Ex Vivo Imagerie multimodale basée sur l’OCT des yeux de donneurs humains pour la recherche sur la dégénérescence maculaire liée à l’âge

Résumé

Les tests de laboratoire peuvent tirer parti de la valeur pronostique de l’imagerie multimodale longitudinale de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) basée sur la tomographie longitudinale par cohérence optique (OCT). Les yeux des donneurs humains avec et sans DMLA sont imagés à l’aide de l’OCT, de la couleur, de l’ophtalmoscopie laser à balayage dans le proche infrarouge et de l’autofluorescence à deux longueurs d’onde d’excitation avant la section des tissus.

Résumé

Une séquence de progression pour la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) apprise à partir de l’imagerie clinique multimodale (MMI) basée sur la tomographie par cohérence optique (OCT) pourrait ajouter une valeur pronostique aux résultats de laboratoire. Dans ce travail, l’OCT ex vivo et le MMI ont été appliqués aux yeux de donneurs humains avant la section du tissu rétinien. Les yeux ont été récupérés sur des donneurs blancs non diabétiques âgés de ≥80 ans, avec un temps de décès à la préservation (DtoP) de ≤6 h. Les globes ont été récupérés sur place, marqués avec une tréphine de 18 mm pour faciliter l’élimination de la cornée, et immergés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4%. Les images du fond d’œil couleur ont été acquises après le retrait du segment antérieur avec une lunette de dissection et un appareil photo reflex utilisant un éclairage trans, épi- et flash à trois grossissements. Les globes ont été placés dans un tampon dans une chambre conçue sur mesure avec une lentille de 60 dioptries. Ils ont été imagés avec le domaine spectral OCT (cube de macula de 30°, espacement de 30 μm, moyenne = 25), la réflectance dans le proche infrarouge, l’autofluorescence de 488 nm et l’autofluorescence de 787 nm. Les yeux de la DMLA ont montré un changement dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), avec des dépôts drusen ou drusenoïdes sous-rétiniens (SDD), avec ou sans néovascularisation, et sans preuve d’autres causes. Entre juin 2016 et septembre 2017, 94 yeux droits et 90 yeux gauches ont été récupérés (DtoP : 3,9 ± 1,0 h). Sur les 184 yeux, 40,2 % avaient une DMLA, y compris une DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %) et néovasculaire (9,8 %), et 39,7 % avaient des macules banales. Drusen, SDD, foyers hyperréfléchissants, atrophie et cicatrices fibrovasculaires ont été identifiés à l’aide de l’OCT. Les artefacts comprenaient une opacification des tissus, des décollements (bacillaires, rétiniens, EPR, choroïdiens), un changement kystique fovéal, un EPR ondulant et des dommages mécaniques. Pour guider la cryosection, des volumes OCT ont été utilisés pour trouver les repères de la fovéa et de la tête du nerf optique et des pathologies spécifiques. Les volumes ex vivo ont été enregistrés avec les volumes in vivo en sélectionnant la fonction de référence pour le suivi oculaire. La visibilité ex vivo de la pathologie observée in vivo dépend de la qualité de conservation. En 16 mois, 75 yeux de donneurs DtoP rapides à tous les stades de la DMLA ont été récupérés et stadifiés à l’aide de méthodes cliniques MMI.

Introduction

Quinze années de prise en charge de la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l’âge (DMLA) avec un traitement anti-VEGF sous la direction de la tomographie par cohérence optique (OCT) ont offert de nouvelles perspectives sur la séquence de progression et la microarchitecture de cette cause répandue de perte de vision. Une reconnaissance clé est que la DMLA est une maladie tridimensionnelle impliquant la rétine neurosensorielle, l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la choroïde. Grâce à l’imagerie OCT des patients de l’essai et des yeux des patients traités en clinique, les caractéristiques de la pathologie au-delà de celles observées par la photographie couleur du fond d’œil, une norme clinique depuis des décennies, sont maintenant reconnues. Il s’agit notamment de la néovascularisation intrarétinienne (néovascularisation maculaire de type 3 1, anciennement prolifération angiomateuse), des dépôts druzenoïdes sous-rétiniens (SDD, également appelés pseudodruzen réticulaires)², des voies multiples du destin RPE^3,4 et des cellules^de Müller intensément gliotiques dans l’atrophie ^5,6.

Les systèmes modèles dépourvus de maculas (cellules et animaux) recréent quelques tranches de cette maladie complexe ^7,8,9. Un autre succès dans l’amélioration du fardeau de la DMLA pourrait provenir de la découverte et de l’exploration de la pathologie primaire dans les yeux humains, de la compréhension de la composition cellulaire unique de la macula, suivie de la traduction en systèmes modèles. Ce rapport décrit une collaboration de trois décennies entre un laboratoire de recherche universitaire et une banque d’yeux. Les objectifs des méthodes de caractérisation tissulaire décrites ici sont doubles : 1) éclairer l’évolution de la technologie diagnostique en démontrant la base de l’apparence du fond d’œil et des sources de signaux d’imagerie par microscopie, et 2) classer les échantillons de DMLA pour des techniques de découverte moléculaire ciblées (immunohistochimie) et non ciblées (spectrométrie de masse d’imagerie, IMS et transcriptomique spatiale) qui préservent la fovéa conique et la para- et périfovéa riches en bâtonnets. De telles études pourraient accélérer la traduction en OCT clinique, pour laquelle une séquence de progression et un suivi longitudinal sont possibles grâce au suivi oculaire. Cette technologie, conçue pour surveiller les effets du traitement, enregistre les scans d’une visite clinique à l’autre à l’aide de vaisseaux rétiniens. L’établissement d’un lien entre la TCO suivie oculaire et les résultats de laboratoire obtenus à l’aide de techniques destructrices pourrait fournir un nouveau niveau de valeur pronostique aux résultats moléculaires.

En 1993, le laboratoire de recherche a capturé des photographies couleur de fond d’œil post-mortem sur film¹⁰. Cet effort a été inspiré par la superbe photomicroscopie et histologie de la rétine périphérique humaine par Foos et ses collègues 11,12,13 et les corrélations clinicopathologiques étendues de la DMLA par Sarks et ^al.14,15. À partir de 2009, l’imagerie multimodale ex vivo (MMI) ancrée sur le domaine spectral OCT a été adoptée. Cette transition a été inspirée par les efforts similaires d’autres 16,17 et surtout par la prise de conscience qu’une grande partie de l’ultrastructure décrite par les Sercs était disponible en trois dimensions, au fil du temps, dans la clinique ^18,19. L’objectif était d’acquérir des yeux avec des maculas attachées dans un délai raisonnable pour des études bien puissantes des phénotypes au niveau cellulaire dans la rétine, l’EPR et la choroïde. L’intention était d’aller au-delà des statistiques « par œil » pour aller au-delà des statistiques « par type de lésion », une norme influencée par les concepts de « plaque vulnérable » des maladies cardiovasculaires^20,21.

Le protocole présenté dans le présent rapport reflète l’expérience acquise avec près de 400 paires d’yeux de donneurs acquises dans plusieurs flux. En 2011-2014, le site Web du projet MACULA sur l’histopathologie de la DMLA a été créé, qui comprend des épaisseurs de couche et des annotations provenant de 142 spécimens archivés. Ces yeux ont été conservés de 1996 à 2012 dans un fixateur glutaraldéhyde-paraformaldéhyde pour l’histologie époxy-résine haute résolution et la microscopie électronique. Tous les fundi avaient été photographiés en couleur lors de leur réception et ont été réimagés par OCT juste avant l’histologie. Un porte-œil conçu à l’origine pour les études du nerf optique²² a été utilisé pour accueillir un poinçon tissulaire de 8 mm de diamètre sur toute l’épaisseur centré sur la fovéa. Des scans OCT B à travers le centre fovéal et un site supérieur de 2 mm, correspondant à l’histologie aux mêmes niveaux, ont été téléchargés sur le site Web, ainsi qu’une photographie du fond d’œil en couleur. Le choix des plans OCT a été dicté par l’importance de la pathologie AMD sous la fovéa²³ et l’importance des SDD dans les zones riches en bâtonnets supérieures à la fovéa^24,25.

À partir de 2013, les yeux imagés avec un MMI ancré dans les OCT pendant la vie étaient disponibles pour des corrélations clinicopathologiques directes. La plupart (7 donneurs sur 10) impliquaient des patients dans une pratique de référence de la rétine (auteur: K.B.F.), qui offrait un registre de directives avancées pour les patients intéressés à donner leurs yeux après leur décès à des fins de recherche. Les yeux ont été récupérés et préservés par la banque d’yeux locale, transférés au laboratoire et préparés de la même manière que les yeux du projet MACULA. Les volumes cliniques d’OCT pré-mortem ont été lus de manière transparente en laboratoire, alignant ainsi les caractéristiques pathologiques observées au cours de la vie avec les caractéristiques observées au microscope²⁶.

À partir de 2014, le prélèvement prospectif sur les yeux a commencé par le dépistage de la DMLA dans les yeux de donneurs sans antécédents cliniques, mais conservés pendant un délai défini (6 h). À cette fin, le porte-œil a été modifié pour accueillir un globe entier. Cela réduisait le risque de détachement autour des bords coupés du poinçon de 8 mm précédemment utilisé. Les yeux ont été conservés dans du paraformaldéhyde tamponné à 4% pour l’immunohistochimie et transférés à 1% le lendemain pour un stockage à long terme. En 2016-2017 (avant la pandémie), 184 yeux de 90 donneurs ont été récupérés. Les statistiques et les images de ce rapport sont générées à partir de cette série. Pendant la période pandémique (confinements de 2020 et conséquences), les collectes potentielles pour la transcriptomique et les collaborations IMS se sont poursuivies à un rythme réduit, utilisant essentiellement les méthodes de 2014.

D’autres méthodes d’évaluation oculaire du donneur sont disponibles. Le Minnesota Grading System (MGS)^27,28 est basé sur le système clinique AREDS pour la photographie couleur^{du fond d’œil 29}. Les limites de cette méthode comprennent la combinaison de la DMLA atrophique et néovasculaire en un seul stade de « DMLA tardive ». De plus, le MGS implique l’ablation de la rétine neurosensorielle avant la photo-documentation de la choroïde RPE. Cette étape déloge les SDD à des degrés ^divers30,31 et supprime la correspondance spatiale de la rétine externe et de son système de support. Ainsi, les efforts visant à lier la demande métabolique et la signalisation de la rétine à la pathologie de l’EPR-choroïde peuvent être entravés. Le système de l’Utah a mis en œuvre le MMI en utilisant la photographie couleur ex vivo et l’OCT pour catégoriser les yeux destinés à la dissection en régions pour les extractions d’ARN et de protéines³². Bien que préférable aux extractions d’œillets entiers, la zone de 3 mm de diamètre présentant le risque le plus élevé de progression de la DMLA^33,34 ne représente que 25% d’un poinçon centré sur la fovéa de 6 mm de diamètre. Ainsi, les techniques qui permettent de localiser les résultats en référence à la fovéa, telles que la coupe en série pour l’immunohistochimie, sont avantageuses.

Protocole

Le comité d’examen institutionnel de l’Université de l’Alabama à Birmingham a approuvé les études de laboratoire, qui ont adhéré aux bonnes pratiques de laboratoire et au niveau de biosécurité 2/2+. Toutes les banques ophtalmologiques américaines sont conformes à la loi de 2006 sur les cadeaux anatomiques uniformes et à la Food and Drug Administration des États-Unis. La plupart des banques ophtalmologiques américaines, y compris Advancing Sight Network, sont conformes aux normes médicales de l’Eye Bank Association of America.

Le tableau des matériaux énumère les fournitures et l’équipement. Le matériel supplémentaire 1 donne un aperçu de la dissection, de la photographie du fond d’œil en couleur et du MMI basé sur l’OCT. Le matériel supplémentaire 2 fournit des détails sur l’IMM basé sur l’OCT.

1. Critères de prélèvement de tissus

1. Pour maximiser le rendement des yeux de DMLA dans un dépistage de donneurs sans papiers, définissez les critères suivants pour les donneurs acceptables : âge ≥80 ans, blanc, non diabétique et décès à ≤6 h jusqu’à la préservation (DtoP).
   REMARQUE : Le DtoP est défini comme le temps écoulé entre le décès et le moment où l’œil est placé dans un agent de conservation fourni, soit à l’hôpital, soit en laboratoire.

2. Milieu de conservation et autre préparation (laboratoire)

1. Faire 4% de paraformaldéhyde tamponné au phosphate à partir de 20% de stock (acheté). Préparer 1 L en ajoutant 200 mL de paraformaldéhyde à 20 % (facteur de dilution de 5) à 800 mL de tampon phosphate de Sorenson 0,1 M. Testez et ajustez pour vous assurer que le pH est de 7,2, si nécessaire. Conserver à 4 °C.
2. Distribuer 30 mL de paraformaldéhyde tamponné au phosphate à 4 % dans des bocaux de 40 mL.
3. Stockez des contenants étiquetés de 40 ml d’agent de conservation à la banque oculaire afin que le tissu puisse être récupéré à tout moment et n’importe quel jour.
4. Pour le stockage des yeux préservés, faire du paraformaldéhyde à 1% à partir de la solution à 4%. Préparer 1 L en ajoutant 250 mL de paraformaldéhyde à 4 % (facteur de dilution de 4) à 750 mL de tampon phosphate de Sorenson 0,1 M. Testez et ajustez le pH si nécessaire. Conserver à 4 °C.
   1. Préparer 1 L d’une solution de 0,1 M à partir de la solution 0,2 M du tampon phosphate de Sorenson, pH 7,2, en combinant 500 mL d’eau distillée et 500 mL de tampon de Sorenson.
   2. Ajuster le pH goutte par goutte en utilisant 1 N d’acide chlorhydrique ou 1 N d’hydroxyde de sodium. Conserver à 4 °C.
5. Créez un support pour stabiliser les yeux pendant la dissection. Remplissez une boîte de Petri avec de la cire dentaire chauffée jusqu’à ce qu’elle soit liquide. Quand il fait légèrement froid, faites-y une impression hémisphérique avec un grand roulement à billes, puis congelez le plat pour faciliter le retrait du roulement à billes.

3. Méthodes de banque d’yeux

1. Pour assurer la récupération rapide des tissus de recherche, récupérez rapidement tous les tissus, y compris ceux destinés à la transplantation.
2. Recevoir les références de décès, comme l’exige la loi, dans les 1 heure suivant le décès, et suivre chaque donneur avec un numéro de séquence de référence qui suit le tissu.
3. Pour trouver des cas avec une documentation clinique potentielle, posez des questions spécifiques à la DMLA et aux maladies oculaires dans l’entrevue d’évaluation des risques du donneur de recherche.
4. Pour minimiser le temps de déplacement, récupérez des globes entiers (par opposition aux cornées pour la transplantation) dans une zone compacte (c.-à-d. ville et comté suburbain adjacent).
5. Apportez deux pots d’agent de conservation (tamponné à 4 % de paraformaldéhyde) dans la chambre d’hôpital du défunt pour le prélèvement de tissus (au lieu d’attendre que le corps soit transporté à la morgue).
6. Avant et pendant le rétablissement, communiquez avec les enquêteurs pour confirmer la livraison et le moment.
7. Récupérez les globes sur place dans l’hôpital, ouvrez-les par des méthodes de manipulation cohérentes et immergez l’œil ouvert dans un agent de conservation (Figure 1).
   1. Maintenez l’œil du donneur excisé en place à l’aide d’une gaine de gaze stabilisée par un hémostatique.
   2. Pour faciliter l’enlèvement de la cornée avec un bord de sclérotique de 2 mm de large, utilisez un tréphine de 18 mm de diamètre pour marquer le globe.
   3. Pour libérer la cornée avec un bord de sclérotique d’accompagnement, coupez le long du cercle marqué à l’aide de ciseaux à ressort avec des pointes incurvées tout en stabilisant le globe avec la gaze coupée par hémostatique.
   4. Soulevez la cornée de la sclérotique, exposant l’iris et le corps ciliaire.
   5. Pour faciliter la pénétration du conservateur dans la chambre vitrée, faire une fente de 2 mm de long dans l’iris perpendiculaire au bord pupillaire. Placer les yeux dans des bocaux d’échantillons contenant 30 ml d’agent de conservation à 4 °C et transférer au laboratoire sur de la glace humide.
8. Transmettre électroniquement les renseignements anonymisés sur les donneurs de la banque d’yeux à la base de données du laboratoire de recherche.
   REMARQUE : La base de données conserve le numéro de référence, le numéro de tissu de la banque oculaire et le numéro d’identification du laboratoire pour le suivi, ainsi que d’autres informations pertinentes.

4. Préparation des tissus pour la photographie couleur du fond d’œil ex vivo

1. Utilisez deux stéréomicroscopes, un pour la dissection et un pour la photographie couleur du fond d’œil.
   REMARQUE: Pour que la transillumination visualise les changements pigmentaires, utilisez une base pour la microscopie à fond noir.
2. Retirez les restes du segment antérieur (iris et lentille). Pour stabiliser l’œil pendant la dissection, placez-le dans la boîte de Petri remplie de cire (matériel supplémentaire 1, diapositives 7-8). Pour empêcher le corps ciliaire et la rétine attachée de s’effondrer dans la cavité vitrée, minimisez la perturbation de l’anneau vitré épais attaché au corps ciliaire (base vitrée).
3. Marquez le pôle supérieur pour l’orientation. Placez le globe face antérieure vers le bas dans le plat. Trouvez les tendons d’insertion des muscles droits supérieurs et obliques supérieurs. À l’aide d’un applicateur en bois, appliquer avec parcimonie une encre de marquage dans une ligne de 10 mm dans une direction antérieure à postérieure (c.-à-d. perpendiculaire à l’insertion tendineuse du muscle droit supérieur).
4. Avant la photographie, remplissez le fond d’œil avec le tampon phosphate froid de Sorensen.
5. Insérez une perle de rubis de 1 mm dans le fond d’œil comme une barre d’échelle interne pour apparaître dans chaque image²⁷.
6. Obtenez des images couleur avec une caméra reflex à objectif unique montée sur un stéréomicroscope équipé d’un flash annulaire. Utilisez l’éclairage trans, épi- et flash à chacun des trois grossissements standard pour capturer des images destinées à mettre en évidence des zones spécifiques (matériel supplémentaire 1, diapositive 11) : 1) le fond d’œil à l’équateur, 2) le pôle postérieur (arcades vasculaires, tête du nerf optique, fovéa) et 3) la fovéa dans la macula lutea (tache jaune).

5. Préparation à la photographie couleur du fond d’œil ex vivo

1. Allumez l’appareil photo et le moniteur. Branchez l’obturateur de la télécommande et relâchez l’actionneur dans le câble d’affichage de l’interface multimédia haute définition (HDMI), de la caméra/télévision (TV).
2. Réglez les paramètres de l’appareil photo sur la fonction ISO manuelle et la position de verrouillage du miroir (verrouillée en place pour réduire les vibrations).
   REMARQUE: Reportez-vous au manuel d’utilisation du fabricant pour les paramètres de l’appareil photo utilisé. Apprenez à partir de l’appareil photo affichez les paramètres de surexposition / sous-exposition par rapport à l’histogramme et aux lectures d’exposition.
3. Disposer deux sources lumineuses, chacune avec deux guides de lumière flexibles positionnés perpendiculairement l’un à l’autre, pour l’éclairage dans les quatre directions cardinales sur la platine du microscope (Matériel supplémentaire 1, page 10).
4. Allumez les sources lumineuses epi-illumination à pleine puissance.
   REMARQUE: Il est utile mais pas nécessaire d’avoir un linceul de feutre noir autour de la scène pour limiter la diffusion de la lumière / flash pour le photographe.
5. Au microscope à dissection, utilisez une pince pour insérer le pôle postérieur dans un creuset de quartz de 30 ml rempli de tampon. Laissez le tissu couler au fond. Insérez un renfort, comme une éponge tissulaire, entre l’œil et la paroi du creuset pour empêcher tout mouvement. Insérez la perle rubis de 1 mm dans le pôle postérieur.
   REMARQUE: Le cordon peut tomber dans la coupelle du nerf optique.
6. Placez soigneusement le globe dans le creuset sur la scène du stéréomicroscope et observez le fond d’œil intérieur à travers les oculaires du microscope. À l’aide du grossissement le plus bas, orienter l’œil en identifiant la marque tissulaire à la position 12 heures, la tête du nerf optique (ONH) et la fovéa à 5° sous l’ONH. Faire pivoter l’œil de manière à ce que la fovéa tombe de 5° en dessous d’une ligne traversant l’ONH.
   REMARQUE: S’il s’agit d’un œil droit, l’ONH est à droite de la fovéa, comme on le voit à travers les oculaires du microscope. S’il s’agit d’un œil gauche, l’ONH est à gauche de la fovéa.
7. Activez l’affichage du moniteur distant à partir de l’appareil photo. Assurez-vous que le curseur du séparateur de faisceau du microscope est réglé pour observer à travers le port photo et non à travers le port pour les oculaires. Selon la trajectoire de la lumière et du miroir, préparez-vous à faire pivoter le tissu de 180° sur la scène pour une orientation correcte.

6. Acquisition d’images à l’aide de la photographie de fond d’œil couleur ex vivo

1. Lorsque l’épi-illumination est activée, réglez le grossissement de manière à ce que l’ensemble de l’incision en tréphine de 18 mm occupe tout le champ de vision. Augmentez le grossissement afin qu’il soit possible de se concentrer sur le fond de la fosse fovéale. Réduisez l’agrandissement au réglage précédent.
2. Ajustez les paramètres ISO dans la plage de 1 600 à 3 000 afin que les temps d’exposition se situent dans la plage centrale du compteur de l’appareil photo.
3. Appuyez sur la gâchette de l’obturateur à distance. Écoutez le miroir se verrouiller en position haute. Appuyez à nouveau sur la gâchette pour l’exposition.
4. Observez l’image sur le moniteur, avec les métadonnées prédéfinies affichant le rouge, le vert, le bleu (RVB) et un histogramme de couleur pour une exposition correcte. Si l’exposition est acceptable, procéder; Si ce n’est pas le cas, supprimez, réévaluez les paramètres et réimagez.
5. Éteignez les lampes à col de cygne pour l’epi-illumination pour mettre en évidence les drusen et allumez le flash, avec une exposition de 1/4 s, une vitesse d’obturation de l’appareil photo de 1/250 s et une sensibilité ISO de 100-320. Réglez la vitesse du flash sur la valeur par défaut ou modifiez-la lors de la configuration initiale de l’appareil photo. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
6. Éteignez le flash et allumez la source lumineuse trans-éclairage. Réinitialisez l’ISO à plus de 5 000 et assurez-vous que le temps d’exposition ne descend pas en dessous de 1/30 s en raison de vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
7. Augmentez le grossissement pour visualiser à la fois l’ONH et la fovéa dans le champ de vision. Allumez les lampes d’epi-illumination. Définissez la plage ISO sur 1 600-3 000. Assurez-vous que les temps d’exposition se situent dans la plage centrale de l’appareil photo.
8. Éteignez les lampes epi-illumination et allumez le flash, avec une exposition de 1/4 s, la vitesse d’obturation préréglée de l’appareil photo sur 1/250 s et l’ISO réglée sur 400-800. Acquérir une image et vérifier l’histogramme pour une exposition correcte.
9. Éteignez le flash et activez la trans-illumination à l’aide de la base en fond noir. Réinitialisez l’ISO à plus de 5 000. Assurez-vous que le temps d’exposition n’est pas plus lent que 1/30 s en raison des vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image et vérifier un histogramme approprié.
10. Éteignez la transillumination et rallumez les lampes d’epi-illumination.
11. Augmentez le grossissement à celui utilisé à l’étape 6.7. Recentrez-vous si nécessaire.
12. Augmentez l’ISO dans la plage de 3 000 à 6 000 et ajustez le temps d’exposition pour qu’il se situe dans la plage d’exposition appropriée de l’appareil photo. Acquérir une image.
    REMARQUE: La perle de rubis peut ne plus apparaître dans le champ de vision. Si c’est le cas, capturez des images séparées de la perle à ce grossissement pour référence.
13. Éteignez les lampes d’épi-illumination. Allumez le flash avec une exposition de 1/4 s et avec la vitesse d’obturation de l’appareil photo à 1/250 s. Réglez la vitesse du flash sur la vitesse par défaut, ou modifiez-la lors de la configuration initiale de l’appareil photo, et réglez l’ISO sur 500-1 000. Acquérir l’image. Vérifiez l’histogramme pour une exposition appropriée.
14. Éteignez le flash et allumez les lampes à trans-éclairage. Réinitialisez l’ISO au-dessus de 8 000 pour permettre un temps d’exposition plus rapide avec un capteur d’image plus sensible. Assurez-vous que le temps d’exposition ne descend pas en dessous de 1/30 s en raison de vibrations potentielles dans le système photographique. Acquérir une image.
15. Exportez les images de l’appareil photo vers un ordinateur. Examinez les images avant de retirer l’échantillon de l’étape du microscope au cas où il faudrait en capturer à nouveau.

7. Vue d’ensemble de l’acquisition d’images pour la TCO ex vivo et l’ophtalmoscopie au laser à balayage (SLO)

1. Pour le domaine spectral OCT, placer les globes dans un tampon phosphate dans un porte-œil personnalisé avec une chambre avec une lentille dioptrique^{60 35}. Fixez le porte-œil à un support sur un appareil d’imagerie OCT clinique et fixez-le à l’endroit où un patient reposerait son front. Le périphérique OPO insère automatiquement une barre d’échelle dans chaque image.
2. En même temps, à l’aide du même appareil et avec l’œil toujours dans le support, imagez les globes avec un ophtalmoscope laser à balayage (SLO) en utilisant la réflectance proche infrarouge (NIR, utilisée comme image de localisation par le logiciel à demeure), l’autofluorescence du fond d’excitation (FAF) de 488 nm et la réflectance sans rouge (RF).
   REMARQUE: Le FAF d’excitation de 787 nm dans cet appareil ne convient qu’occasionnellement car un séparateur de faisceau réduit la transmission de la lumière au SLO. Pour cette raison, un deuxième appareil pour les images FAF 787 nm (voir point suivant) est utilisé.
3. Séparément, mais avec l’œil toujours dans le porte-œil, imagez les globes avec 787 nm FAF pour détecter la perturbation RPE³⁶ à l’aide d’un dispositif séparé qui affiche bien cette modalité.

8. Protocole d’acquisition d’images pour les OCM/SLO ex vivo (voir les diapositives dans le matériel supplémentaire 2)

1. Indiquer le muscle droit supérieur avec un colorant de marquage tissulaire. Allumez le laser (flèche bleue, matériel supplémentaire 2, page 1).
2. En se référant à la page 2 du matériel supplémentaire 2, positionnez la tête OCT en déplaçant l’ensemble de l’unité sur deux axes par rapport à la base (flèche verte), puis en augmentant la hauteur (y) en tournant le joystick dans le sens horaire / antihoraire (cw / ccw, flèches bleues). Focalisez l’image en tournant le bouton (flèche orange), avec le levier noir en position R (*). Verrouillez l’appareil en fixant la vis du pouce (flèche violette).
3. Insérez l’œil dans le support et stabilisez-le à partir de la face postérieure avec des entretoises (Matériel supplémentaire 1, page 13). Exercez le moins de pression possible pour éviter de bosseler la sclérotique. Orientez avec la marque tissulaire pour le muscle droit supérieur tournée vers le haut.
   REMARQUE: La distance approximative entre l’avant du porte-œil et le dispositif OCT est de 25 mm.
4. Ouvrez le logiciel de visualisation et d’analyse propriétaire pour l’appareil OCT. Une liste de patients apparaîtra dans la colonne de gauche. Les donneurs oculaires indexés par un numéro de code interne sont les « patients ». Reportez-vous au manuel d’utilisation du fabricant.
5. Sélectionnez l’icône Nouveau patient . Complétez les informations sur les données du patient au besoin. Sélectionnez OK. Utilisez un système de numérotation ordonné logiquement pour les yeux individuels, tel que YYYYNNNL,R_agesex. Par exemple, cela pourrait être 2017016R_97F.
6. Après avoir poursuivi la saisie des données dans la fenêtre suivante, appuyez sur OK. Sélectionnez l’opérateur et étudiez dans le menu déroulant.
   REMARQUE : Les informations saisies apparaîtront dans les métadonnées exportables.
7. Après avoir visualisé un écran vide, appuyez sur le bouton jaune pour lancer l’acquisition de l’image.
8. Appuyez sur IR + OCT (réflectance proche infrarouge + OCT). Laissez le laser acquérir une image SLO en direct du fond d’œil et OCT B-scan.
   1. Finalisez la position anatomique correcte en fonction de l’ONH et de la fovéa, et utilisez un applicateur en bois pour ajuster la position des yeux dans le support. Sur le panneau de commande, faites pivoter le bouton rond noir pour régler l’intensité.
   2. Appuyez sur le même bouton pour faire la moyenne de 9 à 100 images (flèches rouges; 9 suffisent, 100 semble crémeux). Si l’appareil est orienté correctement, le fond d’œil doit être mis au point et le balayage B de l’OCT doit apparaître dans le tiers supérieur de l’écran (matériel supplémentaire 2, page 9, double flèche rouge).
   3. Sur l’image du fond d’œil, utilisez le curseur pour déplacer la ligne bleue afin de centrer la fovéa (Matériel supplémentaire 2, page 9, flèche blanche). Appuyez sur Acquérir.
      REMARQUE: Les autres boutons par défaut sont Retina, EDI (désactivé) et Line Scan.
9. Appuyez sur RF + OCT pour la prochaine acquisition. Vérifiez à nouveau la position pour vous assurer que l’image n’a pas bougé ou dégradé. Appuyez sur le bouton noir pour la moyenne. Appuyez sur Acquérir.
10. Basculer le cube interne pour l’imagerie par autofluorescence aux longueurs d’onde d’excitation de 488 nm et 787 nm (Supplementary Material 2, page 10).
    REMARQUE: La position du cube après le commutateur est affichée.
11. Sélectionnez le mode Autofluorescence . Vérifiez à nouveau l’alignement. Appuyez sur Acquérir.
12. Pour les cas suspects de perturbation et d’atrophie de l’EPR, sélectionnez ICGA (angiographie au vert d’indocyanine) pour l’autofluorescence à 787 nm. Vérifiez à nouveau la position des yeux, puis appuyez sur Acquérir.
    Remarque : Une image du fond d’œil n’apparaît souvent pas dans cette modalité car le cube interne atténue le faisceau.
13. Remettez le cube interne en R pour l’IR et l’imagerie sans rouge pour l’acquisition de volume.
    REMARQUE : La position du cube après le commutateur est indiquée à la page 13 du Matériel supplémentaire 2.
14. Pour acquérir les volumes de l’OPO, sélectionnez IR et le paramètre de volume. Faites correspondre tous les paramètres de la page 14 du matériel supplémentaire 2 en basculant les boutons appropriés sur le module de commande (cube de macula à 30°, espacement de 30 μm, moyenne en fonction des exigences expérimentales).
15. Notez que la vue du fond d’œil de réflectance dans le proche infrarouge est recouverte de lignes bleues B-scan. Vérifiez à nouveau la position de l’OPO dans le tiers supérieur de la fenêtre de droite. Appuyez sur Acquérir sur le module de contrôle et attendez 5 minutes que l’analyse du volume soit terminée. Une fois l’acquisition de l’image terminée, sélectionnez EXIT. Les images seront sauvegardées (flèche rouge).
    Remarque : Les lignes bleues délimitent les distances indiquées dans la vue précédente en micromètres. Les scans commencent la numérotation à partir du bas (inférieur) et se poursuivent vers le haut. Notez la progression de la ligne rouge.
16. Laissez l’ordinateur traiter les images acquises, qui apparaîtront à l’écran (Matériel supplémentaire 2, page 16).
17. Lorsque vous imagez les autres yeux d’un donneur, ne modifiez pas la position du support de montage entre les yeux. Si l’œil gauche est imagé en premier, les résultats apparaîtront dans la colonne OD (œil droit). Cliquez avec le bouton droit pour sélectionner toutes les images, puis sélectionnez Exchange OS/OD. Les images seront déplacées vers la colonne du système d’exploitation.
18. Appuyez sur Select > Window > Database. L’écran affiche par défaut le panneau 6 avec l’ajout de l’œil du donneur illustré dans la colonne de droite (matériel supplémentaire 2, page 18). Cliquez avec le bouton droit sur le patient dans le menu déroulant, choisissez Lot et exportez le fichier E2E.
19. Accédez au dossier prédéterminé créé sur le bureau pour les transferts de fichiers. Sélectionnez OK. Le dossier contient les fichiers E2E à copier sur un disque dur externe et à archiver.
20. Apportez l’œil dans son support à l’ophtalmoscope laser à balayage, qui est principalement utilisé pour l’autofluorescence de 787 nm.
    REMARQUE: reportez-vous au guide d’utilisation du fabricant pour l’acquisition et l’archivage des images.
21. Allumez l’ordinateur et le laser.
22. Sélectionnez l’icône Nouveau patient . Complétez les données du patient au besoin.
23. Pour conserver la même fiche technique pour les yeux, appuyez sur OK. Comme la courbe en C reste la même, appuyez sur Continuer.
24. Sélectionnez Mode étude et entrez le mot de passe si nécessaire. Maintenez la courbe en C à 7,7 mm. Appuyez sur OK.
25. Sélectionnez Continuer pour vérifier la courbe C. Sélectionnez l’indicateur jaune pour démarrer l’appareil photo.
26. Sélectionnez la position R . Alignez et orientez le globe. Sélectionnez le mode IR pour effectuer la mise au point et l’orientation comme ci-dessus.
27. Orientez la tête de caméra en déplaçant l’ensemble de l’appareil sur deux axes par rapport à la base (matériel supplémentaire 2, page 28, flèche verte), puis en augmentant la hauteur (y) de l’appareil (flèches bleues). Faites la mise au point de l’image en faisant pivoter le bouton (flèche orange). Le levier noir est en position R (*). Une fois cette tête en position, verrouillez l’appareil en tournant la vis du pouce (flèche violette).
28. Notez que l’écran apparaît comme indiqué à la page 29 du matériel supplémentaire 2.
29. Déplacez le bouton de sélection de R à A. Sélectionnez ICGA (pour atteindre une autofluorescence de 787 nm) en bleu, intensité de 100 %, champ de vision de 30° et imagerie monophasée.
    REMARQUE: Comme le colorant vert indocyanine, la mélanine est excitée par une lumière de longueur d’onde de 787 nm.
30. Notez que l’écran apparaît comme indiqué à la page 31 du Matériel supplémentaire 2. Appuyez sur le disque noir pour faire la moyenne, puis sélectionnez Acquérir.
31. Choisissez Fenêtre > base de données. Sélectionnez Importer des fichiers E2E à partir du périphérique SLO ; Ces fichiers sont stockés sur un disque dur externe et téléchargés sur le bureau.
32. Sélectionnez Ouvrir. Vérifiez que les marques sont les marques par défaut et sélectionnez OK.
33. Notez que le patient a maintenant deux onglets : l’un montrant les images acquises à partir du SLO (flèche bleue), et l’autre onglet montrant les images acquises à partir du dispositif OCT (flèche rouge) (Matériel supplémentaire 2, page 34).
34. Cliquez avec le bouton droit sur l’image 786 nm (ICGA) et exportez l’image vers un fichier intitulé SLO 786 sur le bureau.
35. Pour enregistrer l’image SLO d’autofluorescence 786 nm, sélectionnez le patient, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour exporter des images en tant que fichiers RAW (pour les fichiers .vol) vers un dossier sur le bureau.
36. Pour exporter des images à partir de l’unité OPO en vue de les transférer vers l’ordinateur d’archivage, copiez/collez depuis RAWEXPORT dans un dossier intitulé RAW.

9. Examen de l’imagerie

1. Assemblez les images (couleur, fichier .vol, images SLO) dans des dossiers pour chaque donneur avec des sous-dossiers pour chaque œil, et indexez les dossiers consécutivement par ID de laboratoire.
2. Enregistrer les empreintes tissulaires (qualité, pathologie) dans une base de données pour un rapport standardisé.
3. Examinez les volumes de l’OPO exportés à l’aide d’un plug-in ImageJ interne.
   1. Trouvez le centre de la fovéa, qui peut être reconnu par le centre du plongeon fovéal, la montée vers l’intérieur des bandes rétiniennes externes ou le point le plus mince. Dans la plupart des cas, ceux-ci coïncident, mais pas toujours, car cela dépend de la préservation fovéale, de la variabilité individuelle et de la présence d’une pathologie.
   2. Trouvez un balayage standard dans la périfovéa supérieure (2 mm/67 B-scans dans la direction supérieure; c’est-à-dire augmenter le nombre de balayages).
   3. Enregistrez une pile .tif de l’ensemble du volume pour une référence rapide à l’avenir.
   4. Faites défiler le volume de l’OPO dans son intégralité, à partir de la numérisation 1 (inférieure), tout en enregistrant les numéros de numérisation dans lesquels les entités sont reconnues.
   5. Vérifiez la zone péripapillaire en plus de la macula.
      REMARQUE: L’atrophie choriorétinienne péripapillaire dans les yeux plus âgés comprend un dépôt laminaire basal distinctif et une néovascularisation. Il s’agit d’une zone commune de changement pigmentaire dans les yeux myopes et le glaucome, ainsi que dans le vieillissement et la DMLA³⁷.
4. Inspectez les photographies en couleur et reliez les résultats à ceux vus par l’EAO si possible.
   REMARQUE : En général, il est plus facile de voir d’abord la plupart des constatations par l’EAO. Les photographies couleur offrent une vue d’ensemble de la zone située à l’extérieur de la zone sur le SLO, de la pigmentation choroïdienne, y compris les naevus, de la présence d’hème et d’exsudats durs, et du pigment noir dans la DMLA néovasculaire. Le pigment foncé dans la fovéa peut représenter des mélanosomes lâches du segment antérieur et doit être lavé doucement avec un tampon à l’aide d’une pipette.
5. Inspectez les images SLO et reliez les résultats à ceux vus par l’OCT si possible.
6. Enregistrez les B-scans standard au niveau de la fovéa et de la périfovéa, les B-scans supplémentaires avec une pathologie notable ou d’autres caractéristiques, et les images SLO dans un rapport de pathologie.
7. Classez les yeux comme suit : banal, douteux, DMLA précoce à intermédiaire, DMLA atrophique, DMLA néovasculaire, autre, inconnu, non gradable, non enregistré. « Douteux » est utilisé s’il n’est pas clair si les changements sont suffisamment importants pour une autre catégorisation. « Non gradable » est réservé aux yeux dépourvus de tomodensitogrammes utiles, tels que ceux dont la rétine est gravement détachée. « Non enregistré » est réservé aux yeux qui sont traités immédiatement après réception sans photographie.
8. Utilisez ces critères pour la DMLA : modification sévère de l’EPR avec dépôts drusen ou drusenoïdes sous-rétiniens, avec ou sans signes de néovascularisation, tels que liquide ou fibrose, et sans preuve d’autres causes (mis à jour à partir de Curcio et ^coll.10 pour tenir compte des TDS).
   NOTE: Le diagnostic final est confirmé par une analyse histologique.

Résultats

Le tableau 1 montre qu’en 2016-2017, 184 yeux de 94 donneurs blancs non diabétiques âgés de >80 ans ont été récupérés. Le temps moyen de décès jusqu’à la préservation était de 3,9 h (intervalle : 2,0-6,4 h). Sur les 184 yeux examinés, 75 (40,2%) avaient une certaine DMLA. Les catégories suivantes ont été identifiées : banale (39,7 %), douteuse (11,4 %), DMLA intermédiaire précoce (22,8 %), atrophique (7,6 %), néovasculaire (9,8 %), autre (8,7 %) et inconnue/non enregistrée/non g...

Discussion

En utilisant une approche de dépistage basée sur la population pendant une période de 16 mois dans l’ère pré-COVID, il a été possible d’obtenir 75 yeux de donneurs atteints de DMLA. Tous ont été récupérés avec un DtoP court et mis en scène à l’aide de MMI ancrés dans les OCT. Le critère d’âge (>80 ans) se situe en dehors de la tranche d’âge typique pour les récupérations tissulaires destinées aux cornées transplantables. Malgré l’âge avancé, nos critères ont abouti à des yeux à tou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beakers, 250 mL	Fisher	# 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex	Fisher	# 10-462-719	storage for preservative
Bunsen burner or heat source	Eisco	# 17-12-818	To melt wax
Camera, digital	Nikon D7200	D7200
Computer and storage	Apple	iMac Pro; 14 TB external hard drive	Image storage
Container, insulated	Fisher	# 02-591-45	For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL	Fisher	Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86	For preservative
Crucible, quartz 30 mL	Fisher	# 08-072D	Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL	Fisher	# 08-549G
Disinfectant cleaning supplies			https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket	contact J. Messinger	jeffreymessinger@uabmc.edu	custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks	Fisher	# 19-910-667
Forceps, Harmon Fix	Roboz	# RS-8247
Forceps, Micro Adson	Roboz	# RS-5232
Forceps, Tissue	Roboz	# RS-5172
Glass petri dish, Kimax	Fisher	# 23064
Gloves Diamond Grip	Fisher	# MF-300
Gowns GenPro	Fisher	# 19-166-116
Image editing software	Adobe	Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes	Fisher	# 06-666
Lamps, 3 goosenecks	Schott Imaging	# A20800
Microscope, stereo	Nikon	SMZ 1000	for dissection
Microscope, stereo	Olympus	SZX9	color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%	EMS	# 15713-S	for preservative; dilute for storage
pH meter	Fisher	# 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2	EMS	# 11600-10
Ring flash	B & H Photo Video	Sigma EM-140 DG
Ruby bead, 1 mm diameter	Meller Optics	# MRB10MD
Safety Glasses 3M	Fisher	# 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope	Heidelberg Engineering	HRA2
Scissors, curved spring	Roboz	# RS-5681
Sharps container	Fisher	# 1482763
Shutter cord, remote	Nikon	MC-DC2
Spectral Domain OCT device	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA&OCT	https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter	McMaster-Carr	# 9529K31
Tissue marking dye, black	Cancer Diagnostics Inc	# 0727-1
Tissue slicer blades	Thomas Scientific	# 6767C18
Trephine, 18-mm diameter	Stratis Healthcare	# 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera	B&H Photo Video	BH # COHD18G6PROB	for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental	EMS	# 72670
Wooden applicators	Puritan	# 807-12