Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Résumé

Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont une culture tridimensionnelle (3D) qui peut imiter l’environnement tumoral in vitro. Dans le cancer séreux de l’ovaire de haut grade, les AOP représentent un modèle pour étudier de nouveaux biomarqueurs et thérapeutiques.

Résumé

Les organoïdes sont des modèles tumoraux dynamiques 3D qui peuvent être cultivés avec succès à partir de tissus tumoraux ovariens dérivés de patients, d’ascites ou de liquide pleural et aident à la découverte de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs du cancer de l’ovaire. Ces modèles récapitulent l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. De plus, il a été démontré qu’ils correspondent à la tumeur primaire morphologiquement, cytologiquement, immunohistochimiquement et génétiquement. Ainsi, les organoïdes facilitent la recherche sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et sont supérieurs aux lignées cellulaires. Le présent protocole décrit des méthodes distinctes pour générer des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes à partir de tumeurs de patientes, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les échantillons de patients sont séparés en suspensions cellulaires par digestion mécanique et enzymatique. Les cellules sont ensuite plaquées à l’aide d’un extrait de membrane basale (EMB) et sont soutenues par des milieux de croissance optimisés contenant des suppléments spécifiques à la culture du cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC). Après avoir formé les organoïdes initiaux, les AOP peuvent soutenir la culture à long terme, y compris le passage pour l’expansion pour des expériences ultérieures.

Introduction

En 2021, environ 21 410 femmes aux États-Unis ont reçu un diagnostic de cancer épithélial de l’ovaire et 12 940 femmes sont décédées de cette maladie¹. Bien que des progrès suffisants aient été réalisés en chirurgie et en chimiothérapie, plus de 70% des patients atteints d’une maladie avancée développent une résistance chimiothérapeutique et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic ^2,3. Ainsi, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie mortelle et des modèles représentatifs et fiables pour la recherche préclinique sont nécessaires de toute urgence.

Les lignées cellulaires cancéreuses et les xénogreffes dérivées de patientes (PDX) créées à partir de tumeurs ovariennes primaires sont les principaux instruments utilisés dans la recherche sur le cancer de l’ovaire. Un avantage majeur des lignées cellulaires cancéreuses est leur expansion rapide. Cependant, leur culture continue entraîne des altérations phénotypiques et génotypiques qui font que les lignées cellulaires cancéreuses s’écartent de l’échantillon original de tumeur cancéreuse primaire. En raison des différences existantes entre la lignée cellulaire cancéreuse et la tumeur primaire, les tests de médicaments qui ont des effets positifs dans les lignées cellulaires ne parviennent pas à avoir ces mêmes effets dans les essais cliniques². Pour surmonter ces limitations, des modèles PDX sont utilisés. Ces modèles sont créés en implantant du tissu frais de cancer de l’ovaire chez des souris immunodéficientes. Comme il s’agit de modèles in vivo , ils ressemblent plus précisément aux caractéristiques biologiques humaines et, à leur tour, sont plus prédictifs des résultats des médicaments. Cependant, ces modèles présentent également des limites importantes, notamment le coût, le temps et les ressources nécessaires pour les générer⁴.

Les AOP offrent un modèle alternatif pour la recherche préclinique qui surmonte les limites des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX. Les AOP récapitulent la tumeur et le microenvironnement tumoral d’un patient et, ainsi, fournissent un modèle traitable in vitro idéal pour la recherche préclinique ^2,3,5. Ces modèles 3D ont des capacités d’auto-organisation qui modélisent la tumeur primaire, une caractéristique que leurs homologues de lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ne possèdent pas. En outre, il a été démontré que ces modèles représentent génétiquement et fonctionnellement leurs tumeurs parentes et, par conséquent, sont des modèles fiables pour l’étude de nouveaux processus thérapeutiques et biologiques. En bref, ils offrent des capacités d’expansion et de stockage à long terme similaires aux lignées cellulaires, mais englobent également le microenvironnement et les interactions cellule-cellule inhérents aux modèles murins ^4,6.

Le présent protocole décrit la création d’AOP à partir de tumeurs dérivées de patients, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les cultures AOP peuvent ensuite être étendues à plusieurs générations et utilisées pour tester la sensibilité au traitement médicamenteux et les biomarqueurs prédictifs. Cette méthode représente une technique qui pourrait être utilisée pour personnaliser les traitements en fonction des réponses thérapeutiques des AOP.

Protocole

Tous les échantillons de tissus humains prélevés pour la recherche ont été obtenus conformément au protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel (CISR). Les protocoles décrits ci-dessous ont été exécutés dans un environnement stérile de culture de tissus humains. Le consentement écrit éclairé a été obtenu de sujets humains. Les patientes admissibles devaient avoir un diagnostic ou un diagnostic présumé de cancer de l’ovaire, être disposées et capables de signer un consentement éclairé et être âgées d’au moins 18 ans. Le tissu tumoral (tumeur primaire maligne ou sites métastatiques), l’ascite et le liquide pleural ont été obtenus à partir de patients consentants au moment de leur procédure. Ces spécimens ont été immédiatement transportés au laboratoire et traités pour la génération d’organoïdes en utilisant les méthodes décrites ci-dessous.

1. Préparation des médias

1. Préparation complète des milieux organoïdes
   1. Préparer le milieu conditionné à la R-spondine 1/Noggin en suivant un rapport précédemment publié⁷.
      REMARQUE: Le milieu conditionné par la R-spondine-1 / Noggin est une alternative plus abordable aux protéines recombinantes disponibles dans le commerce. Les cellules HEK293T sécrétant de manière stable R-spondin-1 et Noggin par transduction médiée par lentivirus ont été un don généreux de Ron Bose, de la faculté de médecine de l’Université de Washington à St. Louis, et d’Anil Rustgi, du New York-Presbyterian/Columbia University Irving Medical Center ^8,9,10. Un milieu conditionné commercial pourrait être utilisé comme substitut (voir le tableau des matériaux).
2. Pour obtenir le milieu organoïde complet, combiner 10 % de milieu conditionné par R-spondine 1/Noggin, 50 ng/mL d’EGF, 10 ng/mL de FGF-10, 10 ng/mL de FGF2, 1x B27, 10 mmol/L de nicotinamide, 1,25 mmol/L de N-acétylcystéine, 1 μmol/L de prostaglandine E2, 10 μmol/L de SB202190, 500 nmol/L A83-01 et 10 μM d’inhibiteur de ROCK (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Le milieu peut être conservé à 4 °C jusqu’à 3 mois. Ce milieu a été adapté de Hill et ^al.11. Les concentrations et les ingrédients du milieu sont les mêmes, avec l’ajout d’un inhibiteur de ROCK.
3. Préparer le milieu de base organoïde en combinant 500 mL d’une formulation avancée de DMEM/F12 avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 1x dipeptide, L-alanyl-L-glutamine et 1x HEPES (10 mM) (voir le tableau des matériaux).

2. Prélèvement d’organoïdes de l’ascite et du liquide pleural

NOTE: L’ascite et le liquide pleural doivent être traités dès que possible pour obtenir le meilleur rendement en organoïdes. Décongeler le tampon de réaction BME, DNase I et DNase I préalablement aliquote (voir le tableau des matériaux) en le plaçant sur de la glace jusqu’à ce que le contenu soit liquéfié.

1. Obtenir l’ascite et le liquide pleural des patients consentants au moment des chirurgies ou des interventions de soins standard, et les transporter à température ambiante dans un contenant de voyage jusqu’au laboratoire.
   REMARQUE: Toute ascite ou traitement du liquide pleural doit être effectué dans un environnement stérile.
2. Transférer 50 mL d’ascite ou de liquide pleural dans des tubes coniques de 50 mL (le nombre de tubes dépend du volume d’ascite obtenu). Centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Après la centrifugation, utilisez une pipette Pasteur en verre pour aspirer soigneusement le surnageant.
3. Continuer en ajoutant 50 mL d’ascite ou de liquide pleural à la pastille précédemment centrifugée et centrifuger à nouveau à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Répétez cette étape jusqu’à ce que toute l’ascite ou le liquide pleural aient été traités.
4. Préparer une solution de DNase I à 100 μg/mL en combinant 1 000 μL d’eau exempte de nucléase, 100 μL de tampon réactionnel DNase I et 10 μL de DNase I.
   NOTE: Le traitement DNase I appliqué est suffisant pour fabriquer une suspension unicellulaire indépendamment de la présence d’agrégats cellulaires dans certains échantillons de patients¹².
5. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de solution de DNase I à 100 μg/mL. Ajouter doucement la solution de DNase I goutte à goutte et laisser le tube incuber pendant 15 min à température ambiante.
   REMARQUE: Ajouter un minimum de 1 mL de solution DNase I. Si 1 mL ne suffit pas à déranger la pastille, ajouter 1 mL supplémentaire.
6. Après l’incubation, ajouter 25 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3) aux cellules et retourner doucement pour mélanger. Ensuite, centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
7. Remettez en suspension les pastilles cellulaires nouvellement formées dans 5 mL préchauffés de 1x tampon de lyse des globules rouges (GR) (voir le tableau des matériaux). Réglez le vortex à 458 x g et faites tourbillonner les solutions dans chaque tube conique. Une fois que les solutions sont homogènes, utiliser une pipette sérologique pour combiner le contenu de tous les tubes coniques en un seul tube conique de 50 mL.
8. Incuber le tube conique contenant la solution vortée à température ambiante pendant 5 min. Une fois l’incubation terminée, centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE : Examinez la pastille. Une pastille rose/rouge indique la présence de globules rouges, ce qui nécessiterait que l’étape tampon de lyse des globules rouges soit répétée jusqu’à ce que la pastille ne soit plus rouge.
9. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Ensuite, laver la pastille avec 10 ml de PBS, vorter la solution à 458 x g et centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
10. Si une pastille de grande cellule est formée, aspirer le PBS à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et ajouter 1 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3) sur le dessus de la pastille. Vortex la solution à 458 x g et transférer 300-400 μL dans un tube microcentrifugeur. Centrifuger le tube de microcentrifugation à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : La partie de la pastille de cellule qui n’est pas placée dans le tube de microcentrifugeuse peut être congelée pour une utilisation ultérieure (500 μL de cellules à 1 mL de DMSO à 10 % dans le FBS). La pastille de cellule congelée peut être stockée pendant des semaines à −80 °C et pendant des années si elle est placée dans de l’azote liquide¹³.
11. Aspirer soigneusement le milieu de base organoïde (étape 1.3) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre en suspension dans un BME (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’embouts froids.
    REMARQUE: La quantité de BME est basée sur la taille de la pastille. Il est recommandé d’utiliser 25% de milieu de base organoïde (étape 1.3) avec des cellules remises en suspension à 75% de BME.
12. Plaquer 40 μL d’aliquotes de la solution cellulaire remise en suspension sur une plaque à 6 puits. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits (figure 1).
13. Placer immédiatement la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 20 min pour permettre au BME de se solidifier. Après l’incubation, ajouter doucement 2 mL de milieu organoïde complet (étape 1.2) dans chaque puits.

Figure 1 : Placage d’organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de la patiente. Image représentative du placage organoïde. Les aliquotes du mélange organoïde sont soigneusement plaquées, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Prélèvement d’organoïdes à partir de tissus

NOTE: Les tissus doivent être traités dès que possible pour le meilleur rendement en organoïdes.

1. Recueillir et transporter la tumeur sur la glace dans un récipient de voyage contenant du PBS.
2. Placer l’échantillon sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm (figure 2). À l’aide d’un scalpel jetable, hacher le mouchoir. Ensuite, à l’aide de l’extrémité émoussée d’une seringue jetable, écrasez le tissu jusqu’à ce qu’un mélange homogène ait été créé.
3. À l’aide d’une pince, placer le mélange tissulaire homogène dans un tube de dissociation. Pour chaque 1 à 2 mL de tissu homogénéisé, ajouter 7 à 8 mL de solution de collagénase de type II à 1 mg/mL (voir le tableau des matières) dans un milieu de base organoïde (étape 1.3) et 1 mL de solution de DNase I. Vortex la solution à 458 x g.
   REMARQUE: La quantité de tissu déterminera la quantité de solution de collagénase et le nombre de tubes nécessaires.
4. Utilisez la machine de dissociation (voir le tableau des matériaux) pour liquéfier le tissu pendant qu’il est dans la solution de collagénase. Exécutez le programme 37C_h_TDK3 (1 h) jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une suspension unicellulaire.
   REMARQUE: Le programme devra être réexécuté si le mélange résultant n’est pas homogène (c’est-à-dire si des morceaux de tissu sont toujours présents dans le mélange). Si le tissu est digéré mais que la solution est visqueuse, diluer à l’aide d’un milieu de base organoïde (étape 1.3).
5. Transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter 20 à 40 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3). Ensuite, filtrez la solution à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube conique de 50 ml nouvellement étiqueté.
6. Centrifuger le mélange filtré à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
7. Préparer une solution de DNase I à 100 μg/mL en combinant 1 000 μL d’eau exempte de nucléase, 100 μL de tampon réactionnel DNase I et 10 μL de DNase I.
   NOTE: Le traitement DNase I appliqué est suffisant pour fabriquer une suspension unicellulaire indépendamment de la présence d’agrégats cellulaires dans certains échantillons de patients¹².
8. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de solution de DNase I à 100 μg/mL. Ajouter doucement la solution de DNase I goutte à goutte et laisser le tube incuber pendant 15 min à température ambiante.
9. Après l’incubation, ajouter 25 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3) aux cellules et retourner doucement pour mélanger. Ensuite, centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
10. Remettez en suspension la pastille cellulaire nouvellement formée dans 5 mL de tampon de lyse 1x RBC préchauffé. Vortex les solutions dans chaque tube conique à 458 x g.
11. Incuber le tube conique contenant la pastille cellulaire remise en suspension dans le tampon de lyse des globules rouges pendant 5 min. Une fois l’incubation terminée, centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : Examinez la pastille. Une pastille rose/rouge indique la présence de globules rouges, ce qui nécessiterait que l’étape tampon de lyse des globules rouges soit répétée jusqu’à ce que la pastille apparaisse blanche.
12. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Ensuite, laver la pastille avec 10 ml de PBS, vorter la solution à 458 x g et centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
13. Si une pastille de grande cellule est formée, aspirer le PBS à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et ajouter 1 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3) sur le dessus de la pastille. Vortex la solution à 458 x g et transférer 300-400 μL dans un tube microcentrifugeur. Centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE : La partie de la pastille de cellule qui n’est pas placée dans le tube de microcentrifugation peut être congelée pour une utilisation future (500 μL de cellules à 1 mL de DMSO à 10 % dans le FBS) (étape 5.1). La pastille de cellule congelée peut être stockée pendant des semaines à −80 °C et pendant des années si elle est placée dans de l’azote liquide¹³.
14. Aspirer soigneusement le milieu de base organoïde à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et remettre en suspension dans un BME à l’aide d’embouts froids.
    REMARQUE: La quantité de BME est basée sur la taille de la pastille. Il est recommandé d’ajouter 25 % de milieu de base organoïde (étape 1.3) avec des cellules remises en suspension à 75 % de BME.
15. Plaquer la solution cellulaire remise en suspension sur une plaque à 6 puits dans des aliquotes de 40 μL. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits.
16. Placez immédiatement la plaque de puits dans l’incubateur pendant 20 min. Après l’incubation, ajouter doucement 2 mL de milieu organoïde complet (étape 1.2) dans chaque puits.

Figure 2 : Tissu tumoral avant dissection. Image représentative du tissu tumoral obtenu pour la génération organoïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Passage des organoïdes

NOTE: Si l’échantillon est confluent, chaque puits organoïde peut être passé chaque semaine vers deux nouveaux puits.

1. À l’aide d’une pipette de 1 mL, ajouter 1 mL de milieu de base organoïde (étape 1.3) à chaque puits, et pipeter le média de haut en bas directement sur les languettes organoïdes pour le dissocier. Recueillir tout le milieu contenant les pastilles en suspension dans un tube conique de 15 mL.
2. Centrifuger le tube conique de 15 mL contenant le mélange à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
3. Ajouter 1 mL d’enzyme recombinante d’origine animale (voir le tableau des matières) à la pastille cellulaire, vortex de la solution à 458 x g et transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Laisser incuber le tube pendant 15 min dans un bain-marie à 37 °C.
4. Après incubation, centrifuger à 1 650 x g pendant 5 min à 4 °C. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
5. Remettez le granulé en suspension dans le BME.
   REMARQUE: La quantité de BME est basée sur la taille de la pastille. Il est recommandé d’ajouter 25 % de milieux de base organoïdes (étape 1.3) avec des cellules remises en suspension à 75 % de BME.
6. Plaquer la solution cellulaire remise en suspension dans une plaque à 6 puits dans des aliquotes de 40 μL. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits. Une fois que toutes les aliquotes ont été plaquées, placez immédiatement la plaque de puits dans l’incubateur pendant 20 min. Après l’incubation, ajouter doucement 2 mL de milieu organoïde complet (étape 1.2) dans chaque puits.

5. Congélation et décongélation des organoïdes

1. Congélation des organoïdes
   1. Commencez par les étapes 4.1-4.4.
   2. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 à 1 mL de milieu de congélation de culture cellulaire de récupération (voir le tableau des matériaux) et transférez 1 mL à chaque cryovial.
   3. Ensuite, placer les cryoflacons dans un récipient rempli d’isopropanol à -80 °C pendant 2 semaines avant de les transférer dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme¹³.
2. Décongélation des organoïdes
   1. Retirer les échantillons du réservoir d’azote liquide et décongeler au bain-marie à 37 °C.
   2. Une fois décongelé, transférer dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 1 650 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Après centrifugation, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
   3. Remettez le granulé en suspension dans le BME.
      REMARQUE: La quantité de BME est basée sur la taille de la pastille. Il est recommandé d’ajouter 25 % de milieux de base organoïdes (étape 1.3) avec des cellules remises en suspension à 75 % de BME.
   4. Plaquer la solution cellulaire remise en suspension sur une plaque à 6 puits dans des aliquotes de 40 μL. Placez jusqu’à cinq aliquotes par puits.
   5. Placez immédiatement la plaque dans l’incubateur pendant 20 min. Après l’incubation, ajouter doucement 2 mL de milieu organoïde complet (étape 1.2) dans les puits.

6. Intégration et génération de lames fixées au formol à base de paraffine (FFPE) pour évaluer la composition organoïde

1. Après avoir cultivé des organoïdes pendant au moins 10 jours pour assurer une taille adéquate, retirer le milieu organoïde complet des puits et ajouter 1 mL de fixateur de paraformaldéhyde (PFA) à 2%. Incuber à température ambiante pendant 5-10 min.
2. Après l’incubation, laver les aliquotes organoïdes cultivées 3x pendant 5 minutes à chaque fois avec 1 mL de PBS.
3. Retirer le PBS de chaque puits et ajouter 1 mL de gélose chaude à 2 % dans du_H2Odésionisé à chaque puits. Lors de l’ajout de l’agar, soulevez les aliquotes organoïdes cultivées de la plaque à l’aide d’une spatule.
   NOTE: Il est important de ne pas laisser la gélose durcir avant de soulever les aliquotes organoïdes cultivées.
   1. Laisser la gélose se solidifier dans le puits à température ambiante.
4. À l’aide d’une petite spatule, libérer la gélose solidifiée du puits et la conserver dans une cassette jusqu’à 48 h (voir le tableau des matières) à 4 °C dans de l’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’elle en traite¹⁴.
5. Incorporer les échantillons dans de la paraffine 15, couper les lames à une épaisseur de 5 μm et colorer les lames avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E, voir le tableau des matériaux) en utilisant un protocole standard¹⁵.

Résultats

Pour générer des AOP, les échantillons ont été digérés mécaniquement et enzymatiquement en suspensions unicellulaires. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans des BME et complétées par des milieux spécialement conçus (Figure 3). Les organoïdes sont généralement établis sur une période de 10 jours, après quoi ils démontrent des organoïdes discrets en culture (Figure 4).

Discussion

Le cancer de l’ovaire est extrêmement mortel en raison de son stade avancé au moment du diagnostic, ainsi que du développement courant de la résistance à la chimiothérapie. De nombreux progrès dans la recherche sur le cancer de l’ovaire ont été réalisés en utilisant des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX; Cependant, il existe un besoin évident d’un modèle in vitro plus représentatif et abordable. Les AOP se sont avérées représenter avec précision l’hétérogénéité ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% HEPES	Life Technologies	15630080
1% Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes	Genesee Scientific	14125
10 cm Tissue Culture Dish	TPP	93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL centrifuge tubes	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyde Fixative	Sigma-Aldrich
37 °C water bath	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6 well plates	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Centrifuge
Cultrex Type 2	R&D Systems	3533-010-02	basement membrane extract
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaction Buffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi BioTech	130-096-427	We use the manufacturers protocol.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffin Wax	Fisher Scientific	22900700
Microcentrifuge
Mr. Frosty Freezing Container	Fisher Scientific	07202363S
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette with Tips
p200 Pipette with Tips
Pasteur Pipettes 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2	R&D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Recombinant Murine Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Invitrogen	12648010
Red Blood Cell Lysis Buffer	BioLegend	420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)	R&D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Flask	MidSci	TP90076
Tissue Culture Hood
Tissue Embedding Cassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	animal origin-free, recombinant enzyme
Type II Collagenase	Life Technologies	17101015
Vortex