Isolement et purification de cellules endothéliales microvasculaires et macrovasculaires à partir d’échantillons dérivés de poumons

Résumé

Bien que difficile, l’isolement des cellules endothéliales pulmonaires est essentiel pour les études sur l’inflammation pulmonaire. Le présent protocole décrit une procédure pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires.

Résumé

La disponibilité de cellules isolées à partir de tissus et d’organes sains et malades représente un élément clé pour les approches de médecine personnalisée. Bien que les biobanques puissent fournir une vaste collection de cellules primaires et immortalisées pour la recherche biomédicale, celles-ci ne couvrent pas tous les besoins expérimentaux, en particulier ceux liés à des maladies ou à des génotypes spécifiques. Les cellules endothéliales vasculaires (CE) sont des composants clés de la réaction inflammatoire immunitaire et, par conséquent, jouent un rôle central dans la pathogenèse d’une variété de troubles. Notamment, les EC de différents sites présentent des propriétés biochimiques et fonctionnelles différentes, ce qui rend la disponibilité de types de CE spécifiques (c.-à-d. macrovasculaire, microvasculaire, artériel et veineux) essentielle pour concevoir des expériences fiables. Ici, des procédures simples pour obtenir des cellules endothéliales macrovasculaires et microvasculaires humaines à haut rendement et pratiquement pures à partir de l’artère pulmonaire et du parenchyme pulmonaire sont illustrées en détail. Cette méthodologie peut être facilement reproduite à un coût relativement faible par n’importe quel laboratoire pour obtenir l’indépendance vis-à-vis des sources commerciales et obtenir des phénotypes/génotypes EC qui ne sont pas encore disponibles.

Introduction

L’endothélium vasculaire tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins. Il joue un rôle clé dans la régulation de la coagulation sanguine, du tonus vasculaire et des réponses immuno-inflammatoires 1,2,3,4. Bien que la culture de cellules endothéliales (CE) isolées à partir de spécimens humains soit essentielle à des fins de recherche, il faut remarquer que les CE de différents vaisseaux sanguins (artères, veines, capillaires) ont des fonctions spécifiques. Celles-ci ne peuvent pas être entièrement récapitulées par les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont facilement disponibles et largement utilisées dans les études sur la physiopathologie de l’endothélium vasculaire ^5,6. Par exemple, les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines (HLMVEC) jouent un rôle clé dans l’inflammation pulmonaire en contrôlant le recrutement et l’accumulation^des leucocytes ^4,7. Ainsi, un cadre expérimental visant à reproduire l’inflammation pulmonaire avec une haute fidélité devrait inclure les HLMVEC. D’autre part, un dysfonctionnement EC peut être observé dans plusieurs pathologies; par conséquent, les CE du patient sont fondamentales pour construire un modèle in vitro fiable de la maladie. Par exemple, l’isolement de fragments d’EC de l’artère pulmonaire (HPAEC), disséqués à partir des poumons explantés de personnes atteintes de mucoviscidose (FK), nous a permis de découvrir des mécanismes de dysfonctionnement endothélial dans cette maladie ^8,9.

Ainsi, les protocoles visant à optimiser l’isolement des CE provenant de différentes sources/organes, y compris dans des états pathologiques, sont essentiels pour fournir aux chercheurs des outils de recherche précieux, en particulier lorsque ces outils ne sont pas disponibles dans le commerce. Des protocoles d’isolement HLMVEC et HPAEC ont déjà été signalés 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dans tous les cas, la digestion enzymatique des échantillons pulmonaires a donné lieu à des populations cellulaires mixtes, qui ont été purifiées à l’aide de milieux sélectifs ad hoc et d’un tri cellulaire à base de billes magnétiques ou cytométriques. D’autres optimisations de ces protocoles doivent aborder deux problèmes principaux dans l’isolement de la CU : (1) la contamination des cellules et des tissus, qui devrait être résolue le plus tôt possible pour minimiser la sénescence réplicative EC²⁰ ; et 2) le faible rendement des isolats CE primaires.

Cette étude décrit un nouveau protocole pour l’isolement à haut rendement et à haute pureté des HLMVECs et des HPAEC. Cette procédure peut être facilement applicable et donner des CE macrovasculaires et microvasculaires pratiquement purs en quelques étapes.

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Protocole

Cette étude a été approuvée et le protocole a suivi les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Chieti-Pescara (#237_2018bis). La figure 1 illustre l’isolement de cellules endothéliales à partir de segments (1 à 3 cm de long) de parenchyme pulmonaire ou d’artère pulmonaire de sujets humains déidentifiés (avec consentement écrit) subissant une chirurgie thoracique pour diverses raisons, telles qu’un pneumothorax ou une lobectomie. Dans ce dernier cas, les chirurgiens ont également prélevé un segment d’artère pulmonaire. Notamment, les chirurgiens ont reçu l’instruction précise de prélever des échantillons exempts de cancer. Le protocole présenté a été optimisé pour obtenir le plus grand rendement et la plus grande pureté possible.

1. Préparation expérimentale

1. Reconstitution de la collagénase
   1. Dissoudre la poudre de collagénase dans une solution saline tamponnée au phosphate sans CaCl 2 et MgCl 2 (PBS⁻⁻, voir le tableau des matières) à une concentration de₂ mg/mL et filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm.
   2. Préparer des aliquotes de 5 mL et les conserver à −20 °C. Décongeler et préchauffer les aliquotes à 37 °C avant utilisation.
2. Revêtement de plaques
   1. Pour le revêtement sur plaque, introduire à la pipette une solution de gélatine à 1,5 % ou 50 μg/mL de fibronectine (voir le tableau des matières) dans la plaque de culture (500 μL suffisent pour couvrir la surface de chaque puits d’une plaque à 6 puits) et incuber pendant 1 h à 37 °C.
   2. Après l’incubation, retirez l’excès de gélatine et lavez les puits avec du ^PBS−−. Aspirez le PBS−⁻ et laissez la plaque sécher dans une hotte stérile.
      REMARQUE: Pour la reconstitution de la gélatine, dissoudre la poudre dans de l’eau pour obtenir une solution à 1,5%, puis autoclaver et conserver à 4 ° C. La gélatine à 1,5 % n’est pas liquide à 4 °C; Par conséquent, il doit être réchauffé avant le revêtement de la plaque. Alternativement, toute solution de gélatine commerciale adaptée aux cultures cellulaires peut être utilisée pour le revêtement de la plaque.

2. Préparation des échantillons

1. Parenchyme pulmonaire
   1. Lavez les échantillons prélevés en les immergeant dans un tube de 50 ml contenant du ^PBS−−.
   2. Transférer les échantillons dans une boîte de Petri stérile et hacher manuellement l’échantillon à l’aide de ciseaux chirurgicaux (taille optimale: >2 cm) en petits fragments d’environ 3-4 mm chacun.
2. Segment(s) d’artère
   1. Lavez les échantillons prélevés en les immergeant dans un tube de 50 ml contenant du ^PBS−−.
   2. Transférez-le dans une boîte de Petri stérile sans hachage, car la fragmentation augmentera la surface de la section transversale du segment artériel, augmentant ainsi la possibilité d’isoler les non-CE.

3. Digestion enzymatique

1. Lavez deux fois le parenchyme pulmonaire coupé en dés ou le(s) segment(s) artère(s) pulmonaire(s) avec du ^PBS−−. Cette étape permettra d’enlever une grande partie du sang résiduel.
2. Placer les échantillons dans des tubes de 15 mL et incuber avec 5 mL de collagénase de type 2 (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 37 °C et 5 % de CO₂. Au cours de cette incubation, la dégradation de la matrice extracellulaire libère des cellules individuelles et des agrégats cellulaires.

4. Récupération des cellules digérées

1. Placez une passoire stérile en acier ou en métal (c.-à-d. une passoire à thé avec un maillage de ~1 mm) sur le dessus d’un tube de prélèvement de 50 mL.
2. Versez tout le contenu du tube de 15 ml sur la passoire, massez doucement le tissu digéré avec une spatule et rincez l’échantillon avec du PBS−⁻ jusqu’à ce que le tube de prélèvement soit rempli.
   REMARQUE: Cette étape éliminera les gros fragments de tissu à l’échelle millimétrique, assurant une plus grande efficacité des étapes de filtration suivantes.

5. Élimination non CE par filtration

1. Filtrer le débit sortant recueilli à l’étape 4.2 à l’aide d’une crépine à cellules d’un maillage de 70 μm et recueillir le débit sortant dans un nouveau tube de 50 mL.
2. Ensuite, utilisez une passoire à cellules d’un maillage de 40 μm et recueillez le débit sortant dans un nouveau tube de 50 mL. Étiquetez ce tube comme « tube 1 ».
   REMARQUE : Ces filtrations à l’étape 5.1 et à l’étape 5.2 élimineront les gros agrégats cellulaires, qui sont souvent composés de populations de cellules mixtes.

6. Sédimentation des amas cellulaires et ensemencement cellulaire

1. Centrifuger les échantillons à 30 x g pendant 5 min à température ambiante pour sédimenter les amas cellulaires.
2. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette stérile (ne pas verser) et placez-le dans un tube frais de 50 ml (« tube 2 »).
3. Suspendre la pastille dans le « tube 1 » et remplir le tube jusqu’à 50 mL de PBS−⁻. Remplir le « tube 2 » jusqu’à 50 ml avec du PBS−⁻.
   NOTE: À partir de cette étape, les deux tubes sont traités de la même manière.
4. Centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
5. Suspendre les pastilles avec 2 mL de milieu de croissance (voir le tableau des matériaux) et ensemencer la suspension dans deux puits distincts d’une plaque pré-revêtue de 6 puits (étape 1.2).
   NOTE: À partir de cette étape, nourrir les cellules tous les 2 jours avec le milieu de croissance jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (environ 1 semaine, selon la taille de l’échantillon) afin d’obtenir un nombre raisonnable de cellules pour le tri.

7. Expansion cellulaire

1. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS avec CaCl 2 et MgCl₂ (PBS++, voir le tableau des matières) pour éliminer les cellules sanguines résiduelles (l’utilisation de PBS⁺⁺ est importante pour éviter le décollement des cellules).
2. Retirez le PBS⁺⁺ et ajoutez un nouveau milieu de culture.
3. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence (environ 1 semaine, selon la taille de l’échantillon).

8. Tri cellulaire

1. Détacher les cellules à l’aide de 500 μL de trypsine-EDTA (0,05 %, voir le tableau des matériaux), centrifuger et remettre en suspension la pastille avec 190 μL de PBS^−−.
2. Ajouter 10 μL d’un anticorps anti-CD31-FITC humain conjugué fluorescent (dilution 1:20, voir le tableau des matières) et incuber la suspension cellulaire à 4 °C pendant 30 min.
3. Laver les cellules avec 10 mL de PBS−−, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de ^PBS−−.
4. Isoler et recueillir des cellules CD31 positives (CD31+) par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), à l’aide d’une buse de 100 μm, et les recueillir dans un tube.
   1. Conformément à la stratégie de contrôle, définissez d’abord la morphologie cellulaire à l’aide des paramètres de la zone de diffusion latérale, SSC-A et FSC-A. Ensuite, sélectionnez des cellules individuelles à l’aide d’un diagramme de points FSC-Area/FSC-Height ou SSC-Area/SSC-Height, définissez les cellules positives dans l’échantillon marqué par rapport à l’échantillon témoin non coloré et dirigez les cellules fluorescentes dans le tube de collecte²¹.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et suspendre la pastille dans 2 mL de milieu de croissance pour l’ensemencement dans les puits pré-revêtus d’une plaque de 6 puits.

9. Expansion post-tri

1. Deux jours après le tri cellulaire, remplacer le milieu conditionné par un milieu de croissance frais.
2. Répétez les étapes 7.1 et 7.2 tous les 2 jours pour l’expansion cellulaire.

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Résultats

Isolement HLMEC
Le principal problème lors de l’isolement des HLMVECs est la présence de cellules contaminantes car les capillaires microscopiques ne peuvent pas être facilement séparés du tissu stromal. Par conséquent, il est crucial d’atteindre la plus grande pureté possible dès les premiers stades du processus d’isolement afin de réduire les passages de culture et, par conséquent, le vieillissement cellulaire. De même, un protocole d’isolement optimal devrait donner le rendement ...

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Discussion

Les multiples rôles joués par les cellules endothéliales vasculaires dans la physiopathologie humaine font de ces cellules un outil indispensable pour les études pathogéniques et pharmacologiques in vitro . Étant donné que les EC de différents sites / organes vasculaires présentent des caractéristiques et des fonctions particulières, la disponibilité de CE saines et malades de l’organe d’intérêt serait idéale à des fins de recherche. Par exemple, les HLMVECs sont essentiels pour les études s...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA 1X	GIBCO	25300-054	Used to detach cells from the culture plates
Anti CD31 Antibody, clone WM59	Dako	M0823	Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50
Anti vWF Antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-14029	Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100
Autoclavable surgical scissors	Any		Used for chopping specimens
Cell strainers 40 µm	Corning	431750	Used during the second filtration
Cell strainers 70 µm	Corning	431751	Using during the first filtration
Collagenase, Type 2	Worthington	LS004177	Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL
Conjugated anti CD31 Antibody	BD Biosciences	555445	Used for cell sorting (1:20 dilution)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with  CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing before medium change
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2	Sigma-Aldrich	D8537	Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization
Endothelial Cell Growth Medium MV	PromoCell	C-22020	HLMVEC growth medium
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895	Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL
Gelatin from porcine skin, type A	Sigma-Aldrich	G2500	Used for plate coating
Type A gelatin	Sigma-Aldrich	g-2500	Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5%