La culture à grande échelle de nématodes pour étudier leurs comportements collectifs

Résumé

Ici, un système est rapporté pour étudier les comportements collectifs des nématodes en les cultivant en vrac à l’aide d’un milieu de gélose pour chiens. Ce système permet aux chercheurs de propager un grand nombre de vers de Dauer et peut être appliqué à Caenorhabditis elegans et à d’autres espèces apparentées.

Résumé

Les animaux présentent des comportements collectifs dynamiques, comme on l’observe dans les volées d’oiseaux, les bancs de poissons et les foules d’humains. Les comportements collectifs des animaux ont été étudiés dans les domaines de la biologie et de la physique. En laboratoire, les chercheurs ont utilisé divers animaux modèles tels que la mouche des fruits et le poisson-zèbre pendant environ un siècle, mais l’étude du comportement collectif complexe à grande échelle orchestré par ces animaux modèles génétiquement traitables est restée un défi majeur. Cet article présente un protocole pour créer un système expérimental de comportements collectifs chez Caenorhabditis elegans. Les vers propagés grimpent sur le couvercle de la plaque de Petri et montrent un comportement d’essaimage collectif. Le système contrôle également les interactions et les comportements des vers en modifiant l’humidité et la stimulation lumineuse. Ce système nous permet d’examiner les mécanismes sous-jacents aux comportements collectifs en modifiant les conditions environnementales et en examinant les effets de la locomotion au niveau individuel sur les comportements collectifs à l’aide de mutants. Ainsi, le système est utile pour les recherches futures en physique et en biologie.

Introduction

Les non-scientifiques et les scientifiques sont fascinés par les comportements collectifs des animaux, comme les volées d’oiseaux et les bancs de poissons. Les comportements collectifs ont été analysés dans un large éventail de domaines, notamment la physique, la biologie, les mathématiques et la robotique. En particulier, la physique de la matière active est un domaine de recherche en pleine expansion qui se concentre sur les systèmes composés d’éléments autopropulsés, c’est-à-dire les systèmes dissipatifs, tels que les volées d’oiseaux, les bancs de poissons, les biofilms de bactéries mobiles, les cytosquelettes composés de molécules actives et les groupes de colloïdes autopropulsés. La théorie de la physique de la matière active soutient que, quelle que soit la complexité des comportements des individus, les mouvements collectifs d’un grand nombre d’êtres vivants sont régis par un petit nombre de règles simples. Par exemple, le modèle de Vicsek, candidat pour une description unifiée du mouvement collectif des particules autopropulsées, prédit que l’interaction d’alignement à courte portée des objets en mouvement est nécessaire pour former une phase ordonnée à longue portée avec une fluctuation excentrique en 2D, comme dans les troupeaux d’animaux¹. Les approches expérimentales descendantes relatives à la physique de la matière active se développent rapidement. Des expériences antérieures ont confirmé la formation d’une phase ordonnée à longue portée chez Escherichia coli². D’autres travaux récents ont utilisé des cellules ^3,4, des bactéries⁵, des colloïdes mobiles⁶ ou des protéines mobiles ^7,8. Des modèles minimaux simples tels que le modèle de Vicsek ont décrit avec succès ces phénomènes réels. Contrairement à ces systèmes expérimentaux unicellulaires, les comportements collectifs des animaux sont généralement observés dans la nature, car personne ne pouvait espérer effectuer des expériences contrôlées avec 10 000 oiseaux ou poissons réels.

Les biologistes partagent le même intérêt que les physiciens : comment les individus interagissent les uns avec les autres et se comportent fonctionnellement en tant que groupe. L’un des domaines de recherche traditionnels pour analyser le comportement individuel est la neuroscience, dans laquelle les mécanismes sous-jacents au comportement ont été examinés aux niveaux neuronal et moléculaire. De nombreuses approches neuroscientifiques ascendantes ont été développées jusqu’à présent. Les approches descendantes en physique et ascendantes en biologie peuvent être facilitées en utilisant des animaux modèles tels que la mouche des fruits, le ver Caenorhabditis elegans et la souris⁹. Cependant, il y a eu peu de résultats sur le comportement collectif à grande échelle de ces animaux modèles en laboratoire¹⁰ ; Il est encore difficile de préparer des animaux modèles génétiquement traitables à grande échelle en laboratoire. Par conséquent, dans les recherches actuelles sur les comportements collectifs en biologie et en physique, il a été difficile pour les scientifiques qui font habituellement de la recherche en laboratoire d’étudier les comportements collectifs des animaux.

Dans cette étude, nous avons établi une méthode de culture à grande échelle de nématodes pour étudier leurs comportements collectifs. Ce système nous permet de modifier les conditions environnementales et d’examiner l’effet de la locomotion au niveau individuel sur les comportements collectifs à l’aide de mutants¹⁰. En physique de la matière active, les paramètres du modèle mathématique peuvent être contrôlés à la fois dans des expériences et des simulations, ce qui permet de vérifier ce modèle pour identifier des descriptions unifiées. La génétique est utilisée pour comprendre le mécanisme des circuits neuronaux sous-jacents au comportement collectif¹¹.

Protocole

1. Préparation des vers

NOTE : Préparer la souche¹² et la souche ZX899 de type sauvage N2 Bristol (lite-1(ce314) ; ljIs123[mec-4p ::ChR2, unc-122p ::RFP])¹³ pour l’observation des comportements collectifs et des expériences optogénétiques, respectivement. Maintenez la souche ZX899 dans des conditions sombres.

1. Déposer quatre vers adultes bien nourris sur une plaque de 60 mm contenant 14 mL de milieu de croissance des nématodes (NGM) avec gélose et ensemencée avec E. coli OP50¹².
2. Cultivez les vers F1 jusqu’à ce qu’ils meurent de faim dans la plaque NGM à 23 °C pendant 7 jours. Le rendement des vers F1 est d’environ 100 vers par plaque à ce stade. Les stades des vers comprennent une population mixte de larves de Dauer et de larves L1 affamées.

2. Préparation des plaques moyennes de gélose alimentaire pour chiens (DFA)

1. Autoclavez une bouteille en verre contenant 2 g de nourriture en poudre pour chiens et 5 mL de milieu gélosé à 1 % et refroidissez-la à température ambiante (figure 1A).
   REMARQUE : D’autres aliments pour chiens de différents fabricants peuvent être utilisés dans cette expérience.

3. Inoculation des vers aux plaques moyennes DFA

1. Transférez de petites quantités (environ 0,5 g) de milieu DFA au centre d’une plaque NGM ensemencée avec E. coli OP50 (figure 1B). Pour les expériences optogénétiques, verser 40 μL de 50 μM de 50 μM tout-trans-rétinien, le cofacteur de la rhodopsine 2 du canal, sur le DFA avant l’inoculation des vers.
2. Prélevez les vers affamés sur quatre plaques NGM à l’aide d’eau autoclave.
3. Placez un petit fragment de nourriture pour chien (environ 0,5 g) sur le milieu DFA, à environ 2 mm du couvercle de l’assiette.
4. Illuminez la plaque NGM avec une lumière ultraviolette pendant 15 minutes à l’intérieur d’un banc propre pour éviter toute contamination.
5. Inoculer les vers collectés (environ 400 vers) sur le milieu DFA sur des plaques NGM. Ne scellez pas la plaque avec du parafilm pour éviter d’augmenter l’humidité à l’intérieur de la plaque de Petri et de générer des gouttelettes d’eau qui piègent les vers sur un couvercle.
6. Propagez les vers à 23 °C et laissez-les grimper jusqu’au couvercle de la plaque pendant environ 10 à 14 jours.
   REMARQUE : Comme le nombre de vers sur les couvercles n’a guère augmenté après 10 à 14 jours, on a supposé que les vers étaient probablement à court de nourriture.

4. Observation du comportement collectif

1. Le jour de l’expérience, placez une nouvelle plaque NGM qui ne contenait pas de milieu gélosé E. coli et d’aliments pour chiens sur une plaque d’aluminium sur la platine d’un microscope macro zoom (Figure 2A). Maintenez le fond de cette nouvelle plaque NGM à 23 °C à l’aide d’un régulateur de température Peltier pendant au moins 5 min (Figure 2B). Ensuite, remplacez le couvercle de cette nouvelle plaque NGM par le couvercle de la plaque sur laquelle les vers ont grimpé. Utilisez l’objectif (x2, NA = 0,5) comme objectif à faible grossissement (Figure 2A).
2. Augmenter la température du fond de la plaque de Petri de 23 °C à 26 °C pour modifier l’humidité à l’intérieur de cette plaque (Figure 2).
3. Acquérir des images de la surface intérieure du couvercle de la plaque avec la caméra à 20 images s⁻¹ (vidéo supplémentaire S1).
4. Enregistrez les images acquises au format Fichier image balisé.

5. Expérience optogénétique

1. Utilisez une lampe au mercure de 100 W pour diffuser de la lumière bleue, filtrée avec un jeu de filtres. Contrôlez le temps d’éclairage avec précision à l’aide d’un système d’obturateur électromagnétique (Figure 2B).
2. Maintenez le ZX899 sur DFA dans ces conditions pendant 5 min avant l’allumage par lumière bleue.
3. Illuminez les vers ZX899 fixés au couvercle d’une plaque de Petri sur la platine du microscope maintenue à 23 °C.
4. Acquérir des images de la surface intérieure du couvercle de la plaque avec une caméra à 20 images s⁻¹ (vidéo supplémentaire S2).

Résultats

Ici, des vers de Dauer de type sauvage ont été utilisés pour des observations collectives du comportement. Les vers ont été cultivés à 23 °C pendant environ 10 à 14 jours et ont grimpé jusqu’à la surface intérieure du couvercle d’une plaque moyenne DFA. Le jour expérimental, seul le couvercle a été transféré sur une nouvelle plaque NGM sans E. coli ni milieu DFA. Le fond de cette plaque de Petri a d’abord été maintenu à 23 °C à l’aide du système Peltier, puis sa température a ét?...

Discussion

Dans cette étude, nous montrons un protocole pour préparer un système pour le comportement collectif à grande échelle de C. elegans en laboratoire. La méthode basée sur l’AFD a été établie à l’origine avec Caenorhabditis japonica¹⁴ et Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, qui sont tous deux des animaux non modèles. Cependant, cette méthode n’a pas été appliquée pour étudier les comportements collectifs. Le C. elegans e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition