Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Résumé

Nous utilisons des outils de laboratoire simples pour examiner l’architecture du système racinaire (RSA) d’Arabidopsis et de Medicago. Les plantules sont cultivées en hydroponie sur des mailles et étalées à l’aide d’un pinceau d’art pour révéler le RSA. Les images sont prises à l’aide d’un balayage ou d’une caméra haute résolution, puis analysées avec ImageJ pour cartographier les traits.

Résumé

Une connaissance approfondie de l’élaboration de l’architecture du système racinaire des plantes (ASF) est essentielle pour améliorer l’efficacité de l’utilisation des éléments nutritifs et accroître la tolérance des cultivars aux défis environnementaux. Un protocole expérimental est présenté pour la mise en place du système hydroponique, la croissance des plantules, l’épandage RSA et l’imagerie. L’approche a utilisé un système hydroponique à base de boîte magenta contenant un treillis en polypropylène soutenu par des cales en polycarbonate. Les contextes expérimentaux sont illustrés par l’évaluation de l’ARS des plantules sous divers apports en éléments nutritifs (phosphate [Pi]). Le système a été établi pour examiner le RSA d’Arabidopsis, mais il est facilement adaptable pour étudier d’autres plantes comme Medicago sativa (luzerne). Les plantules d’Arabidopsis thaliana (Col-0) sont utilisées dans cette étude comme exemple pour comprendre le RSA de la plante. Les graines sont stérilisées en surface en traitant à l’éthanol et à l’eau de Javel commerciale diluée, et conservées à 4 °C pour la stratification. Les graines sont germées et cultivées sur un milieu liquide demi-MS sur un treillis de polypropylène soutenu par des coins en polycarbonate. Les plantules sont cultivées dans des conditions de croissance standard pendant le nombre de jours souhaité, délicatement choisies dans le maillage et immergées dans des plaques de gélose contenant de l’eau. Chaque système racinaire des plantules est étalé doucement sur la plaque remplie d’eau à l’aide d’un pinceau d’art rond. Ces plaques de Petri sont photographiées ou scannées à haute résolution pour documenter les traits RSA. Les caractéristiques des racines, telles que la racine primaire, les racines latérales et la zone de ramification, sont mesurées à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement. Cette étude fournit des techniques pour mesurer les caractéristiques des racines des plantes dans des environnements environnementaux contrôlés. Nous discutons de la façon (1) de cultiver les plantules et de collecter et de répandre des échantillons de racines, (2) d’obtenir des images d’échantillons de RSA étalés, (3) de capturer les images et (4) d’utiliser un logiciel d’analyse d’images pour quantifier les attributs racinaires. L’avantage de la méthode actuelle est la mesure polyvalente, facile et efficace des traits RSA.

Introduction

L’architecture du système racinaire (RSA), qui est souterraine, est un organe vital pour la croissance et la productivité^{des plantes} 1,2,3. Après le stade embryonnaire, les plantes subissent leurs changements morphologiques les plus importants. La façon dont les racines poussent dans le sol affecte grandement la croissance des parties de la plante au-dessus du sol. La croissance racinaire est la première étape de la germination. C’est un trait informatif car il répond de manière unique aux différents nutriments disponibles 1,2,3,4. Le RSA présente un degré élevé de plasticité développementale, ce qui signifie que l’environnement est toujours utilisé pour prendre des décisions concernant le développement ^2,5. Les changements dans l’environnement ont rendu la production agricole plus difficile dans le scénario actuel. Sur une base continue, le RSA intègre les signaux environnementaux dans les choix de développement⁵. Par conséquent, une compréhension approfondie des principes qui sous-tendent le développement racinaire est essentielle pour apprendre comment les plantes réagissent aux environnements changeants ^2,5.

Le RSA détecte les concentrations variables de nutriments et rend les altérations phénotypiques 4,6,7,8,9,10,11,12. Des études suggèrent que la morphologie racinaire/RSA est très plastique par rapport à la morphologie^des pousses ^1,3. La cartographie des caractères RSA est très efficace pour enregistrer l’effet de la modification de l’environnement du sol environnant 1,11,12.

En général, des divergences dans l’effet de diverses carences nutritionnelles sur le phénotype racinaire ont été signalées dans de nombreuses études antérieures 3,11,13,14,15. Par exemple, il existe plusieurs rapports contrastés sur les changements induits par la famine de phosphate (Pi) dans le nombre, la longueur et la densité des racines latérales (LR). Une augmentation de la densité LR a été signalée dans l’état de carence en Pi ^6,8. En revanche, une diminution de la densité LR dans des conditions déficientes en Pi a également été rapportée par d’autres auteurs 3,13,16. L’une des principales causes de ces incohérences est l’utilisation du milieu gélifiant élémentaire sujet à la contamination, dont la gélose en contient souvent¹⁰. Les chercheurs cultivent généralement leurs plantes expérimentales sur un système de plaques à base d’agar et enregistrent les traits racinaires. De nombreux traits RSA sont souvent dissimulés ou incrustés dans la gélose et ne peuvent pas être documentés. Les expériences liées à l’induction d’une carence en nutriments, dans lesquelles les utilisateurs excluent souvent totalement un composant du milieu, ne peuvent pas être réalisées dans un milieu gélifiant élémentaire sujet à la contamination^11,14,15. De nombreux nutriments sont fréquemment présents en quantités importantes dans les milieux gélosé, y compris P, Zn, Fe et bien d’autres^11,14,15. En outre, la croissance du RSA est plus lente dans les milieux liquides à base d’agar que dans les milieux liquides non à base d’agar. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une autre approche non fondée sur la gélose pour quantifier et enregistrer qualitativement le phénotype de l’ASR. Par conséquent, la méthode actuelle a été développée, dans laquelle les plantules sont élevées dans un système hydroponique à base de boîte magenta sur un treillis de polypropylène soutenu par des coins en polycarbonate 1,10,11.

Cette étude présente une version improvisée détaillée de la méthode antérieure décrite par Jain et ^al.10. Cette stratégie a été adaptée aux demandes actuelles en biologie des racines des plantes et peut également être utilisée pour des plantes comme la luzerne, autres que les plantes modèles. Le protocole est le principal moyen de mesurer les changements dans RSA, et il ne nécessite qu’un équipement simple. Le présent protocole illustre comment phénotyper plusieurs caractéristiques racinaires, telles que les racines primaires et latérales en milieu normal et modifié (Pi déficient). Des instructions étape par étape et d’autres conseils utiles tirés des expériences de l’auteur sont fournis pour aider les chercheurs à suivre les méthodologies offertes dans cette méthode. La présente étude vise à fournir une méthode simple et efficace pour révéler l’ensemble du système racinaire des plantes, y compris les LR d’ordre supérieur. Cette méthode consiste à étaler manuellement le système racinaire avec un pinceau rond d’aquarelle, permettant un contrôle précis de l’exposition des racines 1,10,11,12. Il ne nécessite pas d’équipement coûteux ou de logiciel compliqué. Cette méthode a amélioré l’absorption des nutriments et le taux de croissance; Les plantes ont une solution riche en nutriments facilement absorbée par leurs racines. La méthode actuelle convient aux chercheurs qui souhaitent cartographier en détail les caractéristiques du système racinaire d’une plante, en particulier au début du développement (10-15 jours après la germination). Il convient aux petits systèmes racinaires, aux plantes modèles comme Arabidopsis et le tabac, et aux plantes non conventionnelles comme la luzerne jusqu’à ce que leur système racinaire rentre dans les boîtes magenta.

Les étapes de l’analyse phénotypique du développement du RSA chez Arabidopsis sont décrites dans ce protocole comme suit: (1) la méthode de stérilisation de la surface des semences pour les plantes (Arabidopsis), (2) les étapes de mise en place du système hydroponique, suivie du semis des graines sur un milieu, (3) la procédure de prélèvement des semis complets et d’épandage sur la plaque de Petri pour l’analyse RSA, (4) comment enregistrer les images pour RSA, et (5) calculer les paramètres RSA importants à l’aide du logiciel ImageJ.

Protocole

L’ensemble du protocole est résumé schématiquement à la figure 1, montrant toutes les étapes essentielles impliquées dans la révélation de l’architecture du système racinaire (RSA) des plantules. Les étapes du protocole sont données en détail ci-dessous:

1. Stérilisation de la surface des graines d’Arabidopsis

1. Transférer une petite cuillère (environ 100 graines = environ 2,5 mg) de graines dans un tube à microfuge et faire tremper pendant 30 minutes dans de l’eau distillée à température ambiante (RT). Toute cette procédure est effectuée dans l’état aseptique.
2. Centrifuger brièvement le tube de microfuge contenant les graines à 500 x g pendant 5 s, en utilisant n’importe quelle centrifugeuse de table à TA pour laisser les graines se déposer.
3. Décanter l’eau, ajouter 700 μL d’éthanol à 70 % (v/v), vortex pendant quelques secondes et faire tourner. Répétez le tourbillon et la rotation si nécessaire, mais assurez-vous que le temps de traitement de l’éthanol à 70 % reste à 3 min.
4. Après 3 min, rincer immédiatement une fois à l’eau stérile. Gardez l’étape de lavage à l’éthanol aussi opportune que possible, car une exposition prolongée à l’éthanol diminue la germination.
5. Traiter les graines avec de l’eau de Javel commerciale diluée (4 % v/v) avec une goutte de Tween-20 pendant 7 min. Mélanger les graines avec une solution d’eau de Javel en retournant rapidement les tubes 8 à 12 fois, puis en faisant une brève centrifugeuse (500 x g pendant 5 s à TA). On voit de la mousse apparaître dans le tube.
6. Décanter le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL et rincer les graines avec au moins cinq lavages à l’eau stérile, en suivant la même procédure de vortex.
7. Laisser les graines stérilisées en surface dans l’eau et incuber pendant 2-3 jours à 4 °C pour la stratification¹⁰.

2. Mise en place d’un système hydroponique pour la germination des graines

1. Remplissez à moitié une boîte en magenta standard avec de l’eau distillée et autoclavez-la. Autoclaver la feuille de polycarbonate (couleur claire et texture lisse) et couper des rectangles de 4 cm x 8 cm, avec un point médian entaillé à plus de la moitié du rectangle de sorte que deux rectangles puissent s’emboîter ensemble pour former une forme de X¹⁰. Utilisez cette configuration pour maintenir la maille de polypropylène (carrés de 6 cm x 6 cm de taille de pores de 250 μm, ou selon les besoins) coupée à partir de feuilles de 12 x 24 pouces¹⁰.
   REMARQUE: Le polypropylène est très résistant aux acides, aux alcalis et à d’autres produits chimiques; par conséquent, il a été choisi. L’autoclavage a tendance à déformer les mailles de polypropylène; Par conséquent, il est recommandé d’être transporté séparément enveloppé dans du papier d’aluminium. Des conditions typiques d’autoclavage de 16 min, 121 °C, 15 psi ou 775 mm Hg sont recommandées.
2. Ajouter des milieux basaux stériles demi-SEP contenant des vitamines + 1,5 % (p/v) de saccharose, comme décrit par Shukla et ^coll.1, à chaque boîte pour atteindre le bord inférieur de la maille de polypropylène dans un flux laminaire. Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions aseptiques.
3. Semez les graines stérilisées en surface sur le filet (taille des pores de 250 μm) en hydroponie et laissez-les pousser pendant 3 jours.
4. Après 3 jours, transférer les plantules sur un filet (taille des pores de 500 μm) et les laisser pousser pendant 2 jours.
5. Après 2 jours (total de 5 jours), transférer les plantules sur le milieu témoin (c.-à-d. milieu nutritif MS modifié 1 contenant 2,0 mM NH₄NO 3, 1,9 mM KNO₃, 0,15 mM MgSO 4·7H₂O, 0,1 mM MnSO ₄· _H2O, 3,0 μM ZnSO 4·7H2O, 0,1 μM CuSO 4·5H2O, 0,3 mM CaCl 2·2H2O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H2O, 0,1 mM FeSO 4·_7H2O, 0,1 mM Na 2 EDTA·_2H2O, 1,25 mM KH 2 PO 4, 100 μM_H3BO3, 1 μM Na 2 MoO₄·2H₂O, 1,5 % saccharose, 1,25 mM MES, pH 5,7 ajusté avec 0,1 M MES [pH 6,1]) et au milieu expérimental (p. ex. traitement P- [0 mM]; KH2 PO 4 est remplacé par 0,62 mM K₂SO₄ à partir de la composition du milieu de contrôle comme mentionné ci-dessus¹. Pour les traitements Pi en excès, la concentration de KH 2 PO₄ est augmentée dans le milieu MS modifié [_2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]¹) et laisser pousser les graines pendant 7 jours.
   REMARQUE: Une taille de pores de maille plus grande (500 μm) facilite la cueillette en douceur des plantules entières sans dommage ni besoin de couper l’hypocotyle. Les plantules poussent dans des conditions de croissance standard (c.-à-d. photopériode de lumière de 16 h / photopériode sombre de 8 heures, intensité lumineuse de 150 μmol·^m-2·s-1, humidité de 60 % à 70 %) à 23 °C.

3. Examen de la LSF

1. Préparer des plaques de gélose (1,1 %) pour l’étalement des racines (taille de la plaque de Petri : 150 mm x 15 mm).
2. Ajouter 10 à 20 ml d’eau du robinet filtrée autoclavée à la plaque de Petri, comme mentionné ci-dessus. Retirez doucement les plantules du maillage (500 μm) et plongez-les dans l’eau sur les assiettes.
3. Étalez délicatement la racine de chaque plantule dans l’assiette remplie d’eau à l’aide d’un pinceau d’aquarelle rond (tailles: n ° 14, 16, 18 et 20).
   REMARQUE: Lors de la propagation du système racinaire, saisissez d’abord la racine primaire et répartissez-la en ligne droite, car elle sert d’axe. Ensuite, répartissez les LR symétriquement de chaque côté de la racine primaire, dans la mesure du possible. Après cela, étalez le LR de second ordre lié au LR de premier ordre. Ce processus d’épandage est une sorte d’art; faites-le doucement, lentement, comme un artiste dessinant une image de la RSA.
4. Inclinez légèrement la plaque pour éliminer l’eau.
   NOTE: À ce stade, la procédure peut être interrompue en plaçant ces plaques étalées à 4 ° C. Plus tard, lorsque le traitement de l’image est nécessaire, sortez les plaques et placez-les à RT pendant un moment. Essuyez l’eau condensée, puis l’image peut être traitée facilement.

4. Enregistrement d’images pour RSA

1. Scannez ou photographiez ces plaques de Petri de manière appropriée.
   REMARQUE: Pour obtenir des photographies de haute qualité, la résolution de 600 ppp est recommandée pour la numérisation, et au moins un appareil photo de 12 mégapixels est recommandé pour la photographie.
2. Mesurez les caractéristiques de l’architecture du système racine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) disponible gratuitement. Pour suivre rapidement les étapes de mesure de la longueur de la racine à l’aide du logiciel ImageJ, veuillez vous référer à l’exemple « mesure de la longueur du contour de l’ADN »¹⁷.
   REMARQUE: Ces étapes sont suivies pour mesurer les longueurs de racine sur les images capturées à l’aide d’un scanner ou d’un appareil photo haute résolution.
   1. Utilisez une distance de longueur donnée pour définir l’échelle. La distance connue de la barre d’échelle de la figure 3 est de 2 cm. Sélectionnez l’outil Ligne droite dans la barre d’outils ImageJ (cinquième outil à partir de la gauche). Utilisez l’outil Ligne droite pour créer une sélection de ligne qui délimite la barre d’échelle. Terminez le contour en cliquant avec le bouton droit de la souris, en double-cliquant ou en cliquant dans la zone au début.
   2. Mesurez la longueur de la barre d’échelle connue en pixels à l’aide de la barre d’outils Analyser > mesurer . Notez la longueur des pixels.
   3. Ouvrez la boîte de dialogue Définir l’échelle en cliquant sur l’onglet Définir l’échelle dans l’onglet Analyser. Dans le champ Distance en pixels, entrez la longueur en pixels (comme indiqué ci-dessus). Ensuite, dans le champ Distance connue, entrez la valeur, comme indiqué par la barre d’échelle (ici, elle est de 20 mm). Définissez l’unité de longueur sur mm. Le format des pixels est de 1,0. Maintenant, l’échelle est spécifiée par le nombre x de pixels par millimètre. Pour verrouiller l’échelle de cette image particulière, cliquez sur OK.
   4. Créez une sélection de ligne qui définit la longueur de la racine à l’aide de l’outil Ligne segmentée . Terminez le contour en cliquant avec le bouton droit de la souris, en double-cliquant ou en cliquant dans la zone au début. Cliquez et faites glisser les petites « poignées » noires et blanches le long du contour pour ajuster la sélection de ligne selon vos besoins.
   5. Utilisez la commande Mesure sous l’onglet Analyser d’ImageJ pour quantifier la longueur de la racine. Pour transférer les données mesurées vers une feuille de calcul, cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre Résultats , sélectionnez Copier tout dans le menu contextuel, basculez vers la feuille de calcul, puis collez les données.
      Remarque : Comme décrit ci-dessus, définissez l’échelle en utilisant la distance connue de la barre d’échelle dans l’option ImageJ définir l’échelle. Cela donne le nombre de pixels par unité de longueur. Il est nécessaire de régler l’échelle à chaque fois, chaque fois qu’une nouvelle image est analysée.
3. Mesure et calcul des caractéristiques RSA
   1. Mesurer la longueur de la racine primaire entre la jonction hypocotyle et l’extrémité de la racine.
   2. Mesurez la longueur LR de premier et de deuxième ordre.
   3. Mesurez la zone de ramification (BZ) de la racine primaire. La zone de ramification de la racine primaire (BZ^PR) s’étend du premier point émergent LR au dernier point émergent LR.
   4. Enregistrer le nombre de LR, qui est le nombre de LR provenant des limites du PR^BZ.
   5. Mesurer la longueur moyenne des LR de premier ordre et d’ordre supérieur. Calculez la longueur moyenne du LR de premier ordre (1° LR) (centimètre par racine) en divisant la longueur totale du 1° LR par le nombre total de LR 1°.
   6. Mesurez la longueur moyenne du LR de second ordre. Calculer la longueur moyenne du LR du second ordre (2° LR) en divisant la longueur totale du 2° LR par le nombre total de 2° LR.
   7. Mesurer la densité de 1° LR. Calculer la densité de 1° LR (nombre de 1° LR par unité de longueur de BZ PR⁾ en divisant le nombre de 1° LRs par la longueur du BZ^PR.
   8. Mesurer la densité LR de 2°. Calculer la densité de 2° LR en divisant le nombre de 2° LRs par la longueur de la BZ de 1° LRs (nombre de 2° LRs par unité de longueur du BZ de 1° racines latérales).
   9. Mesurez la longueur totale de la racine (TRL). Il s’agit de l’agrégat de la racine primaire, des longueurs 1° LR et 2° LR (et plus si présente).

5. Mesure des poils racinaires

REMARQUE: Bien que le système hydroponique ne soit pas bon pour favoriser la croissance et le développement des poils racinaires, bien qu’il soit aussi robuste que dans les milieux de croissance solides, il est toujours important de l’étudier dans le contexte actuel. Suivez les étapes ci-dessous pour analyser le développement des poils racinaires dans une section de 5 mm à partir de l’extrémité de la racine primaire des plantules.

1. Couper une section de 2 cm de la racine primaire de l’extrémité de la racine.
2. Montez la section racinaire sur une lame en utilisant 10% de glycérol comme support de montage.
3. Placez la lame sous un stéréomicroscope.
4. Utilisez le support axial pour visualiser et capturer des images des poils racinaires.
5. Analysez les images pour étudier la structure et les caractéristiques des poils racinaires à l’aide du logiciel ImageJ décrit précédemment.

Résultats

Les différents traits morphométriques de l’architecture du système racinaire (RSA) sont mesurés à l’aide d’outils de laboratoire simples, et les étapes sont représentées schématiquement à la figure 1. Les détails de la configuration hydroponique démontrent le potentiel du protocole dans la mesure du RSA (Figure 1 et Figure 2).

Compte tenu des différences observées dans les gélifiants,...

Discussion

Ce travail a démontré la cartographie de RSA à l’aide d’un équipement de laboratoire simple. En utilisant cette méthode, les altérations phénotypiques sont enregistrées au niveau raffiné. L’avantage de cette stratégie est que la portion de pousses n’entre jamais en contact avec les milieux, de sorte que le phénotype des plantules est original. Cette méthode consiste à mettre en place un système hydroponique pour faire pousser des plantules comme décrit dans le protocole. Ensuite, chaque plantule es...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes	Amazon or any other vendor		Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera	Leica Microsystems		LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
Magenta box GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera	Cannon or Nikon		Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets	Amazon		1 mm  thick
Polypropylene Mesh	Amazon		Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)