Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus

Résumé

Ici, nous présentons une méthode de purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus qui est simple, peu coûteuse et efficace.

Résumé

L’enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE) est un nouvel agent fibrinolytique qui peut à la fois activer le plasminogène en plasmine et dégrader directement la fibrine, montrant de grands avantages par rapport aux agents thrombolytiques traditionnels. Cependant, en raison du manque d’informations structurelles, tous les programmes de purification de la sFE sont basés sur des purifications chromatographiques en plusieurs étapes, trop compliquées et coûteuses. Ici, un protocole de purification d’affinité de sFE est développé pour la première fois basé sur une structure cristalline de sFE; il comprend la préparation de l’échantillon brut et de la colonne de chromatographie d’affinité matricielle lysine/arginine-agarose, la purification par affinité et la caractérisation de la sFE purifiée. En suivant ce protocole, un lot de sFE peut être purifié en 1 jour. De plus, la pureté et l’activité de la sFE purifiée augmentent à 92% et 19 200 U/mL, respectivement. Il s’agit donc d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification de la sFE. Le développement de ce protocole est d’une grande importance pour l’utilisation ultérieure de la sFE et d’autres agents similaires.

Introduction

La thrombose est une menace majeure pour la santé publique, en particulier suite à la pandémie mondiale de Covid-19 ^1,2. Cliniquement, de nombreux activateurs du plasminogène (AP), tels que l’activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) et l’urokinase (Royaume-Uni), ont été largement utilisés comme médicaments thrombolytiques. Les AP peuvent activer le plasminogène des patients en plasmine active pour dégrader la fibrine. Ainsi, leur efficacité thrombolytique est fortement limitée par le statut plasminogène^{des patients 3,4}. Les agents fibrinolyt....

Protocole

1. Préparation

1. Traitement des échantillons
   1. Disséquer soigneusement S. nudus frais (100 g) et recueillir l’intestin et son liquide interne.
   2. Ajouter 300 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) pour l’homogénéisation (1 000 tr/min, 60 s).
   3. Congeler-décongeler l’homogénat 3x.
   4. Centrifuger l’échantillon (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) et prélever le surnageant. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
2. Précipitation des protéines
   1. Mélanger le surnageant avec une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes) et laisser reposer le mélange pendant....

Discussion

En raison de l’indisponibilité de la séquence génétique exacte de la sFE, la sFE actuellement utilisée a été extraite de S. nudus¹⁴ frais. De plus, les procédures de purification de la sFE rapportées dans la littérature étaient compliquées et coûteuses, car elles étaient basées sur certaines caractéristiques générales de la sFE, telles que le poids moléculaire, le point isoélectrique, la force ionique et la polarité^15,16

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)	Biosharp
2-Mercaptoethanol	Solarbio
Agarose G-10	Biowest
Ammonium persulfate	SINOPHARM
Ammonium sulfate	SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B	Solarbio	Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB)	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
Fibrinogen	Merck
Glycine	Solarbio
Hydrochloric acid	SINOPHARM
Kinase	RHAWN
Lysine-Sepharose 4B	Solarbio	Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)	Beyotime
Sodium chloride	SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)	Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide	SINOPHARM
Thrombin	Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane	Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride	Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure	GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750	SANYO
Chemiluminescence Imaging System	GE
Constant Flow Pump BT-100	QITE
Constant Temperature Incubator	JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS	SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD	SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II	SCIENTZ
Electronic Analytical Balance	DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12	SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker	Kylin-Bell
Ice Machine AF 103	Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner	ShuMei
Magnetic Stirrer	Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W	Cence
Microwave Oven	Galanz
Milli-Q Reference	Millipore
Pipettor	Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter	Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System	Bio-Rad
Consumable Material
200 µL PCR Tube (200 µL)	Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL)	Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL)	NEST
Centrifuge Tube (7 mL)	Biosharp
Culture Dish (60 mm)	NEST
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP
Parafilm	Bemis
Pipette Tip (1 mL )	KIRGEN
Pipette Tip (10 µL)	Axygene
Pipette Tip (200 µL)	Axygene
Special Indicator Paper	TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)	Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)	Millipore
Universal pH Indicator	SSS Reagent