Quantification basée sur la fluorescence du potentiel de membrane mitochondriale et des niveaux de superoxyde à l’aide de l’imagerie en direct dans les cellules HeLa

Résumé

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Résumé

Les mitochondries sont des organites dynamiques essentiels à l’homéostasie métabolique en contrôlant la production d’énergie via la synthèse de l’ATP. Pour soutenir le métabolisme cellulaire, divers mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale coopèrent pour maintenir un réseau mitochondrial sain. L’une de ces voies est la mitophagie, où la kinase 1 induite par PTEN (PINK1) et la phospho-ubiquitination Parkin des mitochondries endommagées facilitent la séquestration des autophagosomes et leur élimination ultérieure de la cellule par fusion des lysosomes. La mitophagie est importante pour l’homéostasie cellulaire, et les mutations de Parkin sont liées à la maladie de Parkinson (MP). En raison de ces résultats, l’accent a été mis sur l’étude des dommages mitochondriaux et du renouvellement pour comprendre les mécanismes moléculaires et la dynamique du contrôle de la qualité mitochondriale. Ici, l’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le réseau mitochondrial des cellules HeLa, pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde après un traitement au cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. De plus, une mutation liée à la MP de Parkin (Parkin^T240R) qui inhibe la mitophagie parkine-dépendante a été exprimée pour déterminer comment l’expression mutante affecte le réseau mitochondrial par rapport aux cellules exprimant la parkine de type sauvage. Le protocole décrit ici décrit un flux de travail simple utilisant des approches basées sur la fluorescence pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde.

Introduction

Le réseau mitochondrial est une série d’organites interconnectés qui jouent un rôle crucial dans la production d’énergie¹, l’immunité innée ^2,3 et la signalisation cellulaire ^4,5. La dysrégulation mitochondriale a été associée à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)^6,7. La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant les neurones dopaminergiques de la substance noire qui touche près de 10 millions de personnes dans....

Protocole

1. Préparation des échantillons biologiques

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité. Pulvérisez la surface de l’armoire et tous les matériaux avec de l’éthanol à 70%.

1. Culture et transfection de cellules HeLa
   1. Culture de 30 000 cellules HeLa dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum fœtal bovin et de 1 % de solution de L-glutamine (milieu HeLa; voir le tableau des matières). Plaquer les cellules sur des antennes paraboliques d’imagerie à fond de verre de 35 mm (v....

Discussion

Le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde de manière robuste et reproductible à l’aide de l’imagerie basée sur la fluorescence³⁰. Il y a d’importantes limites techniques à prendre en compte lors de la conception de ces expériences. Les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur YFP vide, YFP-Parkin^WT ou YFP-Parkin^T240R. Le vecteur YFP vide a été utilisé co.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A