Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

Résumé

Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.

Résumé

Ces dernières années, l’imagerie rétinienne in vivo , qui fournit des informations non invasives, en temps réel et longitudinales sur les systèmes et les processus biologiques, a été de plus en plus utilisée pour obtenir une évaluation objective des lésions neuronales dans les maladies oculaires. L’imagerie confocale ex vivo de la même rétine est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo , en particulier dans la recherche animale. Dans cette étude, nous avons démontré une méthode d’alignement d’une image confocale ex vivo de la rétine de souris avec ses images in vivo . Une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi appelée fibre de tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) a été appliquée pour acquérir des images in vivo de la rétine de souris. Nous avons ensuite réalisé l’imagerie confocale de la même rétine que le « gold standard » pour valider les images in vivo vis-OCTF. Cette étude permet non seulement d’approfondir l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires, mais aussi d’établir les bases d’une évaluation sensible et objective des lésions neuronales in vivo.

Introduction

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information visuelle, recevant des entrées synaptiques par l’intermédiaire de leurs arbres dendritiques dans la couche plexiforme interne (IPL) et transmettant l’information via leurs axones dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL) au cerveau 1,2,3,4. Dans les affections pathologiques telles que le glaucome, la dégénérescence précoce du CGR peut entraîner des changements subtils dans le RNFL, la couche de cellules ganglionnaires (GCL), l’IPL et le nerf optique chez les patients et les modèles de rongeurs 5,6,7,8,9. La détection précoce de ces changements morphologiques dans les CGR est donc essentielle pour une intervention rapide afin de prévenir les CGR et la perte de vision.

Nous avons récemment mis au point une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi, appelée tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCT), afin de répondre au besoin de surveillance in vivo des lésions du CGR. Vis-OCT a amélioré la résolution axiale, atteignant 1,3 μm dans la rétine^10,11, ce qui a permis de visualiser les faisceaux axonales RGC individuels dans le RNFL. Par la suite, la fibre vis-OCT (vis-OCTF) a été établie pour suivre et quantifier les dommages au CGR au niveau du faisceau axonale unique chez les souris^11,12,13. Cependant, l’imagerie confocale ex vivo de la même rétine que l’étalon-or est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo. Par conséquent, cette étude démontrera comment aligner les images in vivo acquises par vis-OCTF avec les images confococaux ex vivo de la même rétine de souris. Le protocole vise à valider les résultats in vivo par imagerie confocale ex vivo et à établir une base pour examiner les changements moléculaires et cellulaires sous-jacents aux dommages causés par le CGR dans des conditions pathologiques.

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Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie et sont conformes aux directives sur l’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé (NIH). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Imagerie in vivo vis-OCT

1. Le système vis-OCT
   1. Imaginez les yeux des souris à l’aide d’un système vis-OCT pour petits animaux qui utilise une source de lumière supercontinuum, qui fournit un éclairage en lumière visible entre 480 nm et 650 nm. Assurez-vous que la puissance incidente sur la cornée est de 1 mW et utilisez un débit de ligne A de 25 kHz et un temps d’intégration de 39,3 μs par ligne A.
   2. Assurez-vous que la plage de détection spectrale du spectromètre est comprise entre 508 nm et 613 nm, ce qui donne une résolution axiale de 1,3 μm dans la rétine. Le volume total d’imagerie est d’environ 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1 500 μm (z). La résolution latérale est comprise entre 4,5 μm au centre du champ de vision et 8,7 μm à 350 μm du centre^11,13.
2. Anesthésie de la souris
   1. Anesthésier les souris de fond C57BL/6 et des deux sexes avec une injection intrapéritonéale de kétamine (114 mg/kg) et de xylazine (17 mg/kg) et dilater leurs pupilles à l’aide de gouttes de tropicamide à 1 %. Confirmer l’anesthésie adéquate par perte du réflexe de la pédale après un pincement ferme des orteils.
   2. Pendant l’imagerie, gardez la souris au chaud à l’aide d’une lampe chauffante infrarouge. Après chaque acquisition d’image, appliquez des larmes artificielles pour prévenir la déshydratation de la cornée.
3. Positionnement de la souris pour l’imagerie
   1. Placez la souris anesthésiée sur le support animal et maintenez la souris en position à l’aide de deux bandes velcro.
      REMARQUE : Le support d’animal permet un mouvement en trois dimensions (réglage vertical, réglage horizontal fin, ainsi que des réglages de tangage et de lacet) pour placer le laser dans l’œil de la souris.
4. Réglage des paramètres d’imagerie
   1. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel référencé, qui allumera automatiquement le laser.
   2. Ajustez le support animal jusqu’à ce que le laser soit stable et centré dans l’œil de la souris. Visualisez la partie postérieure de l’œil à l’aide d’un aperçu En Face dans l’interface du logiciel, le champ de vision (FOV) du plexus vasculaire superficiel et un B-scan, la coupe transversale de la rétine dans le FOV.
   3. Acquérez un volume vis-OCT en cliquant sur le bouton Acquérir de l’interface logicielle après avoir effectué des réglages mineurs de la mise au point optique, qui se compose de 512 lignes A/B-scan et 512 B-scans/volume.
      REMARQUE : Ce processus prend ~10,5 s. L’acquisition d’images est guidée par un estimateur intégré de l’indice de qualité (QI) pour s’assurer que les images inférieures à un seuil prédéterminé (QI < 45) ne sont pas incluses.
      1. Pour chaque souris, acquérez quatre volumes vis-OCT du même œil. Alignez la tête du nerf optique (ONH) dans chacun des quatre coins du champ de vision pour couvrir différentes zones de la rétine.
         REMARQUE : Un tel placement minimise la courbure rétinienne, ce qui maximise la réflectance RNFL dans tout le champ de vision. Il faut ~1 min pour repositionner l’œil entre chaque acquisition (Figure 1A,B).
5. Analyse vis-OCTF
   REMARQUE : MATLAB est utilisé pour effectuer l’analyse d’images.
   1. Pour générer des fibergrammes vis-OCT à partir du volume vis-OCT, utilisez une méthode de seuil basée sur l’intensité (ligne de code MATLAB 808) pour détecter la surface de la rétine.
      REMARQUE : Ces lignes utilisent la fonction d’imréglage pour ajuster les valeurs d’intensité du bscan. L’argument [0.0087 0.08] passé à imadjust spécifie la plage d’intensités à mapper sur la plage dynamique complète de l’image de sortie.
   2. Recadrez le RNFL en sélectionnant les premiers ~16 μm de profondeur. Voir la ligne de code Matlab 782.
      REMARQUE : L’épaisseur typique du RNFL in vivo chez une souris C57BL/6 adulte de type sauvage est de ~14 μm et peut varier selon les différentes méthodes de segmentation¹³.
   3. Modifiez les chemins d’accès du fichier RAW (ligne 9), des fichiers à reconstruire (ligne 11) et du nom du fichier (ligne 15), cliquez sur Exécuter et attendez que l’image OCT soit analysée par le code MATLAB. Calculez la projection de l’intensité moyenne le long de la direction axiale (z) (lignes de code MATLAB 905-908) pour générer l’image de fibrogramme composée de faisceaux d’axones RGC et de la vascularisation environnante. Montez les quatre images après le traitement du fibrogramme pour chaque champ de vision en alignant les vaisseaux sanguins avec un éditeur graphique de votre choix, couvrant ~1,2 x 1,2 mm au total. Les fichiers RAW sont généralement enregistrés dans le dossier : Halo Data, sous la date de l’imagerie OCT (par exemple, 0606 Opticent).
      REMARQUE : les codes MATLAB sont disponibles dans le fichier supplémentaire 1.

2. Imagerie confocale ex vivo

1. Euthanasie de la souris
   1. Après avoir acquis les données vis-OCT, euthanasier les souris avec un mélange de pentobarbital sodique (390 mg/mL) et de phénytoïne sodique (50 mg/mL). La phénytoïne sodique agit en amplifiant les effets du pentobarbital sodique, qui a été largement utilisé dans l’euthanasie des rongeurs^14,15. Pour chaque souris, utiliser 0,2 mL/20 g du mélange dilué (156 mg/mL) et perfuser avec 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis 20 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans PBS^16,17.
2. Dissection et orientation de l’œil
   1. Énucléez les yeux et faites une marque sur le côté temporal pour indiquer l’orientation.
   2. Après avoir retiré soigneusement la chambre antérieure, le cristallin oculaire, le vitré et fixer les œilletons en PFA pendant 30 min.
   3. Lavez les œilletons avec du PBS pendant 30 min et remplacez la solution PBS 3 fois pendant le lavage. Ensuite, laver avec 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS (pH 7,5) pendant 30 min.
   4. Incuber les œilletons dans un tampon bloquant (5 % de sérum d’âne avec 2,5 % d’albumine sérique bovine et 0,5 % de Triton X-100 dans une solution saline tamponnée Tris [pH 7,5]) pendant 2 h à température ambiante.
3. Immunomarquage
   REMARQUE : Les œilletons sont maintenant prêts à être colorés avec les anticorps primaires de souris anti-Tuj1 pour détecter les faisceaux d’axones RGC et anti-ICAM-2 de rat pour détecter les vaisseaux sanguins.
   1. Incuber les œilletons pendant la nuit avec les anticorps primaires, anti-Tuj1 de souris (1 :200 dans le tampon de blocage) et anti-ICAM-2 de rat (1 :500 dans le tampon de blocage), à 4 °C.
   2. Lavez les œilletons 3 à 5 fois pendant 1 h à chaque fois, avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,5 % de Triton X-100 (PBST) pour minimiser le bruit de fond et éliminer tout anticorps non lié.
   3. Après le lavage, incuber les œilletons pendant la nuit avec les anticorps secondaires, l’immunoglobuline G anti-souris conjuguée au colorant Alexa Fluor 488 (fluorescence verte) et les IgG anti-rat âne conjuguées au colorant Alexa Fluor 594 (fluorescence rouge), le tout dilué 1 :1000 dans un tampon bloquant, à 4 °C.
   4. Le lendemain, lavez les œilletons 3 à 5 fois pendant 1 h chacun avec du PBST pour minimiser le bruit de fond et éliminer les anticorps non liés.
   5. Transférez les œilletons dans une boîte de Pétri de PBS avant le support plat.
4. Rétine montée à plat
   1. Après le processus d’immunomarquage, isolez les rétines des œilletons au microscope.
   2. Coupez les rétines en quatre feuilles et montez-les à plat avec la couche RGC vers le haut. Laissez la marque sur le côté temporal attaché à la rétine pour indiquer l’orientation.
   3. Glissez les rétines avec le support de montage^13,18. Sceller les lames avec le vernis à ongles^13,18,19.
5. Imagerie confocale
   REMARQUE : Le traitement d’images confocales a été effectué à l’aide du logiciel de microscopie ZEN.
   1. Allumez le microscope confocal et, sous le mode Localiser, recherchez la zone d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope.
   2. En mode d’acquisition, configurez des vignettes pour couvrir l’ensemble de la rétine et des tranches z-stack pour couvrir toutes les couches d’informations. Imagez au moins 25 tuiles sur l’ensemble de la rétine pour couvrir le volume total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) à une taille de pixel de 1,24 μm/pixel.
   3. Projetez les tranches de la pile Z pour créer des images de microscopie confocale bidimensionnelle en face (Figure 1C,D)11,13,19,20,21.

3. Alignement des images in vivo et ex vivo

1. Après avoir traité le fibrogramme, créez une image composite qui inclut les quatre images acquises à partir de chaque souris en alignant tous les vaisseaux sanguins avec l’éditeur graphique de votre choix.
   REMARQUE : En moyenne, l’image composite finale mesure environ 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), comme le montre la figure 1B.
2. Utilisez la tête du nerf optique (ONH) et le motif des vaisseaux sanguins comme points de repère pour aligner le fibrogramme composite. Obtenir l’alignement in vivo et ex vivo en superposant le motif des vaisseaux sanguins des images OCT composites avec les images confococaux de la même rétine colorée avec ICAM-2.

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Résultats

Le fibrogramme vis-OCT composite est comparé à l’image confocale correspondante d’une rétine montée à plat immunocolorée avec Tuj-1 pour les axones RGC (Figure 1D, panneau supérieur). Les faisceaux d’axones imagés par vis-OCTF peuvent être appariés avec les faisceaux d’axones marqués Tu-j1 sur l’image confocale. Les vaisseaux sanguins présentent généralement des structures ramifiées distinctes par rapport aux faisceaux axonaux environnants dans les images de fibrogra...

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Discussion

Il y a deux étapes dans ce protocole qui nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde et que ses yeux sont complètement dilatés avant l’imagerie vis-OCT. Si les souris ne sont pas correctement anesthésiées, leur respiration rapide peut entraîner des mouvements instables des images du visage , ce qui peut nuire à la qualité du fibrogramme. De plus, une dilatation insuffisante peut également avoir un impact néga...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg