PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE

Résumé

Le méthanol peut être utilisé comme milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme, ce qui est utile pour l’investigation des cellules ganglionnaires de la rétine.

Résumé

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui sont les neurones de projection de la rétine, propagent des informations visuelles externes au cerveau. Les changements pathologiques dans les RGC ont une relation étroite avec de nombreuses maladies dégénératives de la rétine. L’immunomarquage rétinien à montage entier est fréquemment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions développementales et pathologiques de la rétine. Dans certaines circonstances, certains échantillons précieux de rétine, tels que ceux provenant de souris transgéniques, peuvent devoir être conservés pendant une longue période sans affecter la morphologie ou le nombre de CGR. Pour des résultats expérimentaux crédibles et reproductibles, l’utilisation d’un milieu de conservation efficace est essentielle. Ici, nous décrivons l’effet du méthanol en tant que milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme. En bref, pendant le processus d’isolement, du méthanol froid (-20 °C) est pipeté à la surface de la rétine pour aider à fixer les tissus et faciliter leur perméabilité, puis les rétines peuvent être stockées dans du méthanol froid (-20 °C) avant d’être immunocolorées. Ce protocole décrit le flux de travail d’isolement de la rétine et le protocole de stockage des échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour l’étude des CGR.

Introduction

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont les seuls neurones de projection dans la rétine, et elles intègrent et transmettent des informations visuelles extérieures au cerveau¹. De nombreuses maladies neurodégénératives telles que le glaucome et la neuropathie optique traumatique sont caractérisées par des dommages irréversibles et la perte de^CGR2,3. L’analyse des changements morphologiques et quantitatifs des CGR est une étape cruciale pour déterminer comment les maladies neurodégénératives se développent et progressent ^4,5....

Protocole

Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les souris C57BL / 6J utilisées ont été obtenues auprès du Centre des animaux de laboratoire de l’Université de Wuhan, et toutes les expériences connexes ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Wuhan. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance des souris.

1. Énucléation et fixation des yeux

1. Euthanasier les souris avec une asphyxie au dioxyde de carbone et énucléer doucement le globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler édentée.
2. Rincer le globe o....

Discussion

La fixation est une étape essentielle pour préserver la rétine, ce qui peut avoir un impact sur les investigations ultérieures du RGC basées sur la morphologie. Une fixation réussie capture rapidement la structure et l’état des rétines au moment de les exposer au milieu de fixation, ce qui est essentiel pour une analyse plus approfondie. Bien que le formaldéhyde ait été considéré comme l’un des agents de fixation les plus courants pour la fixation et la conservation des tissus et des cellules, le formald.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools