Micro-injection d’un rétrovirus RCAS(A) recombinant dans une lentille embryonnaire de poulet

Résumé

Cet article de protocole décrit la méthodologie de micro-injection embryonnaire d’un rétrovirus RCAS(A) dans le cristallin de poulet en tant qu’outil pour étudier in situ la fonction et l’expression des protéines au cours du développement du cristallin.

Résumé

Le poulet embryonnaire (Gallus domesticus) est un modèle animal bien établi pour l’étude du développement et de la physiologie du cristallin, étant donné son haut degré de similitude avec le cristallin humain. Le RCAS(A) est un rétrovirus de poulet compétent pour la réplication qui infecte les cellules en division, ce qui constitue un outil puissant pour étudier l’expression et la fonction in situ des protéines de type sauvage et mutantes au cours du développement du cristallin par micro-injection dans la lumière vide de la vésicule du cristallin aux premiers stades du développement, limitant son action aux cellules proliférantes environnantes. Par rapport à d’autres approches, telles que les modèles transgéniques et les cultures ex vivo , l’utilisation d’un rétrovirus aviaire compétent pour la réplication RCAS(A) fournit un système très efficace, rapide et personnalisable pour exprimer des protéines exogènes dans les embryons de poussins. Plus précisément, le transfert ciblé de gènes peut être confiné aux cellules prolifératives de la fibre du cristallin sans avoir besoin de promoteurs spécifiques aux tissus. Dans cet article, nous allons brièvement passer en revue les étapes nécessaires à la préparation du RCAS(A) du rétrovirus recombinant, fournir un aperçu détaillé et complet de la procédure de micro-injection et fournir des exemples de résultats de la technique.

Introduction

L’objectif de ce protocole est de décrire la méthodologie de micro-injection embryonnaire de lentilles de poulet d’un RCAS(A) (sarcome aviaire compétent pour la réplication/leucose rétrovirale A). L’administration rétrovirale efficace dans un cristallin embryonnaire de poulet s’est avérée être un outil prometteur pour l’étude in vivo du mécanisme moléculaire et de la structure-fonction des protéines du cristallin dans la physiologie, les conditions pathologiques et le développement normaux du cristallin. De plus, ce modèle expérimental pourrait être utilisé pour l’identification de cibles thérapeutiques et le criblage de médicaments pour des affections telles....

Protocole

Cette étude a été menée conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et au Règlement d’application sur le bien-être des animaux, conformément aux principes du Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio. Pour obtenir une vue d’ensemble du protocole, reportez-vous à la figure 1 ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce prot....

Discussion

Ce modèle expérimental offre la possibilité d’exprimer la ou les protéines d’intérêt dans le cristallin intact, ce qui conduit à l’étude de la pertinence fonctionnelle de ces protéines dans la structure et la fonction du cristallin. Le modèle de micro-injection embryonnaire de poussin est basé en partie sur les travaux de Fekete et. ^al.6 et a été développé par Jiang et. ^al.8 et a été utilisé comme moyen d’insérer à la fois des plasmides viraux et.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette