Microscopie à deux photons sensible à la polarisation pour une caractérisation de la structure amyloïde sans marquage

Résumé

Cet article décrit comment la microscopie à deux photons sensible à la polarisation pourrait être appliquée pour caractériser l’organisation locale au sein de superstructures-sphérolites amyloïdes sans marquage. Il décrit également comment préparer et mesurer l’échantillon, assembler la configuration requise et analyser les données pour obtenir des informations sur l’organisation locale des fibrilles amyloïdes.

Résumé

Par rapport à son homologue à un photon, l’excitation à deux photons est bénéfique pour les expériences de bio-imagerie en raison de sa phototoxicité plus faible, de sa pénétration tissulaire plus profonde, de son fonctionnement efficace dans les systèmes densément emballés et de la photosélection angulaire réduite des fluorophores. Ainsi, l’introduction de l’analyse de polarisation en microscopie à fluorescence à deux photons (2PFM) permet une détermination plus précise de l’organisation moléculaire d’un échantillon par rapport aux méthodes d’imagerie standard basées sur des processus optiques linéaires. Dans ce travail, nous nous concentrons sur la 2PFM sensible à la polarisation (ps-2PFM) et son application dans la détermination de l’ordre moléculaire au sein de bio-structures complexes-sphérolites amyloïdes. Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson sont souvent diagnostiquées par la détection d’agrégats amyloïdes-protéines formés en raison d’un processus de mauvais repliement des protéines. L’exploration de leur structure permet de mieux comprendre leur parcours de création et, par conséquent, de développer des méthodes de diagnostic plus sensibles. Cet article présente le ps-2PFM adapté à la détermination de l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des sphérulites d’insuline bovine et des agrégats de protéines amyloïdogènes sphériques. De plus, nous démontrons que la technique proposée permet de résoudre l’organisation tridimensionnelle des fibrilles à l’intérieur de la spherulite.

Introduction

Au cours des dernières décennies, bien qu’il y ait eu un développement significatif de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence pour la bio-imagerie des protéines et de leurs agrégats¹, seules quelques-unes ont été utilisées pour résoudre leur ordre local au sein de l’échantillon ^2,3. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence⁴ a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité structurale intrinsèque des superstructures-sphérolites amyloïdes. De plus, la détermination quantitative de l’ordre local à l’intérieur de biostructures complexes et den....

Protocole

1. Préparation des lames de microscope avec des sphérulites adultes

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole. Toutes les solutions ont été préparées avec de l’eau déminéralisée (18,2 MΩ·cm à 25 °C) obtenue à partir du système de purification de l’eau.

1. Incuber les sphérulites amyloïdes selon le protocole décrit par Krebs et al¹⁶. avec quelques modifications, comme décrit ci-dessous.
   1. Peser 10 mg d’insuline en poudre dans un tube de 1,5 ml.
   2. Dissoudre la po....

Discussion

La microscopie à deux photons sensible à la polarisation est un outil précieux pour étudier l’ordre local des fibrilles à l’intérieur des superstructures amyloïdes, ne nécessitant que de petites modifications de la configuration multiphotonique standard. Puisqu’il fonctionne sur des phénomènes optiques non linéaires, il est possible d’obtenir une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée par rapport aux méthodes de microscopie à fluorescence excitée par un photon. De .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5