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Résumé

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

Résumé

Les voies de signalisation orchestrent les processus biologiques fondamentaux, notamment le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Des méthodes de manipulation expérimentale de la signalisation sont nécessaires pour comprendre comment la signalisation est interprétée dans ces contextes très variés. Les outils d’optogénétique moléculaire peuvent fournir des manipulations réversibles et ajustables de l’activité des voies de signalisation avec un degré élevé de contrôle spatio-temporel et ont été appliqués in vitro, ex vivo et in vivo. Ces outils couplent des domaines protéiques sensibles à la lumière, tels que le domaine LOV (Light-Oxygen-Voltage Sensing) homodimérisant la lumière bleue, avec des effecteurs de signalisation pour conférer un contrôle expérimental dépendant de la lumière sur la signalisation. Ce protocole fournit des lignes directrices pratiques pour l’utilisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) basée sur LOV et des activateurs de signalisation nodale bOpto-BMP et bOpto-Nodal dans l’embryon de poisson-zèbre précoce optiquement accessible. Il décrit deux expériences de contrôle : un test phénotypique rapide pour déterminer les conditions expérimentales appropriées, et un test d’immunofluorescence pour évaluer directement la signalisation. Ensemble, ces expériences de contrôle peuvent aider à établir un pipeline pour l’utilisation d’outils optogénétiques dans les embryons précoces de poisson-zèbre. Ces stratégies fournissent une plate-forme puissante pour étudier les rôles de la signalisation dans le développement, la santé et la physiologie.

Introduction

Les voies de signalisation permettent aux cellules de répondre à leur environnement et de coordonner leurs activités à l’échelle des tissus et de l’organisme. Les signaux cruciaux pour le développement embryonnaire comprennent la protéine morphogénétique osseuse (BMP) des membres de la superfamille TGF-bêta et le nodal 1,2,3. Au cours de l’embryogenèse, les voies régulées par ces signaux et d’autres façonnent le plan corporel en contrôlant l’expression des gènes et des processus supplémentaires pour s’assurer que divers tissus et organes se développent et interagissent correctement. Des pathologies, y compris des malformations congénitales et des cancers, peuvent survenir lorsque la signalisation ou les réponses à la signalisation sont perturbées 4,5,6,7. Malgré des recherches rigoureuses sur la signalisation, il reste encore beaucoup à découvrir sur la façon dont les niveaux et la dynamique sont décodés dans une variété de contextes 8,9,10,11, en particulier au cours du développement 12,13,14,15,16,17,18,19.

Pour comprendre comment la signalisation est décodée, une expérience idéale serait de manipuler les niveaux de signalisation, le timing et/ou la dynamique - avec un degré élevé de contrôle spatial et temporel - et d’évaluer les résultats. Par exemple, des gradients de signalisation spatiale précis sont proposés pour modeler les tissus en développement20,21. La modification des distributions spatiales des gradients de signalisation permettrait de tester cette hypothèse22. De plus, l’importance de la dynamique de signalisation dans la génération de diverses réponses cellulaires devient de plus en plus claire : la même voie de signalisation peut ordonner aux cellules de se différencier ou de proliférer en fonction de la fréquence de signalisation, par exemple 9,23. Les paradigmes expérimentaux dans lesquels la dynamique de signalisation peut être facilement manipulée seront précieux pour explorer la relation entre la dynamique et les décisions de destin cellulaire 8,12,13,14,15.

Historiquement, de multiples méthodes ont été utilisées pour manipuler la signalisation dans des contextes de développement, ce qui a conduit à des découvertes fondamentales 1,2,3. La signalisation peut être bloquée à l’aide de mutants de perte de fonction de la voie, d’expression d’inhibiteurs ectopiques ou de médicaments antagonistes. Les méthodes d’activation de la signalisation comprennent les médicaments agonistes, les ligands recombinants, l’expression ectopique de ligands ou de récepteurs constitutivement actifs, et les mutants inhibiteurs de la voie de la perte de fonction. Ces méthodes s’inscrivent dans un continuum de contrôle expérimental. Par exemple, les mutants et l’expression ectopique peuvent se situer du côté du marteau du continuum : avec ces approches, des changements systémiques spectaculaires dans l’activité des voies peuvent entraîner une mort précoce et empêcher les investigations à des stades ultérieurs, ou avec le temps, peuvent entraîner des effets pléiotropes difficiles à démêler. De plus, il est souvent difficile de manipuler indépendamment une caractéristique de signalisation à la fois, comme le niveau ou la durée. À l’autre extrémité du continuum, certaines méthodes offrent un contrôle expérimental plus précis, comme les dispositifs microfluidiques qui exposent les échantillons à des médicaments ou à des protéines recombinantes avec un contrôle temporel et parfois spatial 18,24,25, ou des méthodes génétiques, y compris des promoteurs inductibles par choc thermique et spécifiques aux tissus qui peuvent offrir des avantages similaires16,26,27. Cependant, ces méthodes peuvent être difficiles à exécuter, peuvent ne pas être réversibles, peuvent avoir une cinétique relativement lente ou une résolution médiocre, et peuvent ne pas être disponibles dans certains systèmes modèles.

Les approches optogénétiques moléculaires sont un ajout puissant à cette boîte à outils. Ces approches utilisent des protéines qui répondent à différentes longueurs d’onde de la lumière pour manipuler les processus biologiques, y compris la signalisation 8,12,13,14,15, et ont été développées au fil des décennies pour être utilisées dans une variété de systèmes, de la culture cellulaire aux animaux entiers 12,13,28. Par rapport aux approches historiques, l’optogénétique moléculaire peut souvent offrir un degré plus élevé de contrôle spatio-temporel sur les processus biologiques : le contrôleur dans les systèmes optogénétiques est la lumière, et le contrôle de la longueur d’onde, de l’intensité, de la durée et de la fréquence d’exposition de la lumière est relativement simple. Avec des systèmes sophistiqués tels que les microscopes confocaux et à deux photons, le contrôle spatial dans le domaine subcellulaire est possible 29,30,31. Des outils de manipulation optogénétique de la signalisation ont été développés et appliqués dans plusieurs systèmes, y compris ceux décrits dans Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33, et Huang et al.34. Par exemple, en exploitant le contrôle spatial offert par l’optogénétique, cette stratégie a récemment été utilisée pour modifier un gradient de signalisation chez les embryons de drosophile, démontrant que l’embryogenèse de la mouche est étonnamment robuste aux changements de ce gradient22. La réversibilité et la cinétique marche/arrêt rapide des activateurs de signalisation optogénétique en ont également fait des outils attrayants pour étudier le décodage de la dynamique de signalisation 8,12,13,14,15,34,35,36.

L’embryon précoce de poisson-zèbre est un système in vivo bien adapté aux études optogénétiques car il est fécondé de l’extérieur, transparent, adapté à la microscopie et génétiquement traitable. L’exposition à la lumière est plus facile à administrer aux embryons qui se développent à l’extérieur de la mère, la lumière peut pénétrer et accéder à leurs tissus non opaques, les embryons de poissons-zèbres vivants tolèrent bien l’imagerie (en plus d’être transparents), et les méthodes génétiques existantes offrent des possibilités simples pour des expériences d’inversion et de surexpression, en plus du développement de transgéniques utiles37.

Récemment, des outils optogénétiques ont été développés pour activer la signalisation BMP38 et Nodale39 chez les embryons de poisson-zèbre exposés à la lumière bleue (Figure 1). Nous appelons ces outils bOpto-BMP et bOpto-Nodal (b pour activé par la lumière bleue et Opto pour optogénétique). bOpto-BMP/Nodal sont basés sur des mécanismes d’activation de voies similaires. La liaison des ligands BMP ou Nodal à leurs récepteurs respectifs, les sérine-thréonine kinases, entraîne des interactions entre les domaines récepteurs kinases qui conduisent à la phosphorylation des effecteurs de signalisation (Smad1/5/9 pour BMP et Smad2/3 pour Nodal). Les effecteurs de signalisation phosphorylés se transloquent ensuite vers le noyau et régulent l’expression du gène cible3 (Figure 1A,D). Ces interactions récepteurs kinases peuvent être rendues sensibles à la lumière en couplant des récepteurs kinases à des protéines dimérisant sensibles à la lumière : Avec l’exposition à la lumière, ces protéines chimériques devraient se dimériser, provoquant l’interaction des domaines récepteurs kinases et l’activation de la signalisation (Figure 1B, C, E, F). Il est important de noter que, contrairement aux récepteurs endogènes, les bOpto-BMP/Nodal ne contiennent pas de domaines de liaison au ligand extracellulaire, ce qui garantit une activité indépendante du ligand (Figure 1C,F). Cette stratégie d’activation optogénétique a d’abord été réalisée avec les récepteurs tyrosine kinases40,41,42, puis appliquée aux récepteurs sérine-thréonine kinases.

bOpto-BMP/Nodal utilisent le domaine de détection de la lumière-oxygène-tension homodimérisante (LOV) sensible à la lumière bleue (~450 nm) de la protéine AUREO1 (VfLOV) de l’algue Vaucheria fridiga (VfLOV)43,44. Ces constructions consistent en un motif de myristoylation ciblant la membrane suivi de domaines BMP ou nodal receptor kinase, fusionnés à un domaine LOV (Figure 1B,E). L’exposition à la lumière bleue devrait provoquer l’homodimérisation de LOV, ce qui entraîne des interactions entre les domaines récepteurs kinases qui conduisent à la phosphorylation respective de Smad et à l’activation de la voie (Figure 1C,F). Pour bOpto-BMP, une combinaison de constructions avec les domaines kinases du récepteur de type I d’Acvr1l (également connu sous le nom d’Alk8) et BMPR1aa (également connu sous le nom d’Alk3) et le domaine kinase du récepteur de type II de BMPR2a s’est avérée activer de manière optimale la signalisation38 (Addgene #207614, #207615 et #207616). Pour bOpto-Nodal, une combinaison de constructions avec le domaine kinase récepteur de type I d’Acvr1ba et le domaine kinase récepteur de type II d’Acvr2ba est utilisée39.

Les bOpto-BMP/Nodal ont été introduits dans les embryons précoces de poisson-zèbre en injectant de l’ARNm au stade unicellulaire, et utilisés pour étudier le rôle de la durée de signalisation dans l’interprétation nodale39, pour déterminer pourquoi le poisson-zèbre perd la capacité de répondre au nœud45 et pour examiner comment les gènes cibles BMP répondent à différents niveaux de signalisation BMP38. Il est probable que ces outils continueront d’être utiles dans un large éventail d’enquêtes futures. Cependant, la force des activateurs de signalisation optogénétique est aussi leur faiblesse : les échantillons sensibles à la lumière doivent être traités avec soin pour éviter toute activité de signalisation ectopique par inadvertance. L’exposition à la lumière ambiante ou à la lumière du soleil peut activer bOpto-BMP/Nodal.

Ce protocole fournit des suggestions pratiques pour l’utilisation d’activateurs BMP et nodaux à base de LOV codés par l’ARNm dans les embryons précoces de poisson-zèbre. Il commence par détailler une stratégie de construction d’un caisson lumineux pour contrôler l’exposition à la lumière et la température uniformes (figure 2, fichier supplémentaire 1, fichier supplémentaire 2, fichier supplémentaire 3, fichier supplémentaire 4, fichier supplémentaire 5, fichier supplémentaire 6, fichier supplémentaire 7, fichier supplémentaire 8). Il décrit ensuite deux expériences de contrôle clés qui déterminent si un activateur de signalisation optogénétique se comporte comme prévu, c’est-à-dire qu’il n’active l’activité de la voie que lorsqu’il est exposé à la lumière (Figure 3). Le premier essai de contrôle consiste à examiner les phénotypes un jour après la fécondation chez des embryons exposés à la lumière et non exposés (Figure 3A). Les embryons exposés à la lumière injectés à l’ARNm, mais pas les embryons non exposés, doivent phénocopier la BMP ou la surexpression nodale (Figure 4A,B ; Les phénotypes BMP en particulier se distinguent clairement à ce stade46). Ce test fournit une lecture rapide de l’activité. Dans le deuxième essai de contrôle, afin de déterminer si les phénotypes sont causés spécifiquement par un excès de BMP ou de signalisation nodale et d’observer directement le changement des niveaux de signalisation, la coloration par immunofluorescence est utilisée pour détecter les effecteurs de signalisation phosphorylés (pSmad1/5/9 ou pSmad2/3, respectivement) après une exposition à la lumière de 20 min autour de la fin de la blastula / début de la gastrulation, lorsque l’activité de signalisation a été bien décrite12, 16,17,47,48,49,50 (Figure 3B et Figure 4C). (Notez que, bien que l’activation localisée dans l’espace ait été démontrée pour bOpto-BMP38 et bOpto-Nodal39, ce protocole ne décrit que des stratégies d’exposition uniforme à la lumière et d’activation de la signalisation.) Il est conseillé d’exécuter ces expériences de contrôle avant d’appliquer bOpto-BMP/Nodal à des questions de recherche spécifiques afin de déterminer les conditions expérimentales locales idéales.

Protocole

Les protocoles de recherche sur le poisson-zèbre ont été examinés et approuvés par le comité de protection et d’utilisation des animaux du NICHD des National Institutes of Health (ASP 21-008). Toutes les études sur le poisson-zèbre ont été réalisées conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Construire un caisson lumineux

  1. Pour contrôler l’exposition à la lumière et la température, construisez une boîte à lumière qui utilise un illuminateur à microplaques à diodes électroluminescentes (DEL) comme source lumineuse (figure 2A, tableau des matériaux, fichier supplémentaire 1 , fichier supplémentaire 2). Cet illuminateur personnalisable offre un contrôle dynamique et programmable sur plusieurs longueurs d’onde.
    NOTA : Il existe de nombreuses stratégies possibles pour construire une boîte à lumière, et une autre approche peut être plus appropriée (voir par exemple, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar et Khammash 53, et plus à https://www.optobase.org/materials/).
  2. Incluez les caractéristiques suivantes dans le caisson lumineux : contrôle de la température (28 °C est idéal pour les embryons de poisson-zèbre), exclusion de la lumière indésirable (par exemple, la lumière ambiante et la lumière du soleil), diffusion uniforme de la lumière bleue qui couvre la zone cible (par exemple, plaque à 6 puits) et contrôle de l’intensité lumineuse et de la dynamique d’exposition.
    REMARQUE : les bOpto-BMP/Nodal sont activés par la lumière bleue, mais certains outils optogénétiques répondent à d’autres longueurs d’onde. Utilisez la longueur d’onde appropriée pour l’outil optogénétique.
  3. Percez un trou dans le haut d’un incubateur (Figure 2B) légèrement plus large que la lentille de sortie LED.
    1. Assurez-vous qu’il n’y a pas de composants électriques dans le haut de l’incubateur qui seront détruits par le perçage (tableau des matériaux). Cela peut être vérifié en contactant le fabricant de l’incubateur et en demandant directement.
    2. S’il y a un trou existant sur le panneau supérieur de l’incubateur, utilisez une perceuse étagée pour augmenter la taille du trou à 1,25 pouce. Sinon, utilisez une scie-cloche de 1,25 pouce avec arbre.
    3. S’il y a des panneaux internes qui bloquent la source lumineuse, percez le trou de la taille appropriée pour vous assurer que le cône lumineux n’est pas bloqué (Figure 2A). Les panneaux sont généralement faits de tôle mince, alors utilisez des vitesses lentes et des forets à métaux pour éviter les dommages (foret au cobalt recommandé).
  4. Construisez un support de LED pour fixer l’illuminateur de microplaque LED sur le dessus de l’incubateur (Figure 2C, Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4, Dossier supplémentaire 5, Fichier supplémentaire 6, Fichier supplémentaire 7, Fichier supplémentaire 8).
    1. Montez quatre entretoises cubiques M3 sur la pièce de support verticale à l’aide de vis M3.
    2. Fixez les deux supports latéraux à gauche et à droite des entretoises cubiques du support vertical. Montez une autre entretoise cubique sur le trou restant sur les supports latéraux.
    3. Montez la pièce de support vertical sur l’ensemble d’éclairage de microplaque LED (tableau des matériaux) à l’aide de vis M6. Placez le joint de lentille LED sur la lentille du système LED.
    4. Montez les pièces assemblées sur le support du panneau de l’incubateur, puis sur les entretoises M3 sur les supports verticaux et latéraux. Placez le joint de l’incubateur sur le trou percé sur le dessus de l’incubateur.
    5. Placez le support du panneau de l’incubateur sur le joint de l’incubateur, en vous assurant que le joint et les ouvertures du panneau sont concentriques avec le trou de l’incubateur. Montez le panneau sur le dessus de l’incubateur à l’aide des vis n° 8. Assurez-vous que ce joint est étanche à la lumière.
  5. Placez une plaque à 6 puits sur l’étagère supérieure de l’incubateur. Déterminez si le faisceau lumineux recouvre uniformément la plaque (Figure 2A). Utilisez une feuille de papier pour visualiser la couverture lumineuse.
  6. Si toute la plaque n’est pas recouverte par le faisceau, augmentez la distance entre la LED et la plaque en déplaçant l’étagère vers le bas. Pour le système décrit ici, ~14 pouces entre la LED et l’étagère sont suffisants.
  7. Utilisez un posemètre pour déterminer le niveau d’irradiance et l’uniformité spatiale (tableau des matériaux).
  8. Pour éviter la lumière du soleil et l’exposition accidentelle à la lumière de la pièce, utilisez des coupe-froid pour vous assurer que la porte de l’incubateur est étanche à la lumière (figure 2A).
  9. Les embryons de poisson-zèbre se développent vigoureusement à 28 °C54. Utilisez un thermomètre à carte mémoire pour vous assurer que la boîte à lumière maintient 28 °C.

2. Génération d’ARNm pour injection

NOTE : pCS2+ est l’épine dorsale vectorielle pour les constructions bOpto-BMP38 et bOpto-Nodale39. Ce vecteur est résistant à l’ampicilline. bOpto-BMP est composé de trois constructions (Figure 1B) : BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614) : Domaine kinase putatif du récepteur BMPR1aa de type I (également connu sous le nom d’Alk3) fusionné à LOV ; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615) : Domaine kinase putatif du récepteur Acvr1l de type I (également connu sous le nom d’Alk8) fusionné à LOV ; et BMPR2a-LOV (Addgene # 207616) : Domaine kinase putatif du récepteur BMPR2a de type II et domaine C-terminal suivant fusionné à LOV. bOpto-Nodal est composé de deux constructions (Figure 1E) : Acvr1ba-LOV : Domaine kinase putatif du récepteur Acvr1ba de type I (également connu sous le nom d’Acvr1b) fusionné à LOV ; Acvr2ba-LOV : Domaine kinase putatif du récepteur Acvr2ba de type II (également connu sous le nom d’Acvr2b) fusionné à LOV.

  1. Pour linéariser les plasmides, digérer entre 2 et 5 μg d’ADN plasmidique à l’aide de l’enzyme de restriction NotI à 37 °C pendant 1 à 3 h (tableau des matériaux).
    REMARQUE : Il est également possible de générer de l’ADN linéarisé en utilisant le plasmide comme modèle de PCR.
  2. Purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification standard à colonne (Table des matériaux).
  3. Utilisez un kit de transcription SP6 in vitro tel qu’un kit mMessage mMachine pour transcrire l’ARN à partir de la matrice linéarisée (Table of Materials). Mettez en place deux réactions selon les recommandations du fabricant pour assurer un rendement plus élevé.
  4. Purifier l’ARN à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN standard à base de colonne (Table des matériaux). Il est également possible de purifier par précipitation.

3. Injection d’ARNm

  1. Au moins 1 jour avant les injections, fabriquez des boîtes d’injection et des plaques à 6 puits recouvertes d’agarose.
    1. Préparer 200 mL d’agarose à 1 % dans un milieu embryonnaire de poisson-zèbre et cuire au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. N’importe quel milieu d’embryon de poisson-zèbre standard devrait être acceptable ; Cependant, exclure le bleu de méthylène du milieu embryonnaire car il peut affecter l’imagerie en aval dans d’autres applications.
    2. Versez délicatement l’agarose fondue dans des boîtes de Pétri en plastique de 100 mm x 15 mm. Remplissez les plats à moitié.
    3. Rincez un moule à plat d’injection avec du milieu embryonnaire et placez-le doucement sur l’agarose fondue, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit piégée entre le moule et l’agarose. Utilisez du ruban adhésif pour faire une languette à l’arrière du moule pour faciliter le placement et la récupération.
    4. Le moule doit flotter dans l’agarose fondue. Si le moule coule, retirez-le délicatement de l’agarose fondue et répétez l’étape 3.1.3.
    5. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, utilisez la languette pour retirer délicatement le moule. Cela peut être accéléré en plaçant le plat à 4 °C.
    6. Fabriquez des plaques à 6 puits recouvertes d’agarose si vous travaillez avec des embryons déchorionnés pour des expériences d’immunofluorescence.
    7. Utilisez une pipette en plastique jetable de 10 ml pour transférer suffisamment d’agarose fondue pour couvrir le fond de chaque puits d’une plaque à 6 puits.
    8. Conservez les boîtes d’injection et les plaques à 6 puits à 4 °C. Ils peuvent être utilisés immédiatement ou stockés jusqu’à ce que l’agarose soit desséchée ou contaminée (généralement 2-3 semaines).
    9. Préparez des pointes de pipette en verre flammé si vous travaillez avec des embryons déchorionnés pour des expériences d’immunofluorescence.
    10. Insérez l’extrémité d’une pipette en verre dans la flamme d’un bec Bunsen et tournez-la continuellement jusqu’à ce que les bords soient lisses. Les embryons déchorionnés doivent passer confortablement à travers l’extrémité de la pipette. Ne laissez pas l’ouverture se rétrécir en dessous du diamètre d’un embryon.
    11. Achetez ou retirez des aiguilles de micro-injection (tableau des matériaux). Il est conseillé d’avoir des aiguilles supplémentaires à disposition le jour des injections au cas où un remplacement serait nécessaire.
  2. La veille des injections, mettre en place les éleveurs de poissons-zèbres selon les procédures opérationnelles normalisées (SOP) de l’institut. Gardez les mâles et les femelles séparés.
    1. Allumez le régulateur de température du caisson lumineux pour maintenir 28 °C. Pour vous assurer que la température de la boîte à lumière reste à 28 °C, surveillez la température à l’aide d’un thermomètre à carte mémoire (Table des matériaux).
    2. Préparez le(s) mélange(s) d’injection d’ARNm. Injectez des quantités équimolaires de chaque construction. Il est nécessaire de déterminer empiriquement la quantité à injecter.
    3. bLa taille des transcrits bOpto-BMP est la suivante :
      Acvr1l-LOV = 2007 nucléotides (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. Pour injecter des quantités équimolaires, injectez 1,01 fois plus de la construction Acvr1l que BMPR1aa ; injecter 1,72 fois plus de la construction BMPR2a que BMPR1aa.
    5. bLa taille des transcrits opto-nodaux est la suivante :
      Acvr1ba-LOV et Acvr2ba-LOV sont tous deux de 1962 nt.
    6. Pour injecter des quantités équimolaires, injectez la même quantité de chaque construction.
    7. Préparez des mélanges d’injection équimolaire, en combinant tous les ARNm ciblant une voie en un seul mélange d’injection. Incluez un traceur d’injection de rouge phénol si vous le souhaitez. Pour les données montrées à la figure 4, 15 pg de chaque construction bOpto-Nodale (Acvr1ba-LOV et Acvr2ba-LOV) ont été utilisées, et pour bOpto-BMP, 7,8 pg Acvr1l-LOV et BMPR1aa-LOV, et 13,4 pg BMPR2a-LOV ont été utilisés.
    8. Conserver les mélanges injectables à -20 °C. Une fois que la concentration optimale du mélange injectable a été déterminée, faire 5 à 10 μL d’aliquotes et stocker à -20 °C ou -80 °C.
  3. Jour d’injection
    1. Si vous effectuez un test de phénotypage (Figure 3A), injectez à travers le chorion directement au centre de la cellule au stade d’une cellule selon la SOP de votre laboratoire. Le chorion protège les embryons des facteurs de stress environnementaux et maintient les embryons lysés contenus. Ceci est utile lors de la notation pour une quantification précise des embryons lysés (Figure 4A,B).
    2. En cas d’exécution d’un test d’immunofluorescence (Figure 3B), les embryons devront éventuellement être déchorionnés pour l’imagerie (Figure 4C). Par conséquent, injecter directement au centre de la cellule des embryons déchorionisés au stade unicellulaire (voir Rogers et al.55 pour le protocole de déchorionisation). Alternativement, les embryons peuvent être déchorionnés manuellement après la fixation, mais c’est plus fastidieux que la déchorionisation avec pronase.
    3. Utiliser des pipettes en verre flammé pour manipuler les embryons déchorionnés (étape 3.1.10). Veillez à ne pas exposer les embryons déchorionnés à l’air ou au plastique, ce qui provoquerait la lyse des embryons. Manipulez délicatement les embryons déchorionnés.
    4. Préparez une boîte supplémentaire d’embryons non injectés comme substitut pour évaluer la progression du stade (voir l’étape 4.3.5). S’assurer que les embryons par procuration proviennent du même ensemble d’embryons expérimentaux, de sorte que tous les embryons ont été fécondés en même temps à partir des mêmes parents. Ceci est utile pour le test d’immunofluorescence où le stade est pertinent mais n’est pas nécessaire pour le test de phénotypage.
    5. Utilisez les conditions suivantes pour les tests de phénotypage et d’immunofluorescence : 1) non injecté, non exposé, 2) non injecté, exposé à la lumière, 3) injecté, non exposé, 4) injecté, exposé à la lumière. Sélectionnez au moins 30 embryons par condition. Pour une santé optimale des embryons, n’incubez pas plus de 30 embryons par puits dans une plaque à 6 puits.
    6. Après l’injection, transférer les embryons dans des boîtes de Pétri marquées ou des plaques à 6 puits recouvertes d’agarose (pour les embryons déchorionnés) et incuber à 28 °C. Les embryons ne sont pas encore sensibles à la lumière. Traiter les embryons injectés comme s’ils étaient sensibles à la lumière après 1,5 heure après la fécondation (hpf).

4. Expérience d’exposition à la lumière

REMARQUE : L’exposition à une lumière de ~450 nm avec une irradiance de 45 W/m2 active de manière robuste bOpto-BMP/Nodal sans phototoxicité évidente (pour plus d’informations sur le posemètre, voir le tableau des matériaux). Le niveau de signalisation activée optogénétiquement peut être réglé en modifiant les valeurs d’irradiance38. Cependant, la phototoxicité devra être évaluée à des irradiances plus élevées.

  1. Étape urgente. Au stade de 4 à 16 cellules, environ 1,5 hpf, retirez les embryons non fécondés et malsains. Redistribuez si nécessaire pour assurer le même nombre d’embryons dans chaque puits (pas plus de 30).
    REMARQUE : Il est important d’effectuer cette étape autour du stade de 4 à 16 cellules, car les embryons deviendront sensibles à la lumière lorsque l’ARNm injecté sera traduit en protéine. Nous n’avons pas observé de preuve que les embryons sont significativement sensibles à la lumière avant 1,5 hpf. Pour minimiser la photoactivation accidentelle lors de l’évaluation des embryons après 1,5 hpf, utilisez des lumières rouges ou couvrez les sources lumineuses, y compris les platines de microscope, avec du papier filtre en gel rouge qui bloque les longueurs d’onde bleues de dimérisation LOV (tableau des matériaux).
    1. Évaluer les embryons de manière cohérente afin d’assurer une répartition non biaisée entre les conditions et les expériences.
  2. Pour le test de phénotypage, utilisez le protocole d’exposition à la lumière suivant d’une journée à partir de 1,5 hpf (Figure 3A).
    1. Enveloppez la plaque de contrôle non exposée dans du papier d’aluminium. Cette plaque doit inclure à la fois des embryons non injectés et des embryons injectés. Assurez-vous que la plaque est entièrement recouverte et veillez à ne pas introduire de déchirures dans le film. Placez cette plaque sur l’étagère inférieure de la boîte à lumière à 28 °C (Figure 2A).
    2. Placez la plaque exposée sur l’étagère supérieure de la boîte à lumière à 28 °C (Figure 2A). Assurez-vous que le couvercle est sur le plat pour éviter l’évaporation du milieu embryonnaire. Allumez la lumière bleue (une irradiance de 45 W/m2 active la signalisation de manière robuste).
    3. Fermez la porte du caisson lumineux pour éviter une exposition accidentelle à la lumière de la pièce. Si vous le souhaitez, placez un thermomètre à carte mémoire à l’intérieur du caisson lumineux avant de fermer la porte. N’ouvrez pas la porte avant d’avoir obtenu le score phénotypique 1 jour après la fécondation (dpf ; voir étape 5.1).
  3. Pour le test d’immunofluorescence, exposez les embryons à la lumière bleue pendant 20 min à partir d’environ 40% d’épibole56 (~6 hpf) et fixez-les immédiatement après l’exposition à la lumière, avec les témoins non exposés (Figure 3B). Une exposition de 20 min à la lumière bleue à 40 % d’épibole active la signalisation de manière reproductible.
    1. À environ 1,5 hpf, enveloppez séparément les plats exposés et non exposés dans du papier d’aluminium. Assurez-vous que la vaisselle est entièrement couverte et veillez à ne pas introduire de déchirures dans le papier d’aluminium. Laissez la boîte de proxy déballée. Placez les plats emballés et la boîte de remplacement non emballée dans la boîte à lumière à 28 °C (Figure 2A). N’allumez pas encore la LED.
    2. Si vous testez plus d’une quantité d’ARNm, pour la condition non exposée, triez les embryons injectés avec différentes quantités dans des plaques individuelles à 6 puits recouvertes d’agarose, ce qui aidera à minimiser l’exposition à la lumière par inadvertance lors de la fixation ultérieure.
    3. Fermez la porte du caisson lumineux pour éviter une exposition accidentelle à la lumière de la pièce.
    4. Diluer le formaldéhyde à 4 % dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et aliquote 1 mL dans des tubes de microcentrifugation à fond rond pré-marqués de 2 mL, un tube par condition. Conserver à 4 °C.
    5. Vers 5 hpf, retirer la boîte de substitution contenant les embryons non injectés et évaluer le stade de développement à l’aide d’une lunette de visée. Le stade des embryons par procuration doit refléter le stade des embryons sensibles à la lumière dans les boîtes enveloppées.
    6. Retirez également les plats emballés, afin que tous les plats soient soumis à la même température. Répétez l’opération jusqu’à ce que les embryons par procuration aient atteint 40 % d’épibole (~6 hpf). La progression de l’embryogenèse est sensible à la température54 ; Par conséquent, plus les boîtes sont longues à l’extérieur de l’incubateur, plus il faudra de temps pour que les embryons atteignent 40% d’épibole.
    7. Une fois que les embryons par procuration ont atteint 40 % d’épibole, déballez la boîte exposée et placez-la sur l’étagère supérieure de la boîte à lumière (Figure 2A). Laissez le(s) plat(s) non exposé(s) enveloppé(s) et placez-le sur l’étagère inférieure. Allumez immédiatement la lumière bleue, fermez la porte et réglez une minuterie sur 20 min (une irradiance de 45 W/m2 active fortement la signalisation).
    8. Pour vous préparer à la fixation, éliminez le plus possible la lumière ambiante (fermez les stores, éteignez les plafonniers, éteignez les écrans, etc.). Assurez-vous que les tubes contenant du formaldéhyde sont correctement étiquetés. Immédiatement avant la fixation, retirez les tubes contenant du formaldéhyde de 4 °C et placez-les à côté de la boîte à lumière.
    9. Étape sensible au temps et à la lumière. Préparez-vous à vous déplacer rapidement à la fin des 20 minutes d’exposition à la lumière. Après 20 minutes, ouvrez la porte du caisson lumineux et retirez la parabole non exposée.
    10. À l’aide d’une pointe de pipette en verre flammé, transférez rapidement mais en douceur les embryons photosensibles dans le tube correspondant préparé contenant 4 % de formaldéhyde.
    11. Réduire au minimum le temps de transfert (<45 s) des embryons sensibles à la lumière afin d’éviter une exposition accidentelle à la lumière. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la pipette. L’exposition à l’air détruira les embryons déchorionnés.
    12. Pour éjecter les embryons dans le formaldéhyde, plongez l’embout de la pipette en verre dans le formaldéhyde et laissez les embryons s’enfoncer dans le liquide. Réduire au minimum la quantité de milieu embryonnaire transférée au formaldéhyde en gardant les embryons à l’extrémité de l’embout.
    13. Une fois les embryons transférés, remettez la pipette dans le même puits et pipetez de haut en bas pour déloger les embryons coincés. Cela permet d’éviter que des embryons atteints de plusieurs affections ne se retrouvent accidentellement dans un seul tube.
    14. Répétez immédiatement les étapes 4.3.11 à 4.3.13 pour les embryons non exposés et non injectés, puis les embryons exposés (injectés et non injectés).
    15. Conservez les embryons fixés à 4 °C pendant la nuit.

5. Évaluation de l’expérience

  1. Notation et imagerie du phénotype
    1. À 1 dpf, idéalement entre 24 et 32 hpf, retirez les embryons de la boîte à lumière pour évaluer les phénotypes à l’aide d’une lunette de dissection et créez une grille d’évaluation. Il s’agit du critère d’évaluation expérimental ; La photoactivation par inadvertance n’est plus un problème.
    2. Marquez les embryons alors qu’ils sont encore dans le chorion pour plus de facilité. Utilisez une pipette ou une sonde pour déplacer les embryons afin de les voir sous plusieurs angles.
      1. Les embryons présentant un excès de signalisation BMP seront ventralisés avec différents degrés de gravité, comme décrit en détail dans Kishimoto et al. 199746 (figure 4A, panneau de gauche). Les embryons présentant un excès de signalisation ganglionnaire présenteront une gamme de défauts de développement liés à un excès de mésendoderme (Figure 4A, panneau de droite)1,3,47,57,58,59,60. Ils auront souvent lysé de 1 dpf.
    3. Évaluez chaque embryon dans toutes les conditions (figure 4B). Obtenez une image d’ensemble de tous les embryons dans chaque puits. Si vous le souhaitez, déchorionner et imager des embryons représentatifs individuels dans de la méthylcellulose (figure 4A).
  2. Coloration par immunofluorescence et imagerie
    1. Après avoir incubé les embryons dans du formaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant la nuit, éliminez le formaldéhyde et lavez-les 3 à 5 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate avec Tween20 (PBST). Retirez le PBST et ajoutez 100 % de méthanol.
    2. Fermez les tubes et retournez-les doucement pour mélanger le PBST résiduel et le méthanol. Laver 2 fois au méthanol et conserver à -20 °C pendant au moins 2 h à plusieurs années.
    3. Pour le protocole d’immunofluorescence pSmad1/5/9 (BMP), voir Rogers et al.38. Pour le protocole d’immunofluorescence pSmad2/3 (nodal), voir van Boxtel et al.17 et Rogers et al.47.
    4. Imager des embryons immunocolorés à l’aide d’un microscope capable de sectionner optiquement (p. ex., un microscope confocal ou un microscope à feuille de lumière). Éviter la saturation et maintenir des conditions d’imagerie identiques entre tous les échantillons colorés avec le même anticorps.
    5. Image dans les 5 jours suivant la fin de la coloration par immunofluorescence, car la fluorescence peut s’estomper avec le temps.

Résultats Représentatifs

L’objectif des deux expériences de contrôle décrites ici est de déterminer si bOpto-BMP/Nodal activent leurs voies respectives en réponse à l’exposition à la lumière bleue sans affecter la signalisation en l’absence de lumière, comme prévu. Utilisez ces contrôles pour établir le flux de travail expérimental approprié dans votre laboratoire avant d’appliquer bOpto-BMP/Nodal à vos questions de recherche d’intérêt.

Le test de phénotypage peut être réalisé en seulement 2 jours et fournit une indication utile de l’activité de signalisation et de la phototoxicité (Figure 3A). Les embryons injectés et exposés à la lumière bleue doivent phénocopier l’excès de signalisation BMP (ventralisation46 ; Figure 4A, panneau de gauche) ou de signalisation ganglionnaire (défauts de développement liés à l’extra-mésendoderme 1,3,47,57,58,59,60 (Figure 4A, panneau de droite)). S’ils sont injectés, les embryons exposés à la lumière sont aphénotypiques, testez la qualité de l’ARNm et envisagez d’en injecter davantage, et vérifiez la stratégie d’exposition à la lumière pour assurer une exposition constante à la lumière vive (une lumière de ~450 nm avec une irradiance de 45 W/m2 devrait activer fortement la signalisation). En revanche, les embryons injectés et non exposés doivent être identiques aux frères et sœurs non injectés. S’ils sont injectés, les embryons non exposés présentent des phénotypes, réduisent la quantité d’ARNm injectée et réévaluent le dispositif expérimental pour s’assurer que les embryons non exposés sont protégés de l’exposition à la lumière. Les données présentées à la figure 4B montrent les résultats d’expériences de phénotypage typiques avec des quantités d’ARNm et des conditions d’exposition appropriées : une forte activité de signalisation est évidente dans les embryons injectés et exposés à la lumière, avec seulement une petite fraction d’embryons injectés et non exposés présentant des phénotypes.

Le test de phénotypage permet également d’évaluer la phototoxicité. Si la phototoxicité est négligeable, les embryons non injectés et exposés à la lumière devraient apparaître de type sauvage, semblables aux embryons non injectés et non exposés. Si les embryons non injectés et exposés à la lumière présentent des défauts, mais pas les embryons non injectés et non exposés, envisagez de diminuer l’irradiance lumineuse. Une irradiance de 45 W/m2 active de manière robuste la signalisation sans phototoxicité évidente. Les données présentées à la figure 4B ne montrent aucune différence préoccupante entre les embryons non injectés exposés à la lumière et les embryons non injectés et non exposés, ce qui indique une phototoxicité négligeable.

Bien que les tests d’immunofluorescence nécessitent plus de temps et d’efforts (~1 semaine) par rapport au test de phénotypage (2 jours), la coloration par immunofluorescence fournit une lecture directe de l’activité de la voie de signalisation et peut révéler des changements de signalisation subtils qui pourraient ne pas être reflétés par la morphologie macroscopique. L’immunofluorescence est particulièrement importante pour évaluer les réponses à bOpto-Nodal, car l’excès de signalisation ganglionnaire entraîne souvent la lyse des embryons de 1 dpf - ce qui peut avoir de nombreuses causes - contrairement aux phénotypes de ventralisation spécifiques caractéristiques de l’excès de signalisation BMP46 (Figure 4A). Les embryons injectés exposés à la lumière bleue devraient présenter une augmentation uniforme de la phosphorylation de Smad1/5/9 ou Smad2/3 par rapport aux embryons non injectés et exposés à la lumière. Si les niveaux ne sont pas augmentés, ou seulement faiblement augmentés, testez la qualité de l’ARNm et envisagez d’en injecter davantage, et vérifiez la stratégie d’exposition à la lumière. Une exposition de 20 min à la lumière bleue avec une irradiance de 45 W/m2 autour de 40% d’épibole devrait activer fortement la signalisation. Si la coloration pSmad n’est pas uniforme, essayez d’injecter de l’ARNm au centre de la cellule (plutôt que dans le vitellus), ce qui peut entraîner une distribution plus uniforme de l’ARNm.

Les embryons injectés et non exposés doivent avoir des niveaux de pSmad comparables à ceux des embryons non injectés. De manière anecdotique, nous avons observé une phosphorylation de Smad plus perméable avec bOpto-Nodal qu’avec bOpto-BMP. Si les taux de pSmad sont augmentés dans les embryons injectés et non exposés, réduisez la quantité d’ARNm injectée. De plus, réévaluez le dispositif expérimental pour vous assurer 1) que les embryons non exposés ne sont pas exposés par inadvertance à la lumière et 2) que l’exposition à la lumière pendant la fixation est minimale. Lors de l’étape de fixation, il est essentiel de ne pas laisser s’écouler plus de 45 s entre le retrait de la boîte à lumière et l’immersion dans le formaldéhyde. De plus, au cours de cette étape, minimisez l’exposition à la lumière ambiante et à la lumière du soleil en fermant les stores, en éteignant les sources de lumière blanche, en utilisant des lumières rouges ou en couvrant les sources de lumière blanche avec du papier filtre gel bloquant la lumière bleue (Table des matériaux).

Les données de la figure 4C montrent les résultats d’expériences typiques de coloration par immunofluorescence avec des quantités d’ARNm appropriées et des conditions d’exposition à la lumière : les niveaux de pSmad sont similaires chez les embryons non injectés et non exposés, tandis que les embryons injectés et exposés à la lumière présentent des niveaux plus élevés de phosphorylation de Smad.

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Figure 1 : Stratégie d’activation de la signalisation bOpto-BMP et -Nodal. (A) La voie de signalisation BMP endogène est activée par la liaison au ligand BMP, conduisant à la formation d’un complexe de récepteurs de type I/II, à la phosphorylation de Smad1/5/9 et à l’expression des gènes cibles BMP. Les récepteurs de type I BMPR1aa et Acvr1l sont également connus sous les noms d’Alk3 et d’Alk8, respectivement. BMPR2a est un récepteur de type II. (B) bOpto-BMP construit38. Les domaines kinases putatifs de BMPR1aa et Acvr1l sont fusionnés à LOV ; la fusion BMPR2a-LOV contient le domaine kinase putatif et le domaine C-terminal du récepteur (CTD). Toutes les fusions sont ciblées par une membrane avec un motif de myristoylation (Myr). Les domaines sont séparés par des lieurs de glycine-sérine (GS). Les constructions sont marquées au niveau du CTD avec une balise d’épitope HA. Cette combinaison de trois constructions s’est avérée activer de manière optimale la signalisation BMP. (C) Activation de la signalisation BMP médiée par bOpto-BMP. Lorsqu’ils sont exposés à la lumière bleue, les domaines LOV se dimérisent, ce qui déclenche la formation de complexes et l’activation de la signalisation. (D) La voie de signalisation nodale endogène est activée par la liaison du ligand nodal, conduisant à la formation d’un complexe de récepteurs de type I/II, à la phosphorylation de Smad2/3 et à l’expression de gènes cibles nodaux. Le récepteur de type I Acvr1ba et le récepteur de type II Acvr2ba sont également connus sous le nom d’Acvr1b et Acvr2b, respectivement. (E) bConstructions opto-nodales39. Les domaines kinases putatifs d’Acvr1ba et d’Acvr2ba sont fusionnés à LOV. Toutes les fusions sont ciblées par une membrane avec un motif de myristoylation (Myr). Les domaines sont séparés par des éditeurs de liens GS. Les constructions sont marquées au niveau du CTD avec une balise d’épitope HA. (F) Activation de la signalisation nodale médiée par l’opto-nodal. Lorsqu’ils sont exposés à la lumière bleue, les domaines LOV se dimérisent, ce qui déclenche la formation de complexes et l’activation de la signalisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Caisson lumineux à température contrôlée pour les expériences optogénétiques. (A) Un illuminateur de microplaque à LED est monté sur le dessus d’un incubateur à l’aide d’un support LED construit sur mesure. Les embryons de poisson-zèbre dans une plaque à 6 puits sur la première étagère sont exposés à la lumière à travers un trou percé dans le haut de l’incubateur. L’étagère inférieure contient un deuxième ensemble d’embryons témoins non exposés dans une plaque à 6 puits enveloppée de papier d’aluminium. La porte de l’incubateur est doublée de coupe-froid pour éviter toute exposition accidentelle à la lumière ambiante ou à la lumière du soleil. (B) Détail de la procédure à suivre pour percer un trou dans l’incubateur à l’aide d’une perceuse étagée. Le modèle d’incubateur utilisé ici a un panneau interne qui a nécessité le perçage d’un deuxième trou plus grand (Table des matériaux). (C) Détail du support LED personnalisé conçu pour un système d’éclairage à trois longueurs d’onde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Flux de travail de l’expérience bOpto-BMP/Nodal. Dosage phénotypique et coloration par immunofluorescence pSmad pour tester l’activité de bOpto-BMP/Nodal. Les embryons sont injectés avec de l’ARNm au stade unicellulaire et transférés dans une boîte à lumière au plus tard 1,5 h après la fécondation (hpf). (A) Dosage du phénotype. Les embryons injectés et les frères et sœurs non injectés sont élevés dans l’obscurité ou exposés à une lumière bleue uniforme à partir de 1,5 hpf jusqu’à 1 jour après la fécondation (dpf). L’activité de signalisation optogénétique peut être évaluée en notant les embryons pour les phénotypes compatibles avec une activité excessive de la voie. (B) Coloration par immunofluorescence pSmad. Les embryons injectés et les frères et sœurs non injectés sont élevés dans l’obscurité jusqu’à 40% d’épibole (~6 hpf). La moitié des embryons injectés et l’autre moitié des embryons non injectés sont ensuite exposés à une lumière bleue uniforme pendant 20 minutes. Après l’exposition, tous les embryons sont fixés et soumis à une coloration par immunofluorescence pour la pSmad. Des niveaux élevés de pSmad1/5/9 ou de pSmad2/3 reflètent l’activation optogénétique de la BMP ou de la signalisation nodale, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Évaluation des réponses de signalisation activées par la lumière chez des embryons de poisson-zèbre. Des embryons de poisson-zèbre ont été injectés au stade unicellulaire avec de l’ARNm codant pour bOpto-BMP/Nodal. (A) Les embryons ont été élevés dans l’obscurité ou exposés à une lumière bleue uniforme à partir de 1,5 h après la fécondation (hpf). Les phénotypes ont été notés 1 jour après la fécondation (dpf). Des phénotypes représentatifs sont présentés. L’excès de signalisation BMP entraîne une ventralisation (panneau de gauche), tandis qu’un excès de signalisation nodale provoque des défauts de développement associés à un mésendoderme supplémentaire (panneau de droite). Barre d’échelle = 500 μm. (B) Quantification du phénotype. Les embryons injectés et les frères et sœurs non injectés ont été élevés dans l’obscurité à partir de 1,5 hpf (bulbe noir). La moitié des embryons injectés et l’autre moitié des embryons non injectés ont été exposés à une lumière bleue uniforme (ampoule bleue). (C) Les embryons injectés et les frères et sœurs non injectés ont été élevés dans l’obscurité à partir de 1,5 hpf (bulbe noir). À 40% d’épibole (~6 hpf), la moitié des embryons injectés et l’autre moitié des embryons non injectés ont été exposés à une lumière bleue uniforme (ampoule bleue). Après 20 minutes, tous les embryons ont été fixés et soumis à une coloration par immunofluorescence pour Smad1/5/9 phosphorylé ou Smad2/3. Des intensités pSmad plus élevées indiquent une augmentation de la signalisation BMP/Nodal, respectivement. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Assemblage complet du caisson lumineux. Fichier PDF 3D montrant une vue 3D de l’ensemble complet du caisson lumineux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Vue éclatée de la boîte à lumière. Fichier PDF 3D montrant une vue 3D de l’assemblage de caisson lumineux éclaté. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Grand joint léger. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer le grand joint lumineux pour le support LED à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Petit joint léger. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer le petit joint lumineux pour le support LED à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Base de plate-forme en acrylique. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer la base de la plate-forme acrylique du support LED à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Plate-forme acrylique verticale. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer la plate-forme acrylique du support LED verticalement à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : Support acrylique gauche. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer le support LED support acrylique gauche à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Support acrylique droit. Fichier de dessin CAO (. DWG) pour fabriquer le support de LED en acrylique à l’aide d’une découpeuse laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’injection d’ARNm est la stratégie actuelle pour délivrer bOpto-BMP/Nodal aux embryons de poisson-zèbre. Cette méthode présente plusieurs inconvénients. Tout d’abord, la quantité appropriée d’ARNm varie d’un laboratoire à l’autre. La quantité utilisée doit être suffisante pour activer la signalisation de manière robuste avec une exposition à la lumière, mais sans activation accidentelle de l’obscurité. C’est une bonne idée de tester plusieurs quantités pour trouver les niveaux optimaux d’ARNm et, une fois établis, de créer des aliquotes d’un mélange maître pour introduire de manière reproductible la même quantité d’ARNm. Deuxièmement, une distribution inégale de l’ARNm injecté peut entraîner une activation inégale de la signalisation. On pense que l’injection au centre de la cellule (et non dans le jaune) favorise une distribution uniforme de l’ARNm. Enfin, comme l’ARNm injecté se dégrade avec le temps, cette approche peut ne pas convenir aux expériences sur des embryons plus âgés. À l’avenir, ces problèmes pourraient être résolus par des lignées de poissons-zèbres transgéniques exprimant de manière ubiquitaire bOpto-BMP/Nodal avec un promoteur maternel ou inductible par un médicament. Bien que travailler avec des poissons-zèbres adultes potentiellement sensibles à la lumière puisse être un défi dans ce contexte, les transgéniques de poissons-zèbres 61,62 et de drosophiles 22,34,35,63 hébergeant des outils optogénétiques ont été développés avec succès.

Éviter la photoactivation par inadvertance est un défi général avec les outils optogénétiques. Pour simplifier, traitez les embryons injectés âgés de plus de 1,5 hpf comme sensibles à la lumière. L’exposition accidentelle à la lumière peut souvent être évitée en enveloppant simplement des assiettes ou des plats avec du papier d’aluminium. Cependant, pour les expériences nécessitant l’observation visuelle d’embryons vivants âgés de plus de 1,5 hpf, il est possible d’utiliser des sources de lumière rouge ou de couvrir les sources de lumière blanche avec du papier filtre gel peu coûteux qui bloque les longueurs d’onde de dimérisation LOV (Table of Materials).

Le caisson lumineux décrit ici est conçu pour des applications spécifiques nécessitant un contrôle précis des niveaux d’irradiance lumineuse, de la dynamique et des longueurs d’onde (Figure 2). Parmi les autres avantages de cette boîte à lumière, citons une exposition uniforme à la lumière, un chauffage négligeable de l’échantillon par inadvertance, un espace suffisant pour plusieurs plaques à 6 puits et des sources lumineuses à longue durée de vie et spectralement bien caractérisées. Cependant, différentes stratégies d’exposition à la lumière peuvent être préférables selon l’application de recherche. De nombreux laboratoires ont mis au point des systèmes d’exposition uniforme à la lumière plus simples et plus rentables avec un encombrement réduit, notamment en recouvrant les incubateurs de bandes LED, en suspendant des panneaux LED au-dessus des échantillons ou en incorporant des LED dans les couvercles de boîtes de culture 32,38,39,40,64,65,66. Il est important de noter que le caisson lumineux utilisé dans ce protocole ne permet pas aux utilisateurs de réguler indépendamment les puits individuels (contrairement à Bugaj et al.52) ou de fournir un contrôle spatial sur l’exposition à la lumière. L’activation optogénétique localisée dans l’espace a été démontrée avec bOpto-BMP38 et bOpto-Nodal39 en utilisant des lasers dans des systèmes SPIM ou confocaux, respectivement, et a également été réalisée avec de nombreuses autres stratégies optogénétiques dans une variété de systèmes modèles (discutés dans Rogers et Müller12). Certaines approches ont même atteint une résolution spatiale subcellulaire 29,30,31. Bien que la mise en œuvre de systèmes d’exposition à la lumière localisés dans l’espace n’entre pas dans le cadre de ce protocole, des expériences d’activation spatiale avec bOpto-BMP/Nodal sont théoriquement possibles avec des équipements spécialisés tels que des dispositifs de micromiroirs numériques ou des approches de masquage. Les lecteurs sont encouragés à explorer la vaste littérature sur les caissons lumineux à faire soi-même pour les expériences optogénétiques avant de s’engager dans une stratégie d’exposition à la lumière (voir par exemple, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar et Khammash 53 et plus encore à https://www.optobase.org/materials/).

Les stratégies optogénétiques moléculaires offrent souvent un degré plus élevé de contrôle spatio-temporel sur les processus biologiques par rapport aux approches historiques telles que les mutants, l’expression ectopique des gènes, les protéines recombinantes et les médicaments. Les lecteurs qui s’intéressent aux avantages des approches optogénétiques peuvent explorer d’autres outils publiés disponibles chez le poisson-zèbre et d’autres organismes. Il s’agit notamment d’outils permettant de manipuler d’autres voies de signalisation 32,65,67,68, de réguler l’expression des gènes 61,64,66,69,70,71, de modifier la localisation des protéines 31,72 et d’activer l’apoptose 62. Ces outils et bien d’autres sont commodément catalogués sur OptoBase, une ressource Web organisée pour les approches d’optogénétique moléculaire28. Pour ceux qui ont envie de créer de nouveaux outils optogénétiques, la ressource présente également des descriptions utiles des protéines sensibles à la lumière qui ont été utilisées dans un large éventail de stratégies, y compris les protéines sensibles à la lumière qui répondent aux longueurs d’onde vertes, rouges et proches infrarouges. Nous sommes enthousiastes à l’idée que la communauté scientifique réalise le plein potentiel des approches optogénétiques moléculaires.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le financement de ce protocole a été fourni par le programme intra-muros du NICHD à KWR (ZIA HD009002-01). Nous remercions Jeff Farrell et son laboratoire pour leurs commentaires éclairants, Will Anderson pour son excellent soutien technique, Leanne Iannucci pour les tests de résistance du protocole et la mesure de l’irradiance, et l’installation de poissons-zèbres partagés du NIH pour leur travail acharné pour garder le poisson-zèbre en bonne santé.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Building a light box & Light exposure protocol
#8 x 1" Hex Self-drilling ScrewMcMaster-Carr99663A2221.4.5
Digital Optical Power and Energy MeterThorLabsPM100D1.7
4
Incubator (142 liters)Boekel Scientific1394001.3.1
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsIncubator_panel1.4.4
Large HSS Spiral Groove Step Drill BitCO-ZSDB0001TA1.3.2
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black siliconeMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
LED microplate illuminatorPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10mm Cube StandoffNewark Eletronics005.60.5331.4.1
M3 x 10mm 316SS Flat Head ScrewMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10mm 316SS Flat Head ScrewMcMaster-Carr91801A3051.4.3
Memory card thermometerFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)ThorLabsS170C1.7
4
Red gel filter paper #E106Rosco / B&H Foto & Electronics110084014805-E1064.2.1
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsSide_bracket1.4.2
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic)Custom part / Piedmont PlasticsVertical_bracket1.4.1
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle Pure KitOmegaD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
Microsample incubator (Hybex)SciGene1057-30-02
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)SciGene1057-34-02
Nanodrop One SpectrophotometerThermo ScientificND-ONE-W2.4
NotI-HF restriction enzymeNew England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene2076152
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit (250 rxns)Qiagen741062.3
Injecting mRNA
Agarose (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml glass beakersFisherbrandFB1002503.3.2
6-well dishes (case of 50)Falcon08 772 1B3.1.6
B-8A ball jointNarishigeB-8A3.3
Back pressure unit (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)BPU3.3
Foot switch (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)FWS3.3
GJ-1 magnetic standNarishigeGJ-13.3
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
Glass petri dish bottoms (for dechorionating)Pyrex08-748A3.3.2
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
Injection dish moldsAdaptive Science Toolstu13.1.3
IP iron plateNarishigeIP3.3
M-152 micromanipulatorNarishigeM-1523.3
Micro pipette holder kit (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MIMPH-MPIP-Kit3.3
MicrometersMeiji Techno AmericaMA2853.3
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MPPI-33.3
Needle pullerWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)Falcon08-757-100D3.1.2
Pipettor (10 ml, green)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
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