Modélisation de tumeurs cérébrales in vivo à l’aide de l’administration par électroporation d’ADN plasmidique représentant les signatures de mutation des patients

Résumé

L’utilisation d’un modèle de tumeur autochtone immunocompétent piloté par des mutations courantes de patients pour les tests précliniques est essentielle pour les tests immunothérapeutiques. Ce protocole décrit une méthode pour générer des modèles murins de tumeurs cérébrales en utilisant l’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation qui représentent les mutations courantes des patients, fournissant ainsi un modèle murin précis, reproductible et cohérent.

Résumé

Les modèles tumoraux sont essentiels pour les tests précliniques des tumeurs cérébrales en termes d’exploration de nouveaux traitements plus efficaces. Avec un intérêt significatif pour l’immunothérapie, il est encore plus essentiel de disposer d’un modèle murin immunocompétent cohérent et cliniquement pertinent pour examiner les populations de cellules tumorales et immunitaires dans le cerveau et leur réponse au traitement. Alors que la plupart des modèles précliniques utilisent la transplantation orthotopique de lignées cellulaires tumorales établies, le système de modélisation présenté ici permet une représentation « personnalisée » des mutations tumorales spécifiques au patient dans un développement progressif mais efficace à partir de constructions d’ADN insérées dans des cellules précurseurs neurales (NPC) en division in vivo. Les constructions d’ADN comportent l’analyse en mosaïque avec la méthode d’échange de cassettes médiée par la double recombinase (MADR), ce qui permet une mutagenèse somatique en une seule copie des mutations du moteur. En utilisant des souriceaux nouveau-nés entre la naissance et l’âge de 3 jours, les PNJ sont ciblés en tirant parti de ces cellules en division qui tapissent les ventricules latéraux. La micro-injection de plasmides d’ADN (p. ex., dérivés de MADR, transposons, ARNsg dirigé par CRISPR) dans les ventricules est suivie d’une électroporation à l’aide de palettes qui entourent la région rostrale de la tête. Lors de la stimulation électrique, l’ADN est absorbé dans les cellules en division, avec le potentiel de s’intégrer dans le génome. L’utilisation de cette méthode a été démontrée avec succès dans le développement de tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, y compris la tumeur cérébrale maligne la plus courante, le glioblastome. Cet article discute et démontre les différentes étapes du développement d’un modèle de tumeur cérébrale à l’aide de cette technique, y compris la procédure d’anesthésie des jeunes souriceaux, à la micro-injection du mélange plasmidique, suivie de l’électroporation. Grâce à ce modèle murin autochtone et immunocompétent, les chercheurs auront la possibilité d’élargir les approches de modélisation préclinique, dans le but d’améliorer et d’examiner un traitement efficace du cancer.

Introduction

Les modèles murins de tumeurs cérébrales sont cruciaux pour comprendre les mécanismes de formation et de traitement des tumeurs cérébrales. Les modèles actuels comprennent généralement des transplantations sous-cutanées ou orthotopiques rapidement produites de lignées cellulaires tumorales couramment utilisées, basées sur un nombre limité de mutations pilotes ou de modèles de xénogreffes dérivés de patients, en utilisant des souris immunodéficientes qui entravent les études d’immunothérapie appropriées 1,2,3,4. De plus, ces résultats précliniques peuvent conduire à des faux positifs, en ce sens que de tels modèles peuvent présenter des effets spectaculaires, souvent curatifs, en réponse au traitement, mais cela ne se traduit pas en clinique 2,5,6,7. Il est impératif d’avoir la capacité de produire rapidement des modèles de souris précliniques génétiquement modifiés qui reflètent mieux les signatures de mutation des patients pour améliorer la validité des résultats précliniques.

L’administration de plasmides d’ADN basée sur l’électroporation (EP) pour induire à la fois des mutations de perte de fonction (LOF) et de gain de fonction (GOF) permet de générer de tels modèles. Nous avons mis au point une méthode pour une représentation encore plus précise des mutations du pilote GOF appelée analyse en mosaïque avec échange de cassettes médié par la double recombinase, ou MADR⁸. Cette méthode permet l’expression d’un gène (ou de gènes) d’intérêt de manière contrôlée et spécifique au locus dans les cellules somatiques⁸. En combinaison avec d’autres outils moléculaires, tels que les courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement espacées (CRISPR), différentes mutations de patients peuvent être combinées pour développer des modèles de tumeurs cérébrales chez la souris. Cette méthode a été utilisée pour différentes tumeurs cérébrales pédiatriques, y compris les gliomes et les épendymomes⁸, ainsi que pour des modèles de tumeurs cérébrales adultes, telles que le glioblastome (GBM).

Bien que la méthode EP de modélisation tumorale ne soit pas aussi courante qu’une greffe, ce qui suit démontre jusqu’à présent la facilité et la grande reproductibilité de ce système de modélisation. Les souris mTmG sont utilisées pour l’insertion de l’ADN plasmidique MADR ^8,9. Ce système permet la recombinaison des sites cibles de la recombinase (FRT) loxP et Flp situés au locus Rosa26 pour l’insertion ultérieure du plasmide d’ADN du donneur (c’est-à-dire le gène GOF d’intérêt)^8,9. Le protocole suivant démontre la simplicité de cette méthode après une pratique assidue, et la capacité de développer des modèles de tumeurs cérébrales de souris d’une manière autochtone et cohérente.

Protocole

Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Cedars Sinai Medical Center (IACUC). Des souris mTmG homozygotes ont été accouplées avec des souris C57BL/6J afin d’obtenir des portées de souris mTmG hétérozygotes de sexe mixte à utiliser dans le protocole suivant. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Les souriceaux ont été électroporés entre les jours 0 et 3 postnatals (P0-P3).

1. Configuration chirurgicale

1. Vaporisez la table d’opération avec un désinfectant chimique (par exemple, Vimoba) et essuyez, puis essuyez avec de l’éthanol à 70 %, puis essuyez à nouveau.
2. Placez les instruments/matériaux suivants sur la table d’opération : pipettes capillaires en verre tiré (voir référence¹⁰ sur la façon de tirer les pipettes), petits ciseaux, petit récipient à déchets d’objets tranchants à risque biologique, pipette microlitre et pointes de pipette, 2 morceaux carrés coupés de film de paraffine, gel d’électrode, électrodes, support pour le micro-injecteur et mélange de plasmides d’ADN (voir le tableau des matériaux et le fichier supplémentaire 1).
3. Placez les accessoires suivants sur l’équipement sur la table d’opération ou sur le sol lorsque cela est indiqué : panneau de commande du micro-injecteur, support et fiche fixés à la machine, support pour maintenir le support du micro-injecteur sur le côté (aide à souder), pédale du micro-injecteur (sur le sol), électrodes fixées à la machine et pédale d’électrode (sur le sol) (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : La pédale de l’électrode a été placée à droite de la pédale du micro-injecteur pour rappeler l’ordre d’utilisation.
4. Allumez les panneaux de commande du micro-injecteur et de l’électrode.
   1. Vérifiez que les réglages du micro-injecteur sont corrects pour l’expérience : la pression doit être comprise entre 220 et 450 hPa, en fonction de la façon dont le mélange plasmidique est absorbé.
   2. Vérifiez que les paramètres du panneau d’électrodes sont corrects pour l’expérience.
      REMARQUE : Pour l’expérience actuelle (et la plupart de nos modèles de tumeurs cérébrales), cinq impulsions de 120 V (50 ms ; séparées par 950 ms) sont utilisées.

2. Préparation pré-chirurgicale

1. Préparez le mélange plasmidique dans le micro-injecteur.
   1. Récupérez une pipette capillaire en verre tirée et insérez-la dans le support du micro-injecteur. Assurez-vous que l’embout est vissé pour le maintenir en place.
   2. Tenez le support de micro-injecteur d’une main et les petits ciseaux de l’autre ; Placez la pointe de la pipette au-dessus d’un petit récipient à risque biologique pour objets tranchants. Avec les ciseaux fermés, appuyez légèrement sur la pipette capillaire en verre allongée. Coupez là où le coude est visible, à environ 2 mm de l’ouverture. Si la coupe semble réussie, placez-la soigneusement sur le côté.
   3. Placez le tube de mélange de plasmides disponible dans le commerce à plat sur la table d’opération et ouvrez-le. Placez la boîte à pointes de pipette ou un autre objet derrière le fond du tube pour le maintenir stable pendant l’aspiration du mélange plasmidique. Placez la pipette en verre fixée à la ligne de micro-injecteur à plat sur la table et insérez-la doucement dans le tube du mélange de plasmides, en vous assurant que l’embout est bien dans le mélange près du fond du tube.
      REMARQUE : En raison de l’aspiration par gravité naturelle, l’aspiration du mélange plasmidique commencera dans la pipette en verre avant d’aspirer activement.
   4. Avec la pointe de la pipette en verre dans le mélange plasmidique, utilisez le panneau du micro-injecteur pour augmenter la quantité aspirée. En commençant à 0, tournez le bouton droit et faites le cadran dans le sens négatif vers -60 - cela amènera le mélange plasmidique dans la pipette en verre. N’apportez que ~1 pouce de mélange plasmidique. Retournez le bouton sur 0, puis retirez l’embout de pipette du mélange.
      REMARQUE : Ne retirez pas l’embout de la pipette du mélange dans le sens négatif, car cela projetterait le mélange dans le micro-injecteur et éventuellement dans le tube.
   5. Testez la quantité de mélange en une injection en injectant le mélange sur une bande de film de paraffine. Utilisez la pédale et appuyez une fois pour injecter le mélange sur le film de paraffine. Utilisez la pipette réglée à 1 μL pour aspirer le mélange sur le film de paraffine afin de voir s’il est exactement de 1 μL.
      REMARQUE : Si elle est légèrement inférieure à 1 μL, la pression du micro-injecteur peut être augmentée. Si la pression est proche de 450 hPa et toujours inférieure à 1 μL, l’ouverture de la pipette en verre est trop petite et devra être coupée davantage. Il est suggéré de remettre le mélange plasmidique dans le tube avant de le couper. Malgré cela, il y aura toujours un mélange résiduel sur les ciseaux, il est donc impératif de bien nettoyer les ciseaux par la suite avec DNase pour éliminer tout mélange restant. Si l’injection est supérieure à 1 μL, une nouvelle pipette en verre tiré devra être utilisée et coupée. Lorsque la quantité de test est exactement de 1 μL, l’embout de la pipette en verre est à la bonne taille.
   6. Répétez l’étape 2.1.4 pour aspirer un mélange de plasmides supplémentaire pour la procédure, ou environ 2 à 3 pouces dans la pipette en verre tiré. Assurez-vous que le mélange ne va pas trop loin dans le micro-injecteur où l’on ne peut pas voir l’extrémité.
      REMARQUE : Lors de l’aspiration du mélange plasmidique, il est essentiel d’éviter les bulles d’air. Si des bulles sont présentes, il est nécessaire de refaire cette étape en retirant le mélange plasmidique de la pipette en verre tiré et en recommençant. Les bulles d’air présentes seront préjudiciables aux étapes suivantes lors de l’injection dans le ventricule du chiot.
   7. Une fois le mélange de plasmides prêt dans la pipette en verre tiré, placez la pipette préparée sur le côté sur le support d’aide à souder et à l’écart afin de ne pas la toucher/heurter accidentellement.
2. Préparez les animaux à l’expérience.
   1. Préparez un seau à glace pour anesthésier les chiots. Ajoutez de l’eau dans le seau à glace pour qu’il fasse fondre et aide à refroidir le support d’anesthésie (par exemple, le dessus de la boîte de pipette).
   2. Placez le dessus de la boîte sur la glace fondue pour qu’elle refroidisse.
   3. Retirez délicatement le(s) chiot(s) de la cage et placez-les dans le dessus de la boîte réfrigérée, qui reste sur la glace. Placez un autre haut sans serrer sur le bas pour faciliter le processus de refroidissement.
   4. Après 2-3 minutes, vérifiez les chiots. Séparez les chiots les uns des autres tout en restant en position couchée.
      REMARQUE : Les chiots se tortilleront, mais cela ralentira à mesure que l’anesthésie froide entrera en jeu. Le dessus de la boîte peut être laissé de côté pour faciliter la visualisation des chiots.
   5. Pour vérifier que l’anesthésie est correcte, pincez la queue du chiot et recherchez une réaction. S’il y a une réaction, répétez l’étape 2.2.4. S’il n’y a pas de cri ou peu de mouvement, le chiot est prêt pour l’intervention.
      REMARQUE : Les souris ne doivent pas être gardées sur la glace pendant de longues périodes, car cela affecterait leur capacité à récupérer après l’intervention. Seul le nombre de chiots qui peuvent être injectés et électroporés pendant qu’ils sont encore sous anesthésie doit être mis sur de la glace à la fois ; Avec l’expérience, on peut en faire plus d’argent.

3. Micro-injection d’un mélange de plasmides d’ADN dans le ventricule cérébral

1. Placez un chiot sur la table en position ventrale.
2. Tirez légèrement vers l’arrière de la tête pour visualiser les sutures du crâne à travers la peau. Trouvez lambda sur le crâne. Le ventricule/site d’injection sera à mi-chemin entre lambda et l’œil.
   REMARQUE : Lambda est l’endroit où les sutures sagittales et lambdoïdes se croisent. Voir la référence¹¹ pour l’identification de lambda sur le crâne de la souris.
3. Percez la peau avec la pointe de la pipette en verre à un angle perpendiculaire (la pipette est droite vers le plafond). Observez une légère indentation concave lors de l’appui sur le crâne et une résistance initiale. Une fois percé et que l’embout de la pipette en verre perce l’indentation concave, le niveau d’injection approprié est atteint.
4. Maintenez l’embout de pipette en verre en place et appuyez une fois sur la pédale du micro-injecteur pour injecter 1 μL du mélange plasmidique.
   REMARQUE : Il y a deux façons de voir clairement que l’injection a réussi. Tout d’abord, demandez à un autre membre du laboratoire de regarder le mélange de plasmides descendre dans la pipette en verre au fur et à mesure de son injection. De plus, si vous utilisez du vert rapide ou un autre colorant dans le mélange plasmidique, le colorant s’étalera visiblement dans le ventricule sous la peau une fois injecté et sera facilement visible lorsqu’il sera tenu devant une lampe chirurgicale.

4. Électroporation

1. Placez un morceau de film de paraffine (un carré) sur la table et pressez le gel d’électrode sur le film. Recouvrez les palettes d’électrodes de gel d’électrode en badigeonnant chaque palette d’une quantité généreuse. Tout excès de gel qui s’écoule peut être essuyé sur une serviette en papier.
   REMARQUE : Après le premier EP, ne laissez pas le gel de chaque pagaie toucher l’autre côté. Cela transférera la charge et, lors de l’application sur la tête du chiot, un grésillement peut être entendu. Cela se produira également si le gel sur la tête du chiot d’une électrode entre en contact avec le gel d’une autre.
   ATTENTION : Des précautions doivent être prises pour garder les doigts éloignés des palettes pendant l’électroporation.
2. Tenez le corps du chiot dans une main (généralement la main non dominante), en gardant les doigts bien derrière la tête.
   REMARQUE : Si vous êtes droitier, il est plus facile de tenir le chiot avec la main gauche et les électrodes avec la droite. Si vous êtes gaucher, faites l’inverse.
3. Rapprochez les électrodes de la tête du chiot pour vous assurer qu’elles sont dans la bonne position, avec l’électrode positive à l’extérieur de la tête où le ventricule est ciblé (par exemple, si vous ciblez le ventricule gauche, placez le positif sur le côté gauche du chiot et le négatif sur le côté droit du chiot). Tout en positionnant les électrodes, faites glisser doucement un doigt (généralement le pouce) sur la face dorsale du corps/cou postérieurement à la tête pour aider à soulever la tête en position.
4. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant la queue et ne procédez à l’électroporation que si le chiot est dans le plan d’anesthésie approprié. Pressez légèrement les palettes d’électrode sur la partie rostrale de la tête de la souris, en les plaçant sur les yeux. Appuyez une fois sur la pédale de l’électrode pour démarrer l’électroporation. Ce protocole utilise cinq impulsions de 120 V (50 ms, séparées par 950 ms) ; Chaque impulsion sera audible.
   1. À chaque impulsion, tournez légèrement les palettes d’électrode dans le sens inverse des aiguilles d’une montre afin que la palette positive se déplace vers le haut de la tête.
      REMARQUE : Avec une électroporation appropriée, on sentira / verra le corps du chiot souris se contracter à chaque impulsion.
5. Après la dernière impulsion, retirez les palettes et placez-les sur le côté. Déplacez le chiot vers une serviette en papier propre et demandez à un autre membre du laboratoire de nettoyer le gel de la tête du chiot et placez-le sous une lampe chauffante sur un « bateau » d’essuie-tout.
   REMARQUE : Assurez-vous que la lampe chauffante n’est pas trop proche des chiots. Assurez-vous d’avoir un autre membre du laboratoire pour vous aider dans cette étape et gardez un œil constant sur les chiots. Il est souvent utile de tenir les chiots dans sa main sous la lampe chauffante pour augmenter la chaleur pour le chiot. Masser doucement l’abdomen du chiot peut également aider à la récupération.
6. Remettez les chiots dans la cage d’origine une fois que leur corps a une couleur rosâtre saine et qu’il réagit de manière grinçante à un léger pincement de la queue.
   REMARQUE : Avant de les remettre dans la cage, prenez une petite quantité de litière de la cage domestique et brossez légèrement les chiots avec pour l’odeur de la cage. Replacez les chiots dans la cage sous la litière et retournez dans la salle d’attente.

5. Étapes post-chirurgicales

1. Remettez le mélange plasmidique inutilisé de la pipette en verre du micro-injecteur dans le tube. S’il reste suffisamment de mélange, celui-ci peut être utilisé dans de futures procédures. Conserver à -20 °C.
2. Essuyez le gel des palettes d’électrodes avec du papier absorbant.
3. Remettez toutes les pièces de l’équipement à leur place d’origine.
   REMARQUE : Si des ciseaux ont été utilisés pour couper l’embout de pipette en verre après que le mélange plasmidique ait été absorbé, laissez les ciseaux à l’extérieur pour nettoyer soigneusement avec une solution de DNase.
4. Vaporisez un désinfectant chimique sur la table, puis essuyez, puis vaporisez de l’éthanol à 70 %, puis essuyez à nouveau.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour développer avec succès des modèles murins de tumeurs cérébrales pédiatriques et adultes, le premier étant publié en détail dans Kim et ^al.8. Avec une technique appropriée et une planification minutieuse de la conception des plasmides, le succès du développement des tumeurs par EP est généralement de 100%. L’histologie est le moyen le plus rapide et le plus simple de vérifier la réussite de l’insertion d’un plasmide d’ADN ...

Discussion

L’administration d’ADN plasmidique basée sur l’électroporation permet l’utilisation in vivo de la biologie moléculaire, similaire à celle utilisée dans les modèles murins génétiquement modifiés, mais avec la vitesse, la localisation et l’efficacité de la transduction virale 8,13,14. Ce dernier s’accompagne toutefois de problèmes de sécurité ainsi que de réponses immunitaires. Nous avons montré...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-2.5 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000012
2 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-442
20 µL pipette tips	Fisher Scientific	02-707-432
2-20 µL 1-channel pipette	Eppendorf	3123000098
DNAZap PCR DNA Degradation Solutions	Fisher Scientific	AM9890
ECM 830 Square Porator Electroporator	BTX	45-0662
Electrode Gel	Parker Labs	PLI152CSZ
Fast Green Dye	Sigma-Aldrich	F7258-25G
Helping Hands Soldering Aid	Pro'sKit	900-015
Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp	Roboz	RS-5916
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	JAX: 000664
Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter	BTX	45-0488
Sharps container, 1-quart	Uline	S-15307
Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID	World Precision Instruments	1B100F-4	Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.
Vertical Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-30	Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.
Vimoba Tablet Solution	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments	BRE
XenoWorks Micropipette Holder	Sutter Instruments	BR-MH