

Tous les soins et traitements utilisés dans cette étude étaient conformes à la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Berkeley.

1. Énucléation de l’œil de cobaye

1. Euthanasier un cobaye avec une injection intracardiaque de pentobarbital sodique administré sous anesthésie (5% d’isoflurane dans l’oxygène).
2. Énucléez les yeux à l’aide de forceps et de ciseaux, et transférez-les immédiatement dans une boîte de Petri de 10 cm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile pour le lavage. Transférer les yeux à la solution fraîche de PBS.
   REMARQUE : Une plaque de 6 puits contenant 4 mL de solution par puits est recommandée.

2. Isolement de l’œilleton oculaire postérieur et du complexe EPR/choroïde/sclérotique

1. À l’aide d’un microscope à dissection, utiliser une aiguille de 18 G pour faire une petite incision initiale dans la sclérotique, à environ 1,0 mm derrière la limite limbique (c.-à-d. entre la cornée et la sclérotique) (figure 1A); Ensuite, utilisez des ciseaux pour enlever le segment antérieur, y compris la cornée, l’iris, le corps ciliaire et le cristallin.
2. Ensuite, en travaillant avec l’œilleton du segment oculaire postérieur restant, détachez la rétine du complexe EPR / choroïde / sclérotique; utiliser une pince pour d’abord saisir puis tirer doucement sur la zonule de Zinn, puis pour décoller progressivement la rétine sans fragmentation (Figure 1B).
   REMARQUE: La rétine ne doit pas être saisie directement pour éviter la fragmentation rétinienne et l’isolement incomplet du tissu rétinien. L’utilisation d’un microscope est essentielle pour cette étape de dissection.

3. Isolement de l’EPR de la choroïde

1. Une fois que la rétine a été complètement enlevée, immerger le cupule postérieur restant, qui comprend l’EPR, la choroïde et la sclérotique, dans un réactif de stockage des tissus pendant 5 minutes (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Utilisez une plaque de 12 puits avec des puits identifiés, chacun rempli de 2 mL de réactif d’entreposage tissulaire.
2. Transférer la coupelle oculaire dans un autre puits rempli de 4 ml de PBS pendant 10 s avant de le déplacer vers un troisième puits rempli de 2 ml de PBS.
3. Fixez une aiguille de 30 G à une seringue de 1 mL remplie de PBS pour la dernière étape d’isolement de l’EPR. Appuyez doucement sur la seringue pour créer un flux de PBS; Tout d’abord, dirigez ce flux vers l’EPR pour y faire une petite déchirure ou un trou, puis dirigez le flux de PBS dans l’ouverture créée pour détacher l’EPR sous forme de feuille de la choroïde (Figure 1C).
   REMARQUE : Le détachement de l’EPR sous forme de feuille donne le plus grand échantillon d’EPR. Encore une fois, l’utilisation d’un microscope est essentielle pour cette étape.
4. Après avoir détaché l’EPR de la choroïde (figure 1D), prélever le tissu EPR dans une seringue de 1 mL sans aiguille, puis transférer l’échantillon prélevé dans un tube de 1,5 mL.
5. Centrifuger le tube de 1,5 mL avec l’EPR recueilli à 8 000 × g pendant 1 min pour obtenir une pastille d’EPR (figure 2A).
6. Jeter la solution PBS et la remplacer par 350 mL de tampon de lyse, tel qu’inclus dans les trousses d’isolement de l’ARN (voir le tableau des matériaux); Pipette 20x pour mélanger et, ainsi, préserver la qualité de l’échantillon. Pour un stockage et une conservation à plus long terme, transférer les échantillons dans un congélateur à −80 °C.
   REMARQUE: Le tampon de lyse est un composant exclusif du kit d’isolement d’ARN pour la lyse cellulaire et tissulaire avant l’isolement de l’ARN et l’isolement simultané de l’ARN / ADN / protéine. Pour inactiver les ARN dans le lysat, assurez-vous d’ajouter du β-mercaptoéthanol au tampon de lyse (10 μL de β-mercaptoéthanol par 1 mL de tampon de lyse).

4. Extraction de l’ARN-EPR

1. Utiliser une trousse d’isolement de l’ARN (voir le tableau des matériaux) pour isoler et prélever l’ARN des échantillons d’EPR en suivant les instructions fournies par le fabricant. Évaluer la qualité de l’échantillon par électrophorèse.
   REMARQUE : Le protocole décrit a donné un produit de bonne qualité (c.-à-d. indice d’intégrité de l’ARN [RIN] supérieur à 8,0).

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Résultats

L’analyse des échantillons d’EPR recueillis à l’aide du protocole ci-dessus a montré un ARN bien conservé (RIN >8.0, Figure 2B), avec 240,2 ng ± 35,1 ng par œil (n = 8, NanoDrop, Figure 2B). Pour évaluer davantage la qualité des échantillons d’EPR isolés, en particulier l’absence de contaminants choroïdiens et scléraux, nous avons examiné l’expression de gènes représentatifs pour chacun de ces derniers tissus dans les échantillons d?...

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Discussion

Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement de l’EPR, appropriée pour les analyses d’expression génique de l’EPR, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Les avantages de ce protocole sont qu’il produit des échantillons d’EPR de haute qualité qui sont relativement exempts de contamination, avec de l’ARN convenablement préservé pour les analyses spécifiques de l’ARN et, pourtant, est relativement simple et efficace. Alors que dans l’exemple fourni ici, les échantillons d?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09