Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites

Résumé

Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.

Résumé

Les organoïdes rénaux peuvent être générés à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) par diverses approches. Ces organoïdes sont très prometteurs pour la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et les applications thérapeutiques potentielles. Cet article présente une procédure étape par étape pour créer des organoïdes rénaux à partir de cellules iPS, en commençant par la strie primitive postérieure (PS) jusqu’au mésoderme intermédiaire (IM). L’approche s’appuie sur le milieu APEL 2, qui est un milieu défini, sans composant animal. Il est complété par une forte concentration d’agoniste WNT (CHIR99021) pendant une durée de 4 jours, suivie d’un facteur de croissance des fibroblastes 9 (FGF9)/héparine et d’une faible concentration de CHIR99021 pendant 3 jours supplémentaires. Au cours de ce processus, l’accent est mis sur la sélection de la densité cellulaire et de la concentration de CHIR99021 optimales au début des CSPi, car ces facteurs sont essentiels à la réussite de la génération d’organoïdes rénaux. Un aspect important de ce protocole est la culture en suspension dans une plaque peu adhérente, permettant à l’IM de se développer progressivement en structures néphroniques, englobant des structures tubulaires glomérulaires, tubulaires proximales et distales, le tout présenté dans un format visuellement compréhensible. Dans l’ensemble, ce protocole détaillé offre une technique efficace et spécifique pour produire des organoïdes rénaux à partir de diverses cellules iPS, garantissant des résultats réussis et cohérents.

Introduction

Le rein joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie physiologique, en fonction de son unité fonctionnelle. Les néphrons, qui excrètent les déchets, peuvent réguler la composition des fluides corporels. L’insuffisance rénale chronique (IRC), causée par des mutations héréditaires ou d’autres facteurs de risque élevés, évoluera éventuellement vers une insuffisance rénale terminale (ESKD)^1,2. L’ESKD est apparemment due à la capacité de régénération limitée des néphrons. Ainsi, un traitement de remplacement rénal est nécessaire. La différenciation dirigée des cellules iPS humaines permet la génération ....

Protocole

Les cellules iPS utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues auprès d’une source commerciale. Les cellules ont été maintenues avec du milieu mTeSR sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Le tableau 1 contient toutes les compositions de milieux utilisées dans l’étude.

1. Placage des cellules iPS pour la différenciation et l’induction d’une strie primitive postérieure (PS)

1. Laver les cellules iPS sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire avec 2 mL de DPBS. Aspirez le DPBS....

Discussion

Un protocole détaillé a été décrit pour générer des organoïdes rénaux à partir de CSPi, impliquant des modifications mineures du milieu basal, de la densité cellulaire initiale et de la concentration de CHIR99021. Dans diverses expériences, les facteurs critiques pour une génération réussie d’organoïdes rénaux se sont avérés être la différenciation initiale du mésoderme intermédiaire (IM) et l’état cellulaire au jour 7. De plus, différentes lignées de CSPi présentaient des variations dans l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304