Vascularisation efficace des organoïdes rénaux par transplantation intracélomique dans des embryons de poulet

Résumé

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la transplantation d’organoïdes rénaux dans la cavité celomique d’embryons de poulet. Cette méthode induit la vascularisation et une maturation accrue des organoïdes en 8 jours et peut être utilisée pour étudier ces processus de manière efficace.

Résumé

Les organoïdes rénaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme contiennent des structures semblables à des néphrons qui ressemblent dans une certaine mesure à celles du rein adulte. Malheureusement, leur applicabilité clinique est entravée par l’absence d’un système vasculaire fonctionnel et, par conséquent, une maturation in vitro limitée. La transplantation d’organoïdes rénaux dans la cavité celomique d’embryons de poulet induit une vascularisation par des vaisseaux sanguins perfusés, y compris la formation de capillaires glomérulaires, et améliore leur maturation. Cette technique est très efficace, permettant la transplantation et l’analyse d’un grand nombre d’organoïdes. Cet article décrit un protocole détaillé pour la transplantation intracélomique d’organoïdes rénaux dans des embryons de poulet, suivie de l’injection de lectine marquée par fluorescence pour colorer le système vasculaire perfusé et de la collecte d’organoïdes transplantés pour l’analyse d’imagerie. Cette méthode peut être utilisée pour induire et étudier la vascularisation et la maturation organoïdes afin de trouver des indices pour améliorer ces processus in vitro et améliorer la modélisation de la maladie.

Introduction

Il a été démontré que les organoïdes rénaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) ont un potentiel pour les études de développement 1,2,3,4, le dépistage de la toxicité ^5,6 et la modélisation de la maladie^{5,7,8,9,10,11,12,13}. Cependant, leur applicabilité à ces fins et à d’éventuelles transplantations cliniques est limitée par l’absence d’un réseau vasculaire. Au cours du développement embryonnaire des reins, les podocytes, les cellules mésangiales et les cellules endothéliales vasculaires (CE) interagissent pour former la structure complexe du glomérule. Sans cette interaction, la barrière de filtration glomérulaire, constituée de podocytes, de la membrane basale glomérulaire (GBM) et de CE, ne peut pas se développer correctement^14,15,16. Bien que les organoïdes rénaux in vitro contiennent des CE, ceux-ci ne parviennent pas à former un réseau vasculaire approprié et diminuent avec le temps¹⁷. Il n’est donc pas surprenant que les organoïdes restent immatures. La transplantation chez la souris induit la vascularisation et la maturation des organoïdes rénaux 18,19,20,21. Malheureusement, il s’agit d’un processus à forte intensité de main-d’œuvre qui ne convient pas à l’analyse d’un grand nombre d’organoïdes.

Les embryons de poulet sont utilisés pour étudier la vascularisation et le développement depuis plus d’un siècle²². Ils sont facilement accessibles, nécessitent peu d’entretien, n’ont pas de système immunitaire pleinement fonctionnel et peuvent se développer normalement après l’ouverture de la coquille d’œuf^23,24,25,26. Il a été démontré que la transplantation d’organoïdes sur leur membrane chorio-allantoïdienne (CAM) conduit à la vascularisation²⁷. Cependant, la durée de la transplantation sur le CAM, ainsi que le niveau de maturation du greffon, sont limités par la formation de CAM, qui prend jusqu’au jour embryonnaire 7 pour se terminer. Par conséquent, une méthode a récemment été développée pour vasculariser efficacement et faire mûrir les organoïdes rénaux par transplantation intracélomique dans des embryons de poulet²⁸. La cavité celomique des embryons de poulet est connue depuis les années 1930 pour être un environnement favorable à la différenciation des tissus embryonnaires^29,30. Il est accessible tôt dans le développement embryonnaire et permet une expansion relativement illimitée du greffon dans toutes les directions.

Cet article décrit un protocole pour la transplantation d’organoïdes rénaux dérivés de l’hiPSC dans la cavité celomique d’embryons de poulet du jour 4. Cette méthode induit la vascularisation et une maturation accrue des organoïdes en 8 jours. L’injection d’agglutinine culinaris (ACL) marquée par fluorescence avant de sacrifier les embryons permet de visualiser les vaisseaux sanguins perfusés dans les organoïdes par microscopie confocale.

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Protocole

Conformément à la loi néerlandaise, l’approbation du comité du bien-être animal n’était pas requise pour cette recherche.

1. Préparation des organoïdes rénaux dérivés de l’hiPSC pour la transplantation

1. Différencier les CSPh des organoïdes rénaux en utilisant le protocole développé par Takasato et al.4,18,31. Culture des organoïdes suivant ce protocole sur des inserts de culture cellulaire en polyester avec des pores de 0,4 μm (inserts de culture cellulaire) jusqu’au jour 7 + 12 de différenciation. Chaque insert de culture cellulaire contiendra trois organoïdes.
2. Retirez les organoïdes de l’insert de culture cellulaire.
   1. Faites un trou au milieu de la membrane de l’insert de culture cellulaire avec une paire de pinces à dissection. À l’aide de ciseaux à dissection, effectuer trois coupes dans la membrane du trou au milieu jusqu’au bord de l’insert de culture cellulaire, en coupant entre les organoïdes. Cela se traduira par trois morceaux de membrane, chacun avec un organoïde attaché, qui sont toujours connectés à l’insert de culture cellulaire à leur bord extérieur.
   2. Saisissez l’un des morceaux de membrane près de son bord extérieur avec une paire de pinces et déchirez-le de l’insert de culture cellulaire. Placez le morceau de membrane avec l’organoïde attaché dans une boîte de Pétri. Ajoutez quelques gouttes de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sans calcium ni magnésium (DPBS^-/-) à l’organoïde pour éviter la déshydratation. Répétez l’opération pour les deux autres organoïdes.
3. Divisez les organoïdes en maintenant leur membrane en place avec une pince et en les coupant en deux avec une lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant (un organoïde entier est trop grand pour que le celom puisse s’en accommoder à ce stade de développement). Poussez doucement les deux moitiés organoïdes hors de la membrane avec un dissecteur de dure-mère. Jeter la membrane et laisser les organoïdes dans DPBS-^/- jusqu’à la transplantation.
   REMARQUE : Préparer un maximum de trois organoïdes à la fois pour la transplantation afin d’éviter de stresser les organoïdes avant la transplantation. Idéalement, une personne prépare les organoïdes tandis qu’une autre effectue la transplantation.

2. Préparation des embryons de poulet pour la transplantation

1. Incuber des œufs de leghorn blancs fécondés. Commencez l’incubation des œufs au jour de différenciation organoïde rénal 7 + 8 pour assurer le bon moment de la transplantation.
   1. Placer les œufs de livourne blancs fécondés (Gallus domesticus) horizontalement sur un support (figure 1A; Jour 0), marquant le milieu du côté orienté vers le haut avec un crayon.
      REMARQUE: Des supports en plastique sur mesure ou des cartons d’œufs peuvent être utilisés comme supports pour incuber les œufs.
   2. Placer le support avec les œufs dans un incubateur humidifié à 38 ± 1 ºC (figure 1A; Jour 0).
   3. Incuber les œufs pendant 3 jours, en gardant le bassin d’eau dans l’incubateur rempli.
2. Créez une fenêtre dans la coquille d’œuf le jour 3 de l’incubation.
   1. Au jour 3 de l’incubation, placez un petit morceau (~1 cm x 0,5 cm) de ruban adhésif transparent sur l’extrémité pointue de l’œuf (petite extrémité). Faites un petit trou dans la coquille d’œuf au milieu du ruban transparent en le tapotant avec l’extrémité tranchante d’une paire de ciseaux à dissectionner.
   2. Insérez une aiguille de 19 G sur une seringue de 5 ml dans le trou à un angle de 45°, en évitant d’endommager le sac vitellin, et aspirez 2 à 3 mL d’albumine de l’œuf pour abaisser l’embryon à l’intérieur de l’œuf. Scellez le trou avec une deuxième pièce (~1 cm x 0,5 cm) de ruban adhésif transparent.
   3. Placez un gros morceau (~5 cm x 5 cm) de ruban adhésif transparent sur le côté de l’œuf marqué au crayon et orienté vers le haut. Faites un trou dans la coquille d’œuf au milieu du ruban transparent en le tapotant avec l’extrémité tranchante d’une paire de ciseaux à dissection (figure 1A; Jour 3).
   4. À partir de ce trou, coupez une petite fenêtre circulaire dans la coquille d’œuf à l’aide de ciseaux à dissection incurvés. Regardez à travers cette fenêtre pour localiser l’embryon, puis agrandissez-la pour optimiser l’accès à l’embryon (Figure 1A; Jour 3).
   5. Enlevez tous les gros morceaux de coquille d’œuf qui pourraient être tombés sur le dessus de l’embryon à l’aide d’une pince. Retirez les plus petits morceaux en plaçant quelques gouttes de DPBS avec du calcium et du magnésium (DPBS+^/+) sur l’embryon avec une pipette de transfert en plastique, puis en aspirant le DPBS^+/+ avec la coquille d’œuf dans la pipette.
   6. Ajouter trois gouttes de DPBS^+/+ additionnées de pénicilline/streptomycine à 0,5 % dans l’œuf à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
   7. Scellez soigneusement la fenêtre avec un gros morceau (~5 cm x 5 cm) de ruban adhésif transparent avant de remettre l’œuf dans l’incubateur jusqu’au jour 4 de l’incubation, lorsque l’embryon est au stade 23-24 (HH 23-24)³².
      REMARQUE: Sceller la fenêtre est très important pour éviter la déshydratation et la mort de l’embryon.
   8. Vérifiez quotidiennement la viabilité des embryons en les regardant à travers la bande (ne retirez pas la bande pour éviter la déshydratation). Au cours de ces premiers jours d’incubation, la couleur du jaune d’œuf passe du jaune vif au jaune mat lors de la mort de l’embryon. Jetez les embryons décédés.
   9. Gardez le bassin d’eau dans l’incubateur rempli.

3. Transplantation intracélomique au jour 4 de l’incubation

1. Accéder à la cavité celomique
   1. Coupez le ruban de la fenêtre avec des ciseaux à dissection incurvés.
   2. Placez l’œuf sous un microscope à dissection sur un support en caoutchouc ou une boîte d’œufs.
   3. L’embryon de poulet est maintenant dans HH 23-24 et couché sur son côté gauche, avec son côté droit face au spectateur (Figure 1A; jour 4). Localisez l’aile droite et le bourgeon de la jambe de l’embryon, car le celom sera accessible entre ces deux bourgeons de membres. Dans la zone située entre l’aile droite et le bourgeon de la jambe, créez une ouverture consécutivement dans la membrane vitelline, le chorion et l’amnion, en les tenant avec deux paires de pinces disséquantes et en les tirant doucement dans des directions opposées.
      REMARQUE: La membrane vitelline est la première membrane rencontrée après l’ouverture de l’œuf et, dans certains cas, est déjà endommagée après avoir fait la fenêtre le jour 3. Si l’embryon est tourné, couché sur le côté droit avec son côté gauche face au spectateur (Figure 1A; Jour 4), il est nécessaire de le retourner pour permettre la transplantation. Pour ce faire, faites une grande ouverture dans la membrane vitelline et chorion, puis retournez soigneusement l’embryon à l’aide de forceps.
   4. Vérifiez s’il y a un accès dégagé à la cavité celomique : saisissez doucement le bord de la paroi du corps entre le bourgeon de l’aile et des membres à l’aide d’une paire de pinces disséquantes et tirez-le légèrement vers le spectateur. La cavité celomique doit être clairement visible. Insérez soigneusement un instrument émoussé mais mince (par exemple, un fil de tungstène émoussé dans un porte-microscalpel) dans la cavité célomique.
      REMARQUE: Si l’insertion de l’instrument contondant dans la cavité célomique n’est pas possible, cela signifie qu’une ou plusieurs des membranes n’ont pas été correctement ouvertes.
2. Transplantation
   1. Placez un demi-organoïde à l’intérieur de l’œuf sur le dessus de l’allantoïde en utilisant un dissecteur de dure-mère.
   2. À l’aide d’une pince disséquante, saisissez soigneusement le bord de la paroi du corps et tirez-le légèrement vers le spectateur pour rendre visible l’ouverture du celom.
      REMARQUE: Évitez d’endommager les vaisseaux sanguins dans la paroi du corps.
   3. Déplacez doucement l’organoïde vers et à travers l’ouverture dans la paroi du corps dans le celom avec un fil de tungstène émoussé dans un porte-microscalpel. Poussez légèrement l’organoïde crânienne pour le loger à l’intérieur du celom. Il est maintenant visible juste derrière le bourgeon alaire (Figure 1A; jour 4).
   4. Ajouter trois gouttes de DPBS^+/+ à l’œuf à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
   5. Scellez soigneusement la fenêtre avec un gros morceau (~5 cm x 5 cm) de ruban adhésif transparent avant de remettre l’œuf dans l’incubateur jusqu’au 12e jour d’incubation (8 jours après la transplantation).
   6. Continuez à vérifier quotidiennement la viabilité des embryons en les regardant à travers la bande (ne retirez pas la bande pour éviter la déshydratation). Jetez les embryons décédés.
      NOTE: Au fur et à mesure que les embryons et leurs membranes chorio-allantoïdiennes se développent, ils deviennent plus clairement visibles à travers la bande. Un manque de mouvement de l’embryon et des vaisseaux sanguins affaissés ou clairsemés sont un signe de mort embryonnaire.
   7. Vérifiez quotidiennement le bassin d’eau dans l’incubateur et gardez-le rempli.

4. Injection de lectine marquée par fluorescence

1. Préparation à l’injection
   1. Fabriquez des aiguilles de micro-injection de verre en tirant des microcapillaires en verre dans un extracteur de micropipette avec les réglages suivants: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Tout en regardant à travers le microscope à dissection, coupez soigneusement les pointes des aiguilles de micro-injection à l’aide de pinces à dissection pour créer une ouverture.
      REMARQUE: Les paramètres requis pour l’extracteur de micropipette peuvent différer selon la machine.
   2. Assemblez le système d’injection. Prenez deux morceaux de tube en silicone de 38 cm et reliez-les l’un à l’autre en plaçant un filtre de 0,2 μm entre eux. Insérez un embout buccal à l’extrémité du tube qui est connecté à la sortie du filtre (tube en silicone 1) et un connecteur à l’extrémité du tube qui est connecté à l’entrée du filtre (tube en silicone 2). Enfin, insérez l’aiguille de micro-injection dans le connecteur (Figure 1B).
   3. Diluer l’agglutinine culinaris (ACL) de lentille marquée par fluorescence avec DPBS-/- à une concentration de 2,5 mg ^mL-1 dans un tube de 0,5 mL et tourner vers le bas pendant ~30 s dans une microcentrifugeuse pour déplacer les agrégats vers le fond du tube.
   4. Pipeter 20 μL d’ACV sur un morceau de parafilm.
   5. Aspirer les 20 μL d’ACL du parafilm dans l’aiguille microcapillaire du système d’injection assemblé.
2. Injection
   1. Coupez le ruban de la fenêtre avec des ciseaux à dissection incurvés. Placez l’œuf sous un microscope à dissection dans un support en caoutchouc.
   2. Évaluer le système vasculaire et localiser les veines, qui se distinguent des artères par leur couleur rouge légèrement plus vive (Figure 1A; jour 12). Pour améliorer l’accès au système vasculaire, agrandissez soigneusement la fenêtre en coupant avec des ciseaux à dissection incurvés. Sélectionnez une veine injectable en fonction de l’accessibilité et de la taille.
   3. Insérez la pointe de l’aiguille microcapillaire dans la veine sélectionnée à un angle de 0°-20º. Assurez-vous que l’aiguille est dans la veine en déplaçant doucement l’embout d’un côté à l’autre. Souffler doucement et régulièrement dans le système d’injection pour injecter l’ACV (Figure 1A; jour 12).
      REMARQUE: Si l’aiguille dans la veine est dans la bonne position, elle doit rester dans les limites de la veine.
   4. Replacez l’œuf dans l’incubateur pendant 10 min pour laisser circuler l’ACV.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de sceller l’œuf avec du ruban adhésif pendant ce temps.

5. Collecte d’organoïdes transplantés au 12e jour d’incubation

1. Sacrifier l’embryon de poulet
   1. Placez l’œuf dans un support en caoutchouc sur le banc. Coupez le ruban de la fenêtre avec des ciseaux à dissection incurvés. Ensuite, coupez à travers les membranes entourant l’embryon avec des ciseaux à dissection incurvés.
      REMARQUE: Un microscope à dissection n’est pas nécessaire pour cette étape.
   2. Ramassez l’embryon de l’œuf avec une cuillère perforée et décapitaz immédiatement l’embryon à l’aide de ciseaux. Placez le corps de l’embryon dans une boîte de Petri au microscope à dissection.
2. Localisation et collecte d’organoïdes
   1. Placez l’embryon sur son dos dans la boîte de Petri et écartez ses membres.
   2. Ouvrez soigneusement la paroi abdominale de l’embryon le long de l’axe longitudinal à l’aide d’une pince.
   3. Localisez l’organoïde à l’intérieur de l’embryon. L’organoïde se fixe le plus souvent au lobe droit du foie, soit à l’extrémité caudale, soit crânien, juste en dessous de la cage thoracique (Figure 1A; jour 12). Il est donc recommandé de commencer par regarder dans ces endroits.
   4. Une fois l’organoïde localisé, retirez-le de l’embryon en le coupant autour avec des micro-ciseaux. Placez l’organoïde et le tissu de poulet qui y est inévitablement attaché dans une boîte de Petri sous le microscope à dissection. Enlevez autant de mouchoir en papier de poulet que possible avec une lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant.
   5. Traiter l’organoïde en fonction de l’analyse souhaitée.

6. Coloration par immunofluorescence à montage entier

1. Placer un organoïde transplanté dans une plaque de 24 puits et fixer dans 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant 24 h. Lavez 3x avec DPBS^-/-.
2. Perméabiliser et bloquer l’organoïde dans 300 μL de solution bloquante (0,3% Triton-X dans DPBS^-/- contenant 10% de sérum d’âne) pendant 2 h à température ambiante.
3. Préparer le mélange d’anticorps primaires : pour un organoïde, diluer les anticorps primaires NPHS1 (mouton-α-humain, dilution de 1:100), CD31 (souris-α-humain, dilution de 1:100) et LTL (conjugué à la biotine, dilution de 1:300) dans 300 μL de solution bloquante. Ajouter le mélange d’anticorps à l’organoïde et incuber pendant 72 h à 4 °C.
4. Lavez 3x avec 0,3% de TritonX dans DPBS^-/-.
5. Préparer le mélange d’anticorps secondaires : pour un organoïde, diluer les α anticorps secondaires Alexa Fluor 647 (dilution de 1:500), Alexa Fluor 488 (dilution de 1:500 α) et la streptavidine Alexa Fluor 405 (dilution de 1:200) dans 300 μL de solution bloquante. Ajouter le mélange d’anticorps secondaires à l’organoïde et incuber pendant 2 à 4 h à température ambiante. Couvrir de papier d’aluminium pour éviter l’exposition des anticorps secondaires à la lumière.
6. Lavez 3x avec DPBS^-/-.
7. Incorporer l’organoïde dans ~30 μL de support de montage dans un plat à fond en verre de 35 mm et laisser sécher pendant la nuit à température ambiante, recouvert de papier d’aluminium. Conserver à 4 °C.
8. Image à l’aide d’un microscope confocal.

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Résultats

La figure 1A résume la méthode et le calendrier de différenciation des CSPh en organoïdes rénaux, l’incubation d’œufs de poule fécondés, la transplantation d’organoïdes rénaux, l’injection d’ACL et la collecte des organoïdes. Il est important de coordonner le moment de la différenciation organoïde et de l’incubation des œufs de poule, en commençant la différenciation 15 jours avant l’incubation. Les actions des jours 0, 3, 4 et 12 de l’incubation sont illustr...

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Discussion

Dans ce manuscrit, un protocole pour la transplantation intracélomique d’organoïdes rénaux dérivés de l’hiPSC dans des embryons de poulet est démontré. Lors de la transplantation, les organoïdes sont vascularisés par des vaisseaux sanguins perfusés qui consistent en une combinaison de CE dérivées d’organoïdes humains et de poulets. Ceux-ci sont répartis dans tout l’organoïde et envahissent les structures glomérulaires, permettant l’interaction entre les CE et les podocytes. Il a été précédem...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2