Analyse automatisée optimisée de la modulation de l’homéostasie des mitochondries neuronales vivantes par des récepteurs d’acide rétinoïque spécifiques aux isoformes

Résumé

Le réseau mitochondrial est extrêmement complexe, ce qui le rend très difficile à analyser. Un nouvel outil MATLAB analyse les mitochondries confocales en direct dans des images timelapse, mais il en résulte un volume de sortie important nécessitant une attention manuelle individuelle. Pour résoudre ce problème, une optimisation de routine a été développée, permettant une analyse rapide des fichiers.

Résumé

Le réseau mitochondrial complexe rend très difficile la segmentation, le suivi et l’analyse des cellules vivantes. Les outils MATLAB permettent d’analyser les mitochondries dans les fichiers timelapse, ce qui simplifie et accélère considérablement le processus de traitement des images. Néanmoins, les outils existants produisent un grand volume de sortie, nécessitant une attention manuelle individuelle, et les configurations expérimentales de base ont une sortie de milliers de fichiers, chacun nécessitant une manipulation longue et fastidieuse.

Pour résoudre ces problèmes, une optimisation de routine a été développée, à la fois dans le code MATLAB et sous forme de live-script, permettant une analyse rapide des fichiers et réduisant considérablement la lecture des documents et le traitement des données. Avec une vitesse de 100 fichiers/min, l’optimisation permet une analyse globale rapide. L’optimisation permet d’obtenir les résultats obtenus en faisant la moyenne des données spécifiques à l’image pour les mitochondries individuelles sur des périodes de temps, en analysant les données d’une manière définie, cohérente avec les résultats des outils existants. L’imagerie confocale en direct a été réalisée à l’aide de l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine, et l’optimisation de routine a été validée en traitant les cellules neuronales avec des agonistes des récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR), dont les effets sur les mitochondries neuronales sont établis dans la littérature. Les résultats étaient cohérents avec la littérature et ont permis une caractérisation plus approfondie du comportement du réseau mitochondrial en réponse à la modulation RAR spécifique à l’isoforme.

Cette nouvelle méthodologie a permis une caractérisation rapide et validée du réseau de mitochondries des neurones entiers, mais elle permet également de différencier les mitochondries axonales et cellulaires, une caractéristique essentielle à appliquer dans le domaine des neurosciences. De plus, ce protocole peut être appliqué à des expériences utilisant des traitements à action rapide, permettant l’imagerie des mêmes cellules avant et après les traitements, transcendant le domaine des neurosciences.

Introduction

Les mitochondries cellulaires sont au centre de tous les états physiologiques, et une compréhension approfondie de leur homéostasie (mitostasie) et de leur comportement est primordiale pour aider à identifier le traitement pharmacologique d’un large éventail de maladies, y compris le cancer et la maladie d’Alzheimer ^1,2.

Les mitochondries jouent un rôle cellulaire crucial dans l’homéostasie énergétique, la génération d’ATP, le tampon du calcium et la régulation des ROS, et la mitostasie est essentielle au maintien de l’homéostasie des protéines car les chaperons moléculaires dépende....

Protocole

REMARQUE : Ce protocole comporte deux étapes principales : une étape de laboratoire humide, impliquant la culture cellulaire et la microscopie confocale vivante pour obtenir des images de mitochondries vivantes (Figure 1) et une étape in silico pour analyser les images obtenues (Figure 2). Pour l’analyse automatisée des données de mitochondries en 3D en direct, l’application MATLAB Mitometer a été utilisée comme fourni par Lefebvre et ^al.9. L’optimisation de routine est écrite dans MATLAB. Le logiciel, les versions mises à jour et le traitement des macros ImageJ sont disponibl....

Discussion

L’imagerie de cellules vivantes produit des fichiers volumineux qui nécessitent un traitement informatique sérieux, mais même les outils les plus récents nécessitent une saisie manuelle importante pour être traités. Cette optimisation de routine est axée sur la simplification du processus d’analyse des mitochondries sur le Mitomètre car cet outil présente un très bon équilibre entre l’entrée utilisateur et la sortie des données. Une comparaison complète entre différents outils d’analyse d’images.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AM580	Sigma-Aldrich	A8843
BDNF	Thermo-Fisher	RP8642
BMS493	Tocris Bioscience	3409
CD2314	Tocris Bioscience	3824
Ch55	Tocris Bioscience	2020
Foetal Bovine Serum	Thermo-Fisher	10270106
GraphPad Prism v4.0	GraphPad Software, La Jolla	n/a
Ham’s F12 Nutrient Mix	Thermo-Fisher	21765029
MATLAB R2022a	MathWorks	n/a
Minimal Essential Medium	Thermo-Fisher	31095
Nunc Glass Bottom Dishes	Thermo-Fisher	150680
Phosphate Buffer Saline Solution	Thermo-Fisher	28372
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
TMRM	Thermo-Fisher	T668
Zeiss LSM 510	Carl Zeiss	n/a	Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective