Imagerie à long terme de populations neuronales identifiées à l’aide de microprismes chez des animaux se déplaçant librement et avec la tête fixe

Résumé

Lorsqu’elle est intégrée à une plaque de tête et à une conception optique compatible avec les microscopes à un ou deux photons, la lentille à microprisme présente un avantage significatif pour mesurer les réponses neuronales dans une colonne verticale dans diverses conditions, y compris des expériences bien contrôlées dans des états de tête fixe ou des tâches comportementales naturelles chez des animaux en mouvement libre.

Résumé

Avec les progrès de la microscopie multiphotonique et des technologies moléculaires, l’imagerie par fluorescence se développe rapidement pour devenir une approche puissante pour étudier la structure, la fonction et la plasticité des tissus cérébraux vivants. Par rapport à l’électrophysiologie conventionnelle, la microscopie à fluorescence peut capturer l’activité neuronale ainsi que la morphologie des cellules, permettant des enregistrements à long terme des populations de neurones identifiées à une résolution unicellulaire ou subcellulaire. Cependant, l’imagerie haute résolution nécessite généralement une configuration stable et fixe à la tête qui limite le mouvement de l’animal, et la préparation d’une surface plane en verre transparent permet de visualiser les neurones à un ou plusieurs plans horizontaux, mais est limitée dans l’étude des processus verticaux à différentes profondeurs. Ici, nous décrivons une procédure pour combiner une fixation de plaque de tête et un microprisme qui donne une imagerie multicouche et multimodale. Cette préparation chirurgicale donne non seulement accès à toute la colonne du cortex visuel de la souris, mais permet une imagerie à deux photons en position fixe de la tête et une imagerie à un photon dans un paradigme en mouvement libre. En utilisant cette approche, on peut échantillonner des populations cellulaires identifiées à travers différentes couches corticales, enregistrer leurs réponses sous des états fixes et mobiles et suivre les changements à long terme sur des mois. Ainsi, cette méthode fournit un test complet des microcircuits, permettant une comparaison directe des activités neuronales évoquées par des stimuli bien contrôlés et sous un paradigme comportemental naturel.

Introduction

L’avènement de l’imagerie fluorescente à deux photons in vivo ^1,2, combinant les nouvelles technologies des systèmes optiques et des indicateurs de fluorescence génétiquement modifiés, est devenu une technique puissante en neurosciences pour étudier la structure, la fonction et la plasticité complexes du cerveau vivant ^3,4. En particulier, cette modalité d’imagerie offre un avantage inégalé par rapport à l’électrophysiologie traditionnelle en capturant à la fois la morphologie et les activités dynamiques des neurones, facilitant ainsi le suivi à long terme....

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) en vertu de licences personnelles et de projets approuvées et délivrées par le ministère de l’Intérieur britannique après un examen éthique approprié. Lignées transgéniques adultes CaMKII-TTA ; GCaMP6S-TRE²¹ ont été élevés et leur progéniture a été utilisée dans l’expérience. Pour la sécurité des expérimentateurs et le maintien de conditions stériles, toutes les procédures ont été effectuées dans des conditions aseptiques et avec un équipement de protection individuelle complet.

1. Préparat....

Discussion

Ici, nous avons montré la capacité d’observer et de comparer directement les neurones dans des conditions de tête fixe et de mouvement libre dans les mêmes populations neuronales. Bien que nous ayons démontré l’application dans le cortex visuel, ce protocole peut être adapté à une multitude d’autres zones du cerveau, à la fois les zones corticales et les noyaux profonds 24,25,26,27,28, ainsi que d’autres configurations d’acquisition de données et comportementales

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml	Dechra	20091607	Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur	FST	18004-18	Drill bit
1ml syringe	Terumo	MDSS01SE	1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle	Terumo	NN-2316R	23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software	RWD	-	RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm)	Surgispon	SSP-101010	gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol	Braun	9160612	Alcohol pads
Aluminium foil	Any retailer	-	Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid	Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand	3525/25ML	ACSF
Automated microinjection pump	WPI	8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml	Videne/Ecolab	3030440	Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised)	Bruker	-	Two-photon imaging system
Cardiff Aldasorber	Vet-Tech	AN006	Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC	Nikon	MRH48230	20x objective lens
Compact Anaesthesia system - single gas - isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit	Vet-Tech	AN001	Compact anaesthesia system
Contec Prochlor	Aston Pharma	AP2111L1	Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25	Hikma	Covetrus:70789	Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel	Fine Science Tools	10055-12	Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars	Stoelting	51649	Ear bar
Dummy microscope	Inscopix	Dummy microscope	To help with implantation
Ethanol (100%)	VWR	40-1712-25	Used to make 70% ethanol
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III	FischerScientific	17182182	Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F	Harvard Apparatus	50-7222-F	Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software	ImageJ	-	Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS)	Inscopix	-	One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043	InSight	Insight Spectra X3	Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation	Zoetis	WM 42058/4195	Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive	World Precision Intruments (WPI)	KWIK-SIL	Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E	PROXXON	NO 28 515	Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package	Inscopix	-	One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit	Inscopix	ProView Implant Kit	Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment
ProView Prism Probe	Inscopix	1050-002203	Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml)	Zoetis	VM 42058/4123	Carprofen
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp	WPI	PZMTIII-AAC	Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical	Prestige-Dental	K058E	Adhesive cement
Two-photon calcium image software	Suite2P	-	Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser	Vet-Tech	-	Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g	Xailin-Night	MLG/28/1551	Ophthalmic ointment