Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Résumé

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Résumé

Les macrophages résidents du tissu péritonéal ont de larges fonctions dans le maintien de l’homéostasie et sont impliqués dans des pathologies au sein des tissus locaux et voisins. Leurs fonctions sont dictées par des signaux microenvironnementaux ; Ainsi, il est essentiel d’étudier leur comportement dans une niche physiologique in vivo . À l’heure actuelle, des méthodologies spécifiques de ciblage des macrophages péritonéaux utilisent des modèles transgéniques de souris entières. Ici, un protocole pour une modulation in vivo efficace de l’expression de l’ARNm et des petites espèces d’ARN (par exemple, les microARN) dans les macrophages péritonéaux à l’aide de particules de lentivirus est décrit. Des préparations de lentivirus ont été fabriquées dans des cellules HEK293T et purifiées sur une seule couche de saccharose. La validation in vivo de l’efficacité du lentivirus après injection intrapéritonéale a révélé une infection prédominante des macrophages limitée aux tissus locaux. Le ciblage des macrophages péritonéaux a été couronné de succès pendant l’homéostasie et la péritonite induite par les thioglycolates. Les limites du protocole, y compris l’inflammation de faible niveau induite par l’administration intrapéritonéale de lentivirus et les restrictions de temps pour les expériences potentielles, sont discutées. Dans l’ensemble, cette étude présente un protocole rapide et accessible pour l’évaluation rapide de la fonction des gènes dans les macrophages péritonéaux in vivo.

Introduction

Les macrophages tissulaires (Mφ) sont une population hétérogène de cellules immunitaires phagocytaires qui détectent et répondent aux agents pathogènes envahissants ^1,2. De plus, ils jouent un rôle essentiel dans le développement des tissus, le remodelage et le maintien de l’homéostasie ^1,3. De nombreux tissus Mφ dérivent des progéniteurs du sac vitellin au cours de l’embryogenèse et persistent dans le tissu tout au long de la vie ^4,5. Le phénotype et les fonctions de ces cellules sont dictés par les interactions collaboratives et hiérarchiques de facteurs de transcription spécifiques et du microenvironnement local 6,7,8,9. Une compréhension croissante de cette dépendance augmente le besoin de méthodes in vivo efficaces pour la manipulation génétique de Mφ dans leur niche physiologiquement pertinente.

Les vecteurs lentiviraux sont un outil fréquemment utilisé pour la manipulation des acides nucléiques dans des populations cellulaires spécifiques in vivo 10,11,12, en particulier en raison de leur capacité à infecter à la fois les cellules en division et les cellules non divisées et à s’intégrer de manière stable dans le génome de l’hôte ^13,14. Au cours des deux dernières décennies, la technologie d’administration des lentivirus a été optimisée, et des enveloppes alternatives et des promoteurs synthétiques ont été étudiés pour augmenter le ciblage spécifique à la lignée ^8,15. En raison de son large tropisme cellulaire, la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G)^16,17 est devenue l’enveloppe de référence utilisée dans la technologie des lentivirus.

Dans ce protocole¹⁸, des particules lentivirales pseudotypées VSV-G sont utilisées pour démontrer l’administration ciblée et efficace de l’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) et du microARN (miR) à Mφ (pMφ) péritonéal de souris in vivo, à l’état d’équilibre¹⁹. L’expression du transgène a été déterminée par le promoteur du virus formant un foyer de la rate (SFFV). L’infection productive des cellules a été définie par l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) améliorée dérivée du lentivirus. L’utilisation de cette approche a permis une lecture facile pour les expériences de lentivirus in vivo afin de définir la dose optimale et la période expérimentale. Enfin, la provocation lentivirale in vivo de souris au cours de l’inflammation induite par le thioglycolate a révélé la propension naturelle à l’infection sélective par pMφ.

Protocole

Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux directives de l’Institutional et du Home Office du Royaume-Uni.

REMARQUE : Toutes les études in vivo avec des lentivirus doivent être réalisées conformément aux directives locales et nationales sur l’utilisation éthique des animaux en recherche, ainsi qu’à toutes les réglementations associées à l’utilisation de matières infectieuses de catégorie II. Le bien-être des animaux doit également être surveillé conformément aux réglementations locales. À cette étape du protocole, il faut faire preuve d’une extrême prudence lorsqu’on travaille avec des particules lentivirales et des objets tranchants.

1. Préparation des cellules de HEK293T pour la transfection

REMARQUE : Effectuez ces étapes sous une enceinte de sécurité biologique de culture de tissus stériles.

1. Préparez le milieu d’aigle modifié Dulbecco’s complet (cDMEM) pour les cellules HEK293T en combinant les 450 mL de DMEM avec 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (50 mL) et une concentration finale de 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
2. Dégivrez HEK293T cellules au moins 1 semaine avant la transfection prévue. Maintenez des conditions de croissance saines et passez tous les 2-3 jours en utilisant la trypsine + EDTA pour détacher les cellules du flacon.
3. Un jour avant la transfection, aspirez soigneusement le milieu de croissance des cellules et lavez doucement les cellules avec du DPBS stérile. Ajouter 1 à 5 ml de trypsine dans le ballon et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 2 à 5 min.
4. Ajouter 5 à 10 ml de cDMEM et faire tourner les cellules à 350 x g pendant 5 min. Retirez le liquide et remettez en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de cDMEM. Compter les cellules et ensemencer 10-11 x 10⁶ cellules HEK293T viables par fiole T175 dans 20 mL de cDMEM.
5. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant la nuit pour permettre aux cellules HEK293T d’atteindre une confluence de 70 % à 80 %.
6. Le lendemain, confirmez la confluence des cellules au microscope optique.
7. Retirer le milieu de la fiole à l’aide d’une bande sérologique de 25 mL sans perturber la monocouche cellulaire.
8. Ajoutez délicatement 10 ml de DPBS et basculez la plaque pour laver les cellules, en prenant soin de ne pas perturber la monocouche cellulaire.
9. Retirer le DPBS à l’aide d’une bande sérologique de 25 ml.
10. Ajouter 15 mL de cDMEM neuf sur la paroi par fiole T175 afin de ne pas perturber la monocouche cellulaire, et remettre la plaque dans l’incubateur à 37 °C.

2. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif de transfection lipidique non liposomale

1. Dans un tube à centrifuger de 15 ml, préparer les composants lentiviraux : 2 μg de plasmide lentiviral, 1,5 μg de pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) et 1 μg de pMD2.G (pCMV-MD2.G) avec Buffer EC (kit de réactif de transfection) jusqu’à un volume final de 600 μL.
2. Ajouter 36 μL de solution d’amplification. Mélangez les composants à l’aide d’une pipette de 1 mL en aspirant à plusieurs reprises une partie du liquide et en la remettant goutte à goutte directement sur la solution restante. Laisser poser 5 min à température ambiante (RT).
3. Ajouter 120 μL de réactif de transfection et mélanger comme ci-dessus environ 20 fois. Incuber pendant 10 min à RT.
4. Ajouter 5,2 mL de cDMEM et mélanger comme ci-dessus avec une bande sérologique de 5 mL.
5. À l’aide d’une pipette de transfert jetable, ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte directement sur la monocouche de cellules HEK293T (en évitant les parois du ballon), en étalant le mélange à différents endroits du ballon.
6. Répartissez le plasmide en balançant doucement le ballon d’un côté à l’autre. Évitez de mettre du liquide dans le couvercle de la gourde.
7. Incuber le ballon à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 48 h. Confirmer la transfection efficace de HEK293T cellules par l’apparition d’un marqueur fluorescent, ici la GFP, dans les 24 heures suivant la transfection surveillée au microscope fluorescent d’imagerie cellulaire.
   REMARQUE : Pour les constructions sans marqueur fluorescent, HEK293T cellules doivent être testées pour détecter la présence du gène marqueur utilisé ou un changement d’expression dans le gène ou la protéine d’intérêt par des techniques appropriées, p. ex., qPCR. Alternativement, la transfection réussie peut être vérifiée indirectement lors de l’essai de la collection de lentivirus sur des cellules Jurkat aux étapes ultérieures du protocole par les techniques ci-dessus.
   ATTENTION : Les cellules HEK293T transfectées sont considérées comme infectieuses, et des précautions de sécurité appropriées doivent être mises en œuvre lors de la manipulation de ces cellules. Les règles locales doivent être respectées, ce qui peut généralement inclure le travail sous une enceinte de sécurité biologique de catégorie II, l’utilisation de gants doubles et d’une solution de décontamination appropriée pour la désinfection, par exemple, une concentration accrue de déchets d’eau de Javel (2 000 ppm) ou une solution équivalente selon les directives de biosécurité institutionnelles. Toutes les solutions et tous les plastiques entrant en contact avec la préparation de lentivirus doivent être désinfectés conformément aux procédures de biosécurité de l’établissement.

3. Collecte de particules lentivirales

1. Préparez une solution de décontamination, une solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium) à forte concentration (2 000 ppm) ou un agent équivalent conformément aux directives de biosécurité de l’établissement dans un seau et placez-le dans l’enceinte de sécurité biologique.
2. Préparez l’enceinte de sécurité biologique en enlevant tous les objets en excès, tels que les supports de tubes vides, etc.
3. Pré-étiquetez un tube à centrifuger de 50 ml par flacon de cellules HEK293T T175 et retirez le couvercle du tube à centrifuger. Placez les tubes dans un support stable.
4. Récupérez le ballon de l’incubateur et confirmez l’expression de la GFP à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un laser de 488 nm (figure 1A). L’intensité du signal dépend de l’efficacité de transfection de la procédure et des constructions utilisées.
5. Collectez le milieu des cellules dans le tube à centrifuger de 50 ml pré-étiqueté. Inclinez le ballon de HEK293T T175 avec les cellules transfectées de sorte que le milieu s’accumule dans le coin inférieur du ballon. À l’aide d’une bande sérologique de 25 mL, prélever le milieu sans perturber la monocouche cellulaire. Certaines cellules flottantes peuvent être visibles à ce stade. Transférez le fluide dans un tube à centrifuger propre de 50 ml et fermez le couvercle.
   1. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, ajoutez 25 ml de cDMEM frais et chaud dans la fiole. Assurez-vous de diriger le flux moyen sur les parois du ballon pour ne pas perturber la monocouche cellulaire. Remettre dans l’incubateur le ballon contenant les cellules de HEK293T transfectées (37 °C, 5 % CO₂).
      REMARQUE : Une deuxième collecte de lentivirus et une purification supplémentaire peuvent être effectuées après 24 heures supplémentaires en suivant la procédure décrite dans les étapes ci-dessus.
6. Lorsque la collecte de lentivirus est terminée après 24 h ou 48 h, ajoutez une solution de décontamination aux cellules, en vous assurant qu’elle recouvre la monocouche cellulaire. Maintenez le ballon à l’horizontale pendant les 24 prochaines heures, puis jetez-le conformément à la réglementation appropriée de catégorie II.

4. Purification du lentivirus

1. Filtrez le milieu collecteur à partir de l’étape 3.5.
   1. Retirez le piston de la seringue de 50 ml et insérez un filtre stérile de polyéther sulfone ou de fluorure de polyvinylidène de 0,45 μm à faible liaison protéique dans l’extrémité de la seringue. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, ajoutez le milieu prélevé à l’étape 3.5.1 dans la seringue et remettez doucement le piston en place.
   2. Poussez lentement le bouchon pour faire passer le fluide à travers le filtre dans un tube à centrifuger frais de 50 ml. Si le débit diminue considérablement, positionnez la seringue avec le filtre vers le haut et tirez suffisamment sur le piston pour dégager le fluide du filtre.
   3. Remplacez soigneusement le filtre de la seringue par un nouveau et jetez le filtre usagé dans la solution de décontamination. Poursuivre la filtration moyenne. Une fois terminé, décontaminez le filtre et la seringue en immergeant le filtre et en remplissant la seringue avec la solution de décontamination.
2. Prérefroidissez l’ultracentrifugeuse en réglant la température à 4 °C et fermez le couvercle pour permettre à la température de s’acclimater.
3. Ajouter 3 mL de solution de saccharose à 20 % (20 % p/v dans de l’eau ultrapure, filtre stérilisé à l’aide d’un filtre de 0,22 μm) dans le fond du tube conique de l’ultracentrifugeuse.
4. À l’aide d’une bande sérologique de 25 ml, superposer un milieu filtré sur la couche de saccharose, en prenant soin de ne pas déranger les couches.
   1. Utilisez le réglage de vitesse le plus bas sur le boyau de pipette. Inclinez le tube conique de l’ultracentrifugeuse à environ 45° et ajoutez lentement le milieu filtré contenant du lentivirus de l’étape 4.1 à la paroi du tube. Assurez-vous que le milieu et le saccharose ne se mélangent pas et que la séparation nette des couches est visible (Figure 1B). Au fur et à mesure que le volume de la couche moyenne augmente, inclinez lentement le tube de l’ultracentrifugeuse en position verticale.
5. Si le volume total, y compris le saccharose et le milieu, dans le tube d’ultracentrifugation est inférieur à 29 ml, complétez avec du cDMEM frais pour éviter que le tube ne s’effondre pendant l’essorage. Pour plusieurs collections de T175 mL, mélanger les préparations de milieux filtrés et utiliser plusieurs tubes à ultracentrifuger. Remplissez le tube final de l’ultracentrifugeuse avec le fluide si nécessaire.
6. Assurez-vous que les godets de l’ultracentrifugeuse sont propres ; Il n’y a pas de résidu de fluide sur le fond du seau ou les bouchons. Si nécessaire, essuyez avec ~70 % d’alcool. Placez les adaptateurs de tube appropriés au fond de chaque seau (Figure 1C) et abaissez doucement les tubes d’ultracentrifugation dans les seaux.
7. Fermez les godets en toute sécurité et accrochez-les aux espaces prévus à cet effet sur le rotor d’essorage.
8. Assurez-vous que les seaux sont équilibrés avec les mêmes volumes de saccharose et de milieu. Un rotor en vrille ne doit jamais fonctionner sans godets, bien que les godets opposés puissent être laissés vides²⁰ (Figure 1D).
9. Insérez délicatement le rotor dans l’ultracentrifugeuse et allumez le vide. Réglez le taux d’accélération et de décélération de l’ultracentrifugeuse sur le réglage le plus bas et exécutez les préparations de lentivirus à 85 000 x g pendant 90 min à 4 °C.
10. Attendez que l’ultracentrifugeuse atteigne la vitesse requise (environ 3 à 5 minutes) avant de vous éloigner pour vous assurer que le rotor est correctement inséré et que l’essorage ne se terminera pas.
11. Pendant que l’ultracentrifugeuse fonctionne, nettoyez l’espace de travail conformément aux exigences de sécurité de catégorie II et préparez l’espace pour les prochaines étapes.
12. Lorsque l’essorage est terminé, désactivez le vide et retirez soigneusement le rotor afin de ne pas perturber les échantillons.
13. Examinez l’ultracentrifugeuse pour tout déversement et confirmez qu’il n’y a pas de fuite des godets. En cas de déversement, doublez le gant et décontaminez la centrifugeuse et la surface externe des seaux avec des produits antiviraux.
14. Retirez les seaux de l’ultracentrifugeuse et transportez-les avec précaution vers l’enceinte de sécurité biologique de catégorie II.
    REMARQUE : Les particules de lentivirus s’accumulent au fond du tube de l’ultracentrifugeuse. La pastille n’est pas visible à l’œil nu.
15. Versez le saccharose et le milieu d’un seul mouvement fluide directement dans le conteneur à déchets avec la solution de décontamination.
16. En gardant le tube de l’ultracentrifugeuse inversé, transférez-le sur la double couche de tissu et laissez-le sécher pendant 10 min. Pendant ce temps, essuyez l’intérieur des seaux avec un mouchoir imbibé d’eau et séchez-les à l’air.
17. Séchez soigneusement tout liquide restant du bord du tube de l’ultracentrifugeuse avec un mouchoir en papier avant de le retourner à la verticale. Désinfectez les tissus et la surface en dessous.
18. Remettre la pastille virale en suspension dans 1 mL de milieu ou de solution sans sérum nécessaire à une expérimentation ultérieure en pipetant doucement la solution de haut en bas. Laissez-le pendant 15 min à RT à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique de catégorie II.
19. Mélanger délicatement les préparations de lentivirus à l’aide d’une pipette de 1 mL avant de faire l’aliquotage dans des tubes à vis de 1,5 mL (p. ex., cryotubes). Préparer les aliquotes pour le travail in vivo (multiplicité de 100 μL) et pour le titre de lentivirus dans les cellules T Jurkat (1 x 20 μL) (voir étape 5).
20. Éviter les cycles de gel-dégel ; Les préparations lentivirales peuvent être conservées à -80 °C jusqu’à 6 mois sans effet négatif sur l’infectiosité.

5. Titrage de la production de lentivirus dans les lymphocytes T Jurkat

1. Préparez le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) pour les lymphocytes T Jurkat en complétant 500 mL de RPMI-1640 avec 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal et la concentration finale de 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
2. Pour assurer une culture saine de cellules T Jurkat, maintenez les cellules en culture jusqu’à 1 semaine avant l’infection.
3. Le jour du titrage du lentivirus, mettre en plaque les lymphocytes T Jurkat viables dans une plaque de 24 puits à raison de 2 x 10⁵ cellules/puits dans 200 μL par puits de cRPMI-1640.
4. Utilisez du lentivirus fraîchement prélevé ou décongelez le flacon de lentivirus contenant 20 μL sur de la glace et mélangez doucement en pipetant de haut en bas.
5. En utilisant la dilution en série dans cRPMI-1640, infectez les lymphocytes T Jurkat avec 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL et 10 μL de stock de lentivirus. Basculez doucement la plaque pour assurer une répartition égale du lentivirus. Les lymphocytes T Jurkat non infectés servent de contrôle négatif.
6. Incuber la plaque à 37 °C. Après 4 h, remplissez chaque puits avec du cRPMI jusqu’à un volume total de 400 μL. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 3 jours.
7. 48 h après l’infection, confirmer l’expression de la GFP sous un système d’imagerie fluorescente.
8. 3 jours après l’infection, prélever chaque puits de la plaque à 24 puits dans des tubes de prélèvement séparés de 1,5 mL et centrifuger les cellules à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
9. Jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 300 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % (p/v) préparé dans du DPBS et la laisser pendant 15 min sur de la glace dans l’obscurité.
10. Centrifuger les cellules à 350 x g à 4 °C pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (DPBS stérile + 4 % de FCS + 1 mM d’EDTA stérile).
11. Analysez la fréquence d’expression de la GFP et l’intensité fluorescente moyenne du lentivirus infecté et de ses cellules témoins à l’aide de la cytométrie en flux (Figure 2).

6. Infection par lentivirus in vivo des macrophages péritonéaux résidant dans les tissus

1. Dans une enceinte de sécurité biologique de catégorie II, chargez les aiguilles à insuline d’un volume total de 200 μL de milieu de milieu sans sérum contenant la quantité requise de lentivirus (utilisez des aiguilles à usage unique, 30 G pour le bien-être des animaux et pour éviter la perte de liquide dans l’aiguille).
2. Replacez la gaine de l’aiguille sur l’aiguille en utilisant la technique de la cuillère à une main. Gardez l’aiguille sur de la glace et injectez dans les 30 minutes.
3. Dans l’animalerie, mettre en place une enceinte de sécurité biologique de catégorie II avant les injections (figure 1E).
   1. Posez une feuille de tissu propre. Desserrez la gaine de l’aiguille à insuline contenant le lentivirus.
   2. Préparez une boîte de Pétri contenant de petits morceaux de tissu et un désinfectant à base de gluconate de chlorhexidine, un tube de 50 ml contenant une solution de décontamination (solution d’eau de Javel à 2 000 ppm) et un contenant bien sûr et tranchant.
4. Retenir la souris en saisissant la peau au niveau de la nuque²¹. Une souris correctement retenue est immobile, ce qui est nécessaire pour des raisons de sécurité.
5. Avec l’abdomen vers le haut, pointez la tête de l’animal légèrement vers le bas. Injectez le lentivirus par voie intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de la cavité abdominale. Il s’agit d’éviter l’injection dans les organes de la cavité péritonéale.
6. Avant de relâcher la souris, remplissez la seringue de solution de décontamination et jetez-la en toute sécurité dans la boîte de sécurité tranchante.
7. Essuyez le site d’injection sur l’abdomen de la souris avec un tissu imbibé de désinfectant et remettez l’animal dans la cage.
8. Hébergez la souris injectée de lentivirus dans un scantainer de catégorie II ou dans des cages ventilées individuellement (cages isolées avec filtration de l’air à haute efficacité) pendant au moins 72 heures après l’injection. Placez une carte d’information appropriée à l’avant de la cage.
9. Déplacez la souris dans la nouvelle cage de détention de catégorie I après 72 heures après l’infection, en fonction des approbations de sécurité locales. Surveiller les souris quotidiennement pendant un total de 3 jours à compter de l’injection.

7. Collecte de cellules péritonéales de souris infectées par des lentivirus

ATTENTION : Pour les prélèvements dans les 72 heures suivant l’injection de lentivirus, suivez les règles de sécurité biologique de catégorie II de l’établissement. La litière et la cage d’attente où les animaux infectés ont été gardés dans les 72 heures suivant l’injection de lentivirus doivent être décontaminées conformément aux règles de sécurité biologique de catégorie II de l’établissement.

1. Euthanasier les souris conformément aux réglementations institutionnelles, par exemple par inhalation d’une concentration croissante de CO₂, suivie d’une confirmation de la mort par luxation cervicale.
2. Nettoyez l’abdomen de la souris avec 70% d’isopropanol et coupez soigneusement la peau pour exposer la membrane de la cavité péritonéale.
3. Lavez la cavité péritonéale avec 6 ml de tampon FACS glacé à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 23 g. Évitez de perforer des organes.
4. Massez doucement le péritoine pour déloger les cellules vers le tampon FACS.
5. Prélevez le liquide péritonéal à l’aide de la même seringue et de la même aiguille.
6. Retirez l’aiguille et transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.
7. Gardez les lavages péritonéaux sur de la glace.
8. Prélever d’autres organes nécessaires et les stocker selon les besoins de l’étude.
9. Éliminer les carcasses d’animaux conformément aux directives locales en matière d’animaux et de sécurité.

8. Coloration et analyse des cellules péritonéales

1. Centrifuger le lavage péritonéal à 350 x g à 4 °C pendant 5 min, jeter le surnageant dans la solution de décontamination et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de tampon FACS.
2. Comptez les cellules collectées et la plaque 4 x 10⁵ cellules par puits dans une plaque à fond en V de 96 puits.
3. Effectuez une coloration de viabilité à l’aide d’un réactif fixable (par exemple, le kit de coloration à cellules mortes Fixable Near-IR utilisé ici) conformément aux instructions du fabricant.
4. Si des cellules ont été infectées au cours des 72 dernières heures, fixez-les dans un PFA à 2 % pendant 15 minutes sur de la glace. Ajouter un volume égal de DPBS froid et centrifuger à nouveau à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
5. Préparez le tampon de blocage : Mélangez 4 μg/mL d’anticorps 2.4G2 dans du sérum de rat à 10 % (v/v) dans un tampon FACS pour la coloration de surface ou un tampon de perméabilisation pour la coloration intracellulaire.
6. Remettre en suspension chaque puits contenant des pastilles de cellule dans 50 μL de tampon de blocage et incuber à 4 °C pendant 15 min.
7. Préparez un mélange d’anticorps dans 50 μL de tampon FACS (pour la coloration de surface) ou de tampon de perméabilisation (pour la coloration intracellulaire) pour chaque échantillon. Le volume final de coloration pour chaque échantillon sera de 100 μL, y compris 50 μL de tampon de blocage. Calculez les concentrations d’anticorps en conséquence (tableau 1).
8. Ajouter 50 μL de mélange d’anticorps aux échantillons et 50 μL de témoins d’isotypes et de tampon de contrôle aux échantillons de contrôle. Incuber les échantillons pendant 30 min sur de la glace dans l’obscurité. Inclure des cellules non colorées et des contrôles d’isotype, au besoin.
9. Lavez chaque puits avec 100-200 μL de DPBS glacé et centrifugez la plaque à 350 x g à 4 °C pendant 5 min. Répétez cette étape pour éliminer tous les anticorps non liés. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux.

9. Extraction de cellules d’organes

1. Préparez 1 mL de mélange de digestion par organe : Mélangez la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), 2 mg/mL de collagénase de type IV et 0,03 mg/mL de DNase I (y compris 1,5 mg/mL d’hyaluronidase pour la digestion pulmonaire).
2. Transférez l’organe prélevé dans 1 mL de mélange de digestion et hachez-le avec des ciseaux.
3. Filtrer les cellules à travers une crépine de 40 μm et centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
4. Si vous isolez des cellules du poumon, de la rate ou du foie, lysez les globules rouges à l’aide d’un tampon de lyse ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Filtrer les cellules à travers une crépine de 40 μm et centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min.
5. Colorez et analysez les cellules comme décrit dans la section 8.

Résultats

Lorsqu’il est suivi intégralement et correctement, ce protocole produit un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de haute qualité par préparation unique, ce qui est suffisant pour douze injections in vivo au volume optimal déterminé dans cette étude¹⁸. Le succès de la transfection peut être évalué tôt dans le protocole. Les cellules HEK293T saines et confluentes devraient présenter, si elles sont présentes dans les plasmides, un signal mar...

Discussion

Les macrophages résidents dans les tissus remplissent une gamme de fonctions homéostatiques et inflammatoires spécifiques aux tissus ^1,2 dictées par leur environnement physiologique ^6,7,8,9. Dans ce protocole, une méthode efficace¹⁸ de manipulation des macrophages résidents...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180