Dissection de souris du système nerveux central et périphérique entier

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour compléter la dissection des systèmes nerveux central et périphérique de souris. Les tissus disséqués sont analysés plus en détail dans des applications en aval, telles que la prise de photos grossières ou l’histologie.

Résumé

Les modèles animaux représentent le cheval de bataille du domaine des neurosciences. Malgré cela, il n’existe toujours pas aujourd’hui de protocole étape par étape pour disséquer un système nerveux complet de rongeur, ni de schéma complet le représentant qui soit disponible gratuitement. Seules des méthodes pour prélever le cerveau, la moelle épinière, un ganglion spécifique de la racine dorsale et le nerf sciatique (séparément) sont disponibles. Ici, nous fournissons des images détaillées et un schéma du système nerveux murin central et périphérique. Plus important encore, nous décrivons une procédure robuste pour effectuer sa dissection. L’étape de pré-dissection de 30 minutes permet d’isoler le système nerveux intact à l’intérieur de la vertèbre avec des muscles exempts de viscères et de peau. Une dissection de 2 à 4 heures est suivie sous un microscope de micro-dissection pour exposer la moelle épinière et les nerfs thoraciques, et enfin décoller tout le système nerveux central et périphérique de la carcasse. Ce protocole représente une avancée significative dans l’étude de l’anatomie et de la physiopathologie du système nerveux à l’échelle mondiale. Par exemple, les ganglions de la racine dorsale disséqués d’un modèle de souris de neurofibromatose de type I peuvent être traités davantage pour l’histologie afin de démêler les changements dans la progression tumorale.

Introduction

L’objectif global de cette méthode est d’isoler le système nerveux central et périphérique d’une souris en un seul morceau. Il n’existe actuellement aucun protocole permettant de disséquer l’ensemble du système nerveux d’un rongeur pour l’étudier au niveau mondial. Les neuroscientifiques utilisent généralement le nerf sciatique comme substitut de tout nerf périphérique¹, et les^ganglions L3 à L5 2 comme substitut de tout ganglion. En utilisant ces méthodes, il est impossible de conclure si les résultats sont spécifiques au nerf/ganglion particulier. Comme on sait qu’au moins certaines pathologies nerveuses n’affectent pas tous les nerfs et ganglions de la même manière ^3,4,5, il faut développer une technique pour permettre l’isolement de l’ensemble du système nerveux des rongeurs afin de l’étudier globalement.

Au fil des ans, nous avons développé et affiné une méthode pour disséquer l’ensemble des systèmes nerveux central et périphérique de la souris. La première étape consiste essentiellement en une dissection grossière des souris en préparation des étapes de micro-dissection sous le microscope de dissection. Dans les étapes 2 à 4, la moelle épinière et les nerfs thoraciques sont exposés, le cerveau est disséqué et toute la moelle épinière et les nerfs périphériques sont décollés de la carcasse.

Cette méthode est puissante lorsqu’elle est couplée à l’imagerie ou à l’histologie pour documenter tout changement macroscopique ou microscopique 6,7,8,9. Les neuroscientifiques intéressés à étudier le changement global ou à mener des expériences non fondées sur des hypothèses devraient utiliser cette méthode pour étudier le système nerveux global.

Protocole

Les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux de l’Université de Sherbrooke, une institution certifiée par le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Préparation à la micro-dissection (pré-dissection)

1. Effectuez une anesthésie avec 5 % d’isoflurane, suivie d’une euthanasie avec 2 % d’isoflurane et 10 psi de CO₂ jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signes vitaux.
   REMARQUE : N’effectuez pas de luxation cervicale, car cela endommage la moelle épinière et les ganglions cervicaux.
2. Placez la souris euthanasiée vers le haut (vue antérieure) sur un tampon de dissection et vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70 %.
3. Ensuite, épinglez les membres supérieurs et inférieurs, à l’aide de quatre broches de petit diamètre pour maintenir la souris en position pendant la dissection.
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, ouvrez la peau du bas-ventre à la gorge.
5. Décollez la peau pour exposer les organes internes et utilisez des broches supplémentaires pour maintenir la peau de chaque côté tout en exposant la cavité abdominale.
6. Ouvrez la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
7. À l’aide d’une paire de pinces anatomiques standard, saisissez l’œsophage et la trachée et coupez juste au-dessus de la pince.
8. Ensuite, commencez à décoller tous les organes internes dans une approche crânienne à caudale. Pour ce faire, coupez le diaphragme le long de la colonne vertébrale pour retirer tous les organes internes en un seul morceau.
9. Détachez la souris et rincez le sang de souris supplémentaire de la cavité abdominale dans un évier.
10. Placez la souris face cachée (vue postérieure). Épinglez les membres supérieurs et inférieurs, à l’aide de quatre goupilles pour maintenir la souris en position pendant la dissection.
11. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, décollez la peau de la tête vers les membres postérieurs.
12. Exposez le nerf sciatique gauche (membre inférieur).
    1. Coupez les muscles de la partie inférieure du membre inférieur gauche.
    2. Localisez et exposez le nerf sciatique en retirant le muscle qui l’entoure.
    3. Coupez soigneusement le nerf sciatique au niveau de la ramification des nerfs sural, tibial et péronier, et épargnez les vaisseaux sanguins.
    4. Continuez à isoler le nerf sciatique à l’aide d’une pince anatomique standard et de ciseaux de Bonn extra fins, jusqu’à ce qu’il devienne parallèle à la colonne vertébrale, en laissant un nerf libre d’environ 2 cm.
    5. Insérez les ciseaux chirurgicaux parallèlement à la moelle épinière et coupez la hanche.
    6. Disloquez la hanche en écartant le sacrum et le fémur à l’aide des doigts.
       REMARQUE : Au cours de ce processus, il est nécessaire de s’arrêter fréquemment pour tirer doucement le nerf sciatique à l’aide d’une pince pour éviter de perturber.
    7. À la fin, arrachez délicatement le membre postérieur de la carcasse de la souris, en laissant un nerf sciatique d’environ 4 cm de long.
       REMARQUE : Au cours de ce processus, localisez le nerf L2 et retirez-le du membre postérieur pour éviter d’endommager le L2. Répétez l’étape 1.12 pour le côté droit.
13. Exposez les nerfs brachiaux (membres supérieurs).
    1. Manipulez la carcasse de la souris dans les mains, plutôt que sur une surface plane (tampon de dissection).
    2. Localisez le plexus brachial gauche en séparant la graisse et les muscles de l’aisselle gauche.
    3. Une fois localisé, coupez les principales ramifications du plexus brachial (radialement, axillaire, supra-scapulaire) et leurs sous-ramifications autour du cubitus avec des ciseaux de Bonn extra fins, en laissant des nerfs libres d’environ 1,5 cm. Décollez doucement le plexus du membre supérieur gauche.
    4. Luxation du membre supérieur gauche ; Assurez-vous qu’il est sans nerfs. Répétez l’étape 1.13 pour le côté droit.
14. Exposez le cerveau.
    1. Maintenant, placez la souris face vers le haut (vue antérieure)
    2. Insérez une lame des ciseaux Bonn extra fins dans la bouche et coupez la mandibule dans la gorge.
    3. Retirez la mandibule en coupant davantage des joues vers la gorge.
    4. Ensuite, coupez l’os du crâne en passant d’une oreille à l’autre.
       REMARQUE : Veillez à ne pas aller trop profondément et à endommager le cerveau.
    5. Coupez et retirez le palais et les os du nez pour ouvrir le crâne.
    6. Coupez la vertèbre C1 à la base du crâne, libérant le cervelet et le début de la moelle épinière.
    7. Enfin, coupez le crâne transversalement jusqu’à l’œil et retirez les morceaux du crâne pour exposer le cerveau.
       REMARQUE : Gardez le cerveau dans sa cavité jusqu’à ce que les nerfs soient décollés.
15. Retirez tout excès de graisse ou de muscles de la carcasse. Placez la carcasse dans du formol à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante (RT), suivie de brefs lavages salins tamponnés au phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’odeur fixatrice, et passez à l’étape suivante.
    REMARQUE : Si le système nerveux est disséqué dans les 2 prochaines semaines, conservez-le à 4 °C dans du PBS. Sinon, conservez-le indéfiniment dans du formol à 10 %. Utilisez toujours une cagoule chimique lorsque vous manipulez le formol.

2. Exposition de la moelle épinière

1. Pour exposer la moelle épinière, utilisez une approche crânienne-caudale. Pour retirer chaque vertèbre et leur couche musculaire au-dessus, coupez aux positions dix heures et deux heures sur le côté ventral, à l’aide de ciseaux à ressort Vannas. Ébrécher la vertèbre à l’aide d’une mini-pince Dumont. Continuez ce processus à travers les vertèbres cervicales et thoraciques.
2. Pour la section lombaire, coupez l’apophyse transversale de chaque côté de la vertèbre. Ensuite, coupez aux positions deux heures et dix heures en insérant la lame d’une paire de ciseaux à ressort Vannas dans le canal vertébral. Retirez les tissus en faisant attention aux nerfs qui sont parfois collés aux os.
3. Procédez de la même manière pour la partie caudale.

3. Exposition du nerf thoracique

1. Placez la carcasse sous le microscope de dissection pour visualiser la face antérieure.
2. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas, coupez le long de chaque côte (du sternum aux membres inférieurs) pour exposer les nerfs périphériques.
3. Ensuite, coupez la vertèbre des deux côtés (latéralement) du ganglion pour exposer le ganglion.

4. Décollement des nerfs périphériques

1. Pour décoller la moelle épinière et déloger davantage les nerfs périphériques, utilisez la mini-pince Dumont pour rouler doucement la moelle épinière et retirer les nerfs un par un, en commençant par la partie caudale de la moelle épinière.
   REMARQUE : Avant de décoller, une fixation supplémentaire peut être effectuée dans du formol à 10 % pendant 15 min à RT, suivie de brefs lavages 1x PBS jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’odeur de fixateur, comme effectué à l’étape 1.15.
2. Pour la partie thoracique, tirez le nerf à un angle de 90° (perpendiculaire à la moelle épinière).
3. Pour le plexus brachial, coupez la vertèbre à côté du nerf, pour faire de la place au nerf.
   REMARQUE : Le plexus brachial ne peut pas être passé sous la vertèbre, comme dans la région thoracique.
4. Retirez les muscles en excès pour dégager les nerfs.
5. Conserver dans du PBS à 4 °C jusqu’à un total de 2 semaines, ou indéfiniment dans du formol à 10 % à RT.

Résultats

Les rongeurs ont joué un rôle déterminant dans notre compréhension de la biologie du système nerveux et de la physiopathologie¹⁰. Curieusement, aucune méthode ne présente la dissection complète du système nerveux central et périphérique d’un rongeur pour évaluer l’anatomie et la variation pathologique dans un modèle en temps réel ^1,2,11.

Discussion

Pour éviter que les muscles et les nerfs ne se dessèchent, la carcasse doit être trempée dans du PBS toutes les 10 minutes. Lors de la luxation des membres inférieurs (étape 1.12.6), il est important de toujours avoir le plexus du nerf sciatique et la L2 en vue pour éviter de l’endommager/déchirer. Lors de la dissection du cerveau (étape 1.14.4), il est essentiel d’éviter d’aller trop loin pour ne pas endommager le cerveau. Lors de la dissection des ganglions de la racine...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont mini-forceps	Fine Science Tools	#11200-10
Extra Bonn scissors	Fine Science Tools	#14084-08
Formalin 10%	Fischer Scientific	#22-046-361
PBS 1x	BioShopCanada	#PBS404.500
Standard anatomical forceps	Fine Science Tools	#91100-12
Surgical scissors	Fine Science Tools	#140001-12
Vannas spring scissors	Kent Scientific	#INS600124