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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette technique décrit un flux de travail efficace pour visualiser et mesurer quantitativement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde dans les cellules HeLa à l’aide de l’imagerie en direct basée sur la fluorescence.

Résumé

Les mitochondries sont des organites dynamiques essentiels à l’homéostasie métabolique en contrôlant la production d’énergie via la synthèse de l’ATP. Pour soutenir le métabolisme cellulaire, divers mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale coopèrent pour maintenir un réseau mitochondrial sain. L’une de ces voies est la mitophagie, où la kinase 1 induite par PTEN (PINK1) et la phospho-ubiquitination Parkin des mitochondries endommagées facilitent la séquestration des autophagosomes et leur élimination ultérieure de la cellule par fusion des lysosomes. La mitophagie est importante pour l’homéostasie cellulaire, et les mutations de Parkin sont liées à la maladie de Parkinson (MP). En raison de ces résultats, l’accent a été mis sur l’étude des dommages mitochondriaux et du renouvellement pour comprendre les mécanismes moléculaires et la dynamique du contrôle de la qualité mitochondriale. Ici, l’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour visualiser le réseau mitochondrial des cellules HeLa, pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde après un traitement au cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. De plus, une mutation liée à la MP de Parkin (ParkinT240R) qui inhibe la mitophagie parkine-dépendante a été exprimée pour déterminer comment l’expression mutante affecte le réseau mitochondrial par rapport aux cellules exprimant la parkine de type sauvage. Le protocole décrit ici décrit un flux de travail simple utilisant des approches basées sur la fluorescence pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde.

Introduction

Le réseau mitochondrial est une série d’organites interconnectés qui jouent un rôle crucial dans la production d’énergie1, l’immunité innée 2,3 et la signalisation cellulaire 4,5. La dysrégulation mitochondriale a été associée à des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (MP)6,7. La MP est une maladie neurodégénérative progressive affectant les neurones dopaminergiques de la substance noire qui touche près de 10 millions de personnes dans le monde8. La MP a été génétiquement liée à la mitophagie, une voie de contrôle de la qualité mitochondriale nécessaire au maintien de l’homéostasie cellulaire qui élimine sélectivement les mitochondries endommagées 9,10. Des études ont identifié plusieurs voies de mitophagie indépendantes, y compris le domaine FUN14 contenant la mitophagie médiée par 1 (FUNDC1), la mitophagie facilitée par la protéine 3 interagissant Bcl-2 (BNIP3), la mitophagie dépendante de NIX et la mitophagie bien caractérisée induite par PTEN 1 (PINK1)/Parkin-regulated10,11. PINK1 (une kinase putative) et Parkin (une ubiquitine ligase E3) travaillent en tandem pour phospho-ubiquitinate des mitochondries endommagées, ce qui entraîne la formation d’autophagosomes qui engloutissent l’organite endommagé et fusionnent avec les lysosomes pour initier la dégradation 12,13,14,15,16. Des mutations dans Parkin ont été associées à des phénotypes liés à la MP tels que la neurodégénérescence via la perte de neurones dopaminergiques17,18.

Ici, un protocole est décrit dans lequel les cellules HeLa, des cellules immortalisées couramment utilisées dérivées du cancer du col de l’utérus, sont utilisées pour étudier le rôle de Parkin dans le maintien de la santé du réseau mitochondrial. Les cellules HeLa expriment des niveaux négligeables de Parkin endogène et nécessitent donc une expression exogène de Parkin19. Pour étudier le rôle de Parkin dans la santé du réseau mitochondrial, les cellules HeLa sont transfectées avec soit de la Parkin de type sauvage (ParkinWT), soit un mutant Parkin (ParkinT240R) ou un vecteur témoin vide. ParkinT240R est une mutation autosomique récessive du parkinsonisme juvénile qui affecte l’activité de la parkin E3 ligase, réduisant considérablement l’efficacité de la voie de mitophagie20. Les cellules HeLa sont sujettes à des concentrations légères (5 μM) ou sévères (20 μM) de cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP), un agent de découplage mitochondrial. Le traitement avec des concentrations sévères de CCCP est couramment utilisé pour induire la mitophagie médiée par Parkin dans diverses lignées cellulaires, telles que les cellules HeLa et COS-721,22,23.

Après le traitement, le protocole utilise l’imagerie en direct du réseau mitochondrial à l’aide de deux colorants fluorescents ciblant les mitochondries actuellement disponibles. La tétraméthylrhodamine, ester éthylique, perchlorate (TMRE) est un colorant cationique qui devient fluorescent en fonction du potentiel membranaire mitochondrial24, tandis que MitoSOX est un indicateur de superoxyde mitochondrial où l’intensité de fluorescence est fonction de la concentration de superoxyde25. Enfin, le protocole décrit utilise une quantification basée sur la fluorescence et un flux de travail simple pour quantifier efficacement le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde avec une marge minimale de biais pour l’utilisateur. Bien que ce protocole ait été conçu pour étudier la fonction mitochondriale dans les cellules HeLa, il peut être adapté à d’autres lignées cellulaires et types de cellules primaires pour caractériser quantitativement la santé du réseau mitochondrial.

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Protocole

1. Préparation des échantillons biologiques

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes en utilisant une technique stérile dans une enceinte de biosécurité. Pulvérisez la surface de l’armoire et tous les matériaux avec de l’éthanol à 70%.

  1. Culture et transfection de cellules HeLa
    1. Culture de 30 000 cellules HeLa dans le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 4,5 g/L de glucose additionné de 10 % de sérum fœtal bovin et de 1 % de solution de L-glutamine (milieu HeLa; voir le tableau des matières). Plaquer les cellules sur des antennes paraboliques d’imagerie à fond de verre de 35 mm (voirT able des matériaux) contenant 2 mL de milieu HeLa préchauffé. Maintenir les cultures HeLa à 5 % de CO2 et à 37 °C26,27.
    2. Le lendemain du placage, inspectez les antennes d’imagerie de 35 mm à l’aide d’un microscope optique pour vous assurer que les cellules sont ~50%-60% confluentes. Une fois confluentes, transfecter les cellules HeLa avec le vecteur vide de la protéine fluorescente jaune (YFP), YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R (Figure 1A).
    3. Préparer deux mélanges séparés dans des tubes à microcentrifugation stériles pour chaque transfection. Mélanger en tapotant le tube ou en pipetant doucement de haut en bas.
      1. Dans le tube 1, mélanger 200 μL de milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) avec 2 μg d’ADN plasmidique.
      2. Dans le tube 2, mélanger 200 μL de milieu sérique réduit avec 6 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matières)28.
    4. Incuber les tubes pendant 5 min à température ambiante (RT). Ajouter le tube 2 au tube 1, mélanger en pipetant de haut en bas et incuber pendant 20 min à TA.
    5. Ajoutez les complexes de transfection goutte à goutte aux antennes d’imagerie existantes contenant les cultures cellulaires HeLa, assurant une répartition égale sur l’ensemble de la boîte. Placez les antennes d’imagerie dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant la nuit.
      NOTE: Étiqueter chaque plat avec le plasmide transfecté approprié. Pour chaque expérience, étiquetez les trois boîtes YFP-ParkinWT (diméthylsulfoxyde [DMSO; voir le tableau des matériaux], 5 μM CCCP et 20 μM CCCP). Répétez l’étiquetage avec les trois boîtes YFP-ParkinT240R et les trois boîtes vectorielles YFP vides.
  2. Préparation du CCCP et des colorants fluorescents
    ATTENTION : Les colorants fluorescents sont souvent sensibles à la lumière. Conservez les colorants dans l’obscurité à l’aide de papier d’aluminium ou de tubes centrifugés bruns pour réduire l’exposition à la lumière.
    1. Faire un stock de travail de 5 mM de PCCC (voir le tableau des matières) en dissolvant 5 mg de PCCC dans 4,89 mL de DMSO. Faire un stock de travail de 20 mM de CCCP en dissolvant 5 mg de CCCP dans 1,22 mL de DMSO.
    2. Diluer 10 μL d’une solution mère MitoTracker Deep Red (voir Tableau des matériaux) de 1 mM dans 390 μL de DMSO pour obtenir un stock de travail de 25 μM.
    3. Dissoudre 50 μg de MitoSOX Red25 (voir le tableau des matériaux) dans 13 μL de DMSO pour créer un stock de travail de 5 mM.
    4. Dissoudre 10 mg de TMRE24 (voir le tableau des matières) dans 19,4 mL de DMSO pour obtenir une solution mère de 1 mM. Diluer l’EMRT en ajoutant 10 μL de TMRE 1 mM dans 990 μL de DMSO pour obtenir un stock de travail de 10 μM.

2. Traitement CCCP et marquage mitochondrial avec des sondes fluorescentes dans les cellules HeLa

ATTENTION : Effectuez rapidement les étapes suivantes pour vous assurer que les cellules HeLa ne sont pas hors de l’incubateur pendant une période prolongée.

  1. Le lendemain de la transfection, ajouter 2 μL de 5 ou 20 mM CCCP (concentration finale : 5 μM et 20 μM, respectivement) à chaque plaque expérimentale. Pour les plaques de contrôle, ajoutez 2 μL de DMSO. Remettre les plaques dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 1,5 h (figure 1A).
    NOTE: Le traitement CCCP est pour un total de 2 h. Cependant, les mitochondries sont marquées avec des sondes fluorescentes pendant les 30 dernières minutes du traitement CCCP.
  2. Après 1,5 h, retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez des sondes fluorescentes aux antennes d’imagerie. Remettre les plaques dans l’incubateur à 5 % de CO2 et 37 °C pendant 30 min (Figure 1A).
    1. Expérience TMRE : Ajouter 2 μL de MitoTracker 25 μM (concentration finale : 25 nM) et 2 μL de TMRE 10 μM (concentration finale : 10 nM).
    2. Expérience MitoSOX : Ajouter 2 μL de MitoTracker 25 μM (concentration finale : 25 nM) et 1 μL de MitoSOX 5 mM (concentration finale : 2,5 μM).
  3. Après le traitement CCCP de 2 h, préparer les cellules HeLa pour l’imagerie (Figure 1A,B).
    1. Expérience TMRE : les cellules HeLa sont immédiatement prêtes à être imagées ; s’assurer que l’ERMC reste dans le milieu de culture cellulaire HeLa.
    2. Expérience MitoSOX : Lavez les cellules 3x avec 2 mL de milieu HeLa préchauffé pour éliminer le colorant MitoSOX libre. Ajouter 2 mL de média préchauffé. Les cellules HeLa sont maintenant prêtes à être imagées.
      REMARQUE : Laver les cellules HeLa avec un milieu HeLa frais préchauffé qui contient la même concentration de DMSO ou de PCCC que la condition expérimentale; n’incluent pas MitoSOX ou MitoTracker.

3. Configuration d’acquisition d’images de microscope confocal

REMARQUE : Imagez les cellules HeLa à l’aide d’un microscope confocal (voir le tableau des matériaux) équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile à ouverture numérique (NA) 63x/1,40 et d’une chambre environnementale (voir le tableau des matériaux).

  1. A 1 h avant l’imagerie, allumez le CO2 en ouvrant la vanne du réservoir. Appuyez sur le bouton On pour activer le contrôleur environnemental du microscope. Utilisez les flèches haut et bas sur le pavé tactile pour régler la température à 37 °C et le CO2 à 5%. Appuyez sur Définir lorsque vous avez terminé.
    REMARQUE : Assurez-vous que les portes de la chambre environnementale sont fermées et attendez que les conditions se stabilisent.
  2. Réglages laser
    1. Allumez le laser à lumière blanche (WLL) et réglez la puissance laser sur 85% et le contrôle d’excitation sur la puissance maximale. Cliquez sur l’onglet Acquérir , sélectionnez Ajouter un laser et, dans la boîte de dialogue qui s’affiche, basculez le WLL sur Activé. Cliquez sur le bouton Laser Power (Alimentation laser ) et entrez 85 %. Cliquez sur le bouton Excitation Control (Contrôle de l’excitation) et sélectionnez Maximum Power (Puissance maximale ) dans le menu déroulant (Figure 2A).
    2. Expérience TMRE : Définissez les spectres d’excitation et d’émission pour YFP, MitoTracker et TMRE.
      1. Pour YFP, réglez le laser d’excitation sur 514 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 524-545 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; puis, cliquez sur Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 514 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 524 pour le début et 545 pour la longueur d’onde finale.
      2. Pour MitoTracker Deep Red, réglez le laser d’excitation sur 641 et la fenêtre des spectres d’émission sur 650-750 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 641 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 650 pour le début et 750 pour la longueur d’onde finale.
      3. Pour TMRE, réglez le laser d’excitation sur 555 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 557-643 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 2. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 555 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 557 pour le début et 643 pour la longueur d’onde finale.
    3. Expérience MitoSOX : Définissez les spectres d’excitation et d’émission pour YFP, MitoTracker et MitoSOX (Figure 2B).
      1. Pour YFP, réglez le laser d’excitation sur 507 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 517-540 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 1. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 507 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 517 pour le début et 540 pour la longueur d’onde finale.
      2. Pour MitoSOX, réglez le laser d’excitation sur 547 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 564-636 nm. Dans l’onglet Acquérir , cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; ensuite, cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 2. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 547 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 564 pour le début et 636 pour la longueur d’onde finale.
      3. Pour MitoTracker Deep Red, réglez le laser d’excitation sur 641 nm et la fenêtre des spectres d’émission sur 652-742 nm. Dans l’onglet Acquérir, cliquez sur le bouton Ajouter un nouveau paramètre ; cliquez sur le bouton Ajouter un laser et faites-le glisser dans le paramètre 3. Double-cliquez sur la ligne d’excitation et entrez 641 comme longueur d’onde dans la boîte de dialogue. Double-cliquez sur le détecteur correspondant et entrez 652 pour le début et 742 pour la longueur d’onde finale.
  3. Paramètres d’acquisition d’images (Figure 2C)
    1. Définissez le format sur 1 024 x 1 024, la vitesse de numérisation sur 600 Hz et la moyenne de la ligne sur 3.
      1. Sélectionnez l’onglet Acquisition et cliquez sur le bouton Format . Dans le menu déroulant, sélectionnez 1 024 x 1 024. Cliquez sur le bouton Vitesse et sélectionnez 600 dans le menu déroulant. Ensuite, cliquez sur le bouton Moyenne des lignes , puis dans le menu déroulant, sélectionnez 3.
      2. Activez le balayage bidirectionnel et réglez le facteur de phase et de zoom sur 22,61 et 1,50, respectivement.
        1. Dans l’onglet Acquisition, basculez le bouton bidirectionnel sur Activé. Cliquez sur le paramètre Phase X et réglez-le sur 22,61. Cliquez sur le paramètre Facteur de zoom et réglez-le sur 1,50.

4. Acquisition d’images

ATTENTION : L’expérimentateur doit porter un jugement visuel pour sélectionner les cellules en fonction du signal de fluorescence YFP. Évitez les pixels sursaturés, car ils peuvent affecter de manière significative la quantification de l’intensité de fluorescence. Utilisez une table de consultation over/under qui indique la saturation en pixels pour éviter d’acquérir des images saturées.

  1. Cliquez sur le paramètre d’intérêt et appuyez sur Fast Live pour fournir un aperçu en direct de l’image de fluorescence.
  2. Ajustez le gain et l’intensité en double-cliquant sur le détecteur correspondant. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, réglez le gain à l’aide du curseur. Pour modifier l’intensité, double-cliquez sur la ligne d’excitation et utilisez les flèches haut et bas dans la fenêtre contextuelle pour modifier l’intensité. Cliquez sur Arrêter pour mettre fin à l’aperçu.
    1. Expérience TMRE : imagez d’abord la plaque de contrôle DMSO. Ajuster le gain et l’intensité du signal TMRE (réglage 2) de sorte que l’intensité du réseau mitochondrial soit juste en dessous de la saturation; Gardez le gain et l’intensité constants pour l’expérience. Ajustez le gain et l’intensité du MitoTracker et du YFP (réglage 1) afin que le réseau mitochondrial soit visible mais faible.
    2. Expérience MitoSOX : imagez d’abord la plaque de contrôle DMSO. Ajuster le gain et l’intensité du signal MitoSOX (réglage 2) de sorte que la fluorescence soit visible mais faible; Gardez le gain et l’intensité constants pour l’expérience. Ajustez le gain et l’intensité du YFP (réglage 1) et du MitoTracker (réglage 3) afin que le réseau mitochondrial soit visible mais faible.
      REMARQUE : Enregistrez le gain et l’intensité de TMRE et de MitoSOX, car ces valeurs doivent rester constantes tout au long de l’expérience. Les signaux de fluorescence de YFP et MitoTracker ne sont pas quantifiés dans ce protocole. Par conséquent, le gain et l’intensité peuvent être ajustés pour chaque image. Il est plus efficace d’avoir les réglages de gain et d’intensité où les cellules sont faciles à voir mais encore faibles, pour s’assurer que les cellules ne sont pas exposées à des intensités laser excessives qui causent des dommages cellulaires ou un photoblanchiment.
  3. Une fois les réglages de gain et d’intensité terminés, cliquez sur Démarrer pour acquérir une image. Acquérir des images de 20 cellules par condition expérimentale (p. ex., cinq images avec quatre cellules par image; Figure 2D).

5. Quantification de l’intensité de fluorescence à l’aide d’ImageJ

REMARQUE: Les fichiers d’imagerie sont enregistrés sous « .lif » et sont compatibles avec ImageJ29. Les types de fichiers compatibles avec ImageJ sont spécifiés sur leur site Web. Il peut être nécessaire de convertir le type de fichier s’il est incompatible.

  1. Créez et enregistrez une région d’intérêt (ROI).
    1. Dans ImageJ, cliquez sur Fichier | Nouveau | L’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cliquez sur OK.
    2. Cliquez sur le bouton Outil Rectangle et dessinez une boîte de 6 microns x 6 microns. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | ROI Manager et attendez qu’une boîte de dialogue avec le gestionnaire de ROI apparaisse (Figure 3A). Ajoutez le retour sur investissement rectangulaire au gestionnaire en cliquant sur Ajouter dans la boîte de dialogue du gestionnaire. Enregistrez le retour sur investissement en sélectionnant Plus, puis cliquez sur le bouton Enregistrer et OK.
  2. Mesurer l’intensité de fluorescence.
    1. Dans l’image J, cliquez sur Fichier et sélectionnez Ouvrir. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez les fichiers d’imagerie pour l’expérience et cliquez sur Ouvrir.
    2. Attendez que la fenêtre Options d’importation des formats biographiques s’affiche (Figure 3B). Sélectionnez Split Channels (Fractionner les canaux ) et cliquez sur Open (Ouvrir).
      REMARQUE: La fonction de canaux fractionnés permet d’ouvrir chaque canal de l’image dans une fenêtre distincte. L’ordre de canal correspond à l’ordre d’acquisition.
      1. Expériences TMRE : YFP (réglage 1) est le premier canal (c = 0); MitoTracker (réglage 1) est le deuxième canal (c = 1); et TMRE (réglage 2) est le troisième canal (c = 2).
      2. Expériences MitoSOX : YFP (réglage 1) est le premier canal (c = 0) ; MitoSOX (réglage 2) est le deuxième canal (c = 1); et MitoTracker (réglage 3) est le troisième canal (c = 2).
    3. Ajustez la luminosité en sélectionnant Image | Ajuster | Luminosité (Figure 3C).
      REMARQUE: N’appuyez pas sur Définir ou Appliquer pour vous assurer que la luminosité de l’image n’est pas modifiée de manière permanente. Parfois, l’intensité de fluorescence n’est pas visible dans les canaux TMRE ou MitoSOX. Ajustez la luminosité pour faciliter la visualisation. La modification de la luminosité n’affecte pas les valeurs brutes d’intensité de fluorescence.
    4. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Définir les mesures. Cochez les cases Zone et Valeur moyenne du gris et cliquez sur OK (Figure 3D).
      REMARQUE: La valeur moyenne de gris est l’intensité de fluorescence.
    5. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement et chargez le retour sur investissement enregistré à l’étape 5.1 en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Plus, puis sur Ouvrir dans la liste qui s’affiche, puis sélectionnez le ROI enregistré.
    6. Mesurez l’intensité de fluorescence de cinq régions aléatoires dans une seule cellule en sélectionnant le retour sur investissement enregistré dans le gestionnaire de retour sur investissement et déplacez le retour sur investissement vers un emplacement aléatoire dans une cellule (Figure 3E). Mesurer l’intensité de fluorescence en appuyant sur M. Répétez cette étape avec quatre régions supplémentaires qui ne se chevauchent pas. Lorsqu’une boîte de dialogue avec les valeurs de surface et de gris moyen s’affiche (Figure 3F), copiez et collez les valeurs dans une feuille de calcul pour analyse.
      1. Expérience TMRE : Sélectionnez l’image (c = 2).
      2. Expérience MitoSOX : Sélectionnez l’image (c = 2).
    7. Obtenir les valeurs moyennes d’intensité de fluorescence. À l’aide d’un tableur (voir le tableau des matières), faites la moyenne des cinq valeurs moyennes de gris. Répétez ce processus pour chaque cellule.
    8. Analyser et comparer les valeurs moyennes de gris TMRE ou MitoSOX dans des conditions expérimentales à l’aide d’un logiciel statistique (voir le tableau des matériaux; Figure 4 et Figure 5). Présentez les données sous forme de graphiques à barres ou de tracés de violon.

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Résultats

Dans ce protocole, une quantification basée sur la fluorescence a été utilisée pour mesurer le potentiel membranaire et les niveaux de superoxyde du réseau mitochondrial après le traitement CCCP (Figure 1). Ce flux de travail utilisait des cellules HeLa, une lignée cellulaire immortalisée dérivée du cancer du col de l’utérus. Les cellules HeLa sont couramment utilisées pour étudier la biologie mitochondriale et sont relativement plates, ce qui facilite la visualisation du rés...

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Discussion

Le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale et les niveaux de superoxyde de manière robuste et reproductible à l’aide de l’imagerie basée sur la fluorescence30. Il y a d’importantes limites techniques à prendre en compte lors de la conception de ces expériences. Les cellules HeLa ont été transfectées avec un vecteur YFP vide, YFP-ParkinWT ou YFP-ParkinT240R. Le vecteur YFP vide a été utilisé co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Evans pour leurs commentaires réfléchis sur ce manuscrit. Ce travail est soutenu par Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars et Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La figure 1A a été réalisée à l’aide de BioRender.com.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) Sigma-AldrichC2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucoseGibco11-965-084
DMSO, AnhydrousThermoFisher ScientificD12345
Fetal Bovine SerumHycloneSH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)PromegaE2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) Gibco 35-050-061
Hoescht 33342ThermoFisher Scientific62249
MitoSOX  Red ThermoFisher ScientificM36008
MitoTracker Deep RedThermoFisher ScientificM7514
Opti-MEM (Redued Serum media)ThermoFisher scientific31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) ThermoFisher ScientificT669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty VectorN/AN/A
YFP-Parkin T240RThis PaperGenerated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WTAddgene; PMID:19029340RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe IllustratorAdobe Inc.https://www.adobe.com/products/illustrator(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)Microsoft Office https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)Leicahttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft ExcelMicrosoft Officehttps://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, UncoatedMatTekP35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)Okolabhttps://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted MicroscopeLeicaN/A
LIGHTNING Deconvolution SoftwareLeicaN/A
STELLARIS 8 confocal microscopeLeicaN/A

Références

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
  3. Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122 (5), 669-682 (2005).
  4. Tait, S. W. G., Green, D. R. Mitochondria and cell signalling. Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).
  5. Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation. Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).
  6. Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).
  7. Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects. Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).
  8. Ou, Z., et al. Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019. Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).
  9. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
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