Développement et caractérisation d’hydrogels à matrice extracellulaire pulmonaire décellularisée

Résumé

Le protocole élucide deux méthodologies de décellularisation distinctes appliquées aux tissus pulmonaires bovins natifs, fournissant un compte rendu complet de leurs caractérisations respectives.

Résumé

L’utilisation d’hydrogels dérivés de la matrice extracellulaire (ECM) dans l’ingénierie tissulaire est devenue de plus en plus populaire, car ils peuvent imiter l’environnement naturel des cellules in vitro. Cependant, il est difficile de maintenir le contenu biochimique natif de l’ECM, d’obtenir une stabilité mécanique et de comprendre l’impact du processus de décellularisation sur les propriétés mécaniques des hydrogels ECM. Ici, un pipeline pour la décellularisation du tissu pulmonaire bovin à l’aide de deux protocoles différents, la caractérisation en aval de l’efficacité de la décellularisation, la fabrication d’hydrogels ECM pulmonaires décellularisés reconstitués et l’évaluation de leurs propriétés mécaniques et de cytocompatibilité ont été décrits. La décellularisation du poumon bovin a été poursuivie à l’aide d’une méthode physique (cycles de gel-dégel) ou chimique (à base de détergents). Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a été réalisée pour valider la décellularisation et la rétention des principaux composants de la MEC. Pour l’évaluation de la teneur résiduelle en collagène et en glycosaminoglycane sulfaté (sGAG) dans les échantillons décellularisés, les techniques de coloration au rouge de Sirius et au bleu d’Alcian ont été utilisées, respectivement. Les propriétés mécaniques des hydrogels ECM pulmonaires décellularisés ont été caractérisées par une rhéologie oscillatoire. Les résultats suggèrent que les hydrogels pulmonaires bovins décellularisés peuvent constituer une alternative organotypique fiable aux produits ECM commerciaux en conservant la plupart des composants ECM natifs. De plus, ces résultats révèlent que la méthode de décellularisation choisie affecte de manière significative la cinétique de gélification ainsi que la rigidité et les propriétés viscoélastiques des hydrogels résultants.

Introduction

Les conditions de culture monocouches conventionnelles n’offrent pas une représentation fidèle des microenvironnements tissulaires natifs et n’ont pas la capacité de fournir un échafaudage tridimensionnel (3D) avec des ligands instructifs qui permettent des interactions cellule-matrice et cellule-cellule¹. La composition de la matrice extracellulaire (MEC) et les propriétés mécaniques sont très spécifiques aux tissus, dépendent du temps et subissent des altérations dans des conditions pathologiques. Par conséquent, il existe un besoin de modèles tissulaires 3D biomimétiques qui permettent d’ajuster ces caractéristiques, de moduler le comportement cellulaire et d’obtenir la fonctionnalité tissulaire souhaitée. Les biomatériaux dérivés de la MEC native attirent beaucoup d’attention dans l’ingénierie tissulaire avec la possibilité d’utiliser directement la MEC 1,2,3,4,5 spécifique au tissu. Les supports basés sur la MEC ont été utilisés dans de nombreuses applications allant de la régénération tissulaire au développement de modèles de maladies. Ils sont utilisés comme échafaudages de biomatériaux injectables ou implantables ^4,5, dans des applications de criblage de médicaments ^6,7, dans le développement de matériaux qui induisent la croissance cellulaire ^8,9,10, comme bio-encres 11,12,13, en microfluidique ¹⁴ et dans des modèles de tissus cancéreux 15,16,17^,18,19.

La décellularisation des tissus et des organes est une approche populaire pour générer des échafaudages qui imitent la MEC spécifique aux tissus. La reconstitution de tissus et d’organes décellularisés en hydrogels permet d’intégrer des cellules dans des modèles tissulaires 3D biomimétiques²⁰. Les techniques de décellularisation se concentrent principalement sur l’élimination des composants cellulaires tout en conservant la composition de l’ECM. Des méthodes physiques telles que les cycles de gel-dégel ou des processus chimiques tels que le traitement Triton-X-100 sont couramment appliquées pour décellulariser les tissus. De plus, le traitement par DNase est préféré pour éliminer l’ADN résiduel afin de minimiser les réponses immunologiques lors de l’intégration cellulaire. Il est essentiel d’obtenir une élimination maximale des cellules et une altération minimale de la MEC pour optimiser les procédures de décellularisation²¹. Outre ces aspects, la caractérisation des propriétés biochimiques et mécaniques des échafaudages reconstitués, y compris la viscoélasticité et la rigidité, est cruciale pour améliorer les modèles tissulaires 3D modifiés dérivés de matrices natives²⁰.

La MEC spécifique à un organe en ingénierie tissulaire pulmonaire permet d’imiter le microenvironnement pulmonaire pour modéliser les processus développementaux, homéostatiques ou pathologiques in vitro et tester des traitements dans un contexte physio-mimétique 20,22,23. Des études antérieures ont démontré la décellularisation du tissu pulmonaire de plusieurs espèces, telles que les rats, les porcins et les humains, mais ces méthodes n’ont pas encore été adaptées à des espèces moins fréquemment utilisées telles que les bovins. Une meilleure compréhension des paramètres du processus de décellularisation et de la façon dont ils affectent les échafaudages ECM reconstitués qui en résultent en ce qui concerne la composition biochimique et les propriétés mécaniques permettra de mieux ajuster ces aspects et ouvrira la voie à des modèles tissulaires plus fiables en santé et en maladie. Dans cette étude, la décellularisation des poumons bovins avec deux méthodes distinctes, les cycles de congélation-décongélation et le traitement au Triton-X-100, est explicitement décrite et suivie d’analyses biochimiques et mécaniques d’hydrogels ECM pulmonaires décellularisés (dECM). Les résultats révèlent que les deux méthodes permettent une décellularisation et une rétention efficaces des ligands de la MEC. Notamment, le choix de la méthode modifie considérablement la rigidité et la viscoélasticité résultantes des hydrogels reconstitués. Les hydrogels dérivés de la dECM bovine présentent des analogies biochimiques notables avec la matrice extracellulaire du poumon humain, et ils présentent des caractéristiques de gélification thermique fiables²⁰. Comme décrit précédemment, les deux méthodes conviennent à la culture 3D de cellules cancéreuses du poumon, de cellules épithéliales bronchiques saines et d’organoïdes pulmonaires dérivés de patients²⁰.

Protocole

Des poumons natifs frais de jeunes donneurs bovins (1-2 ans) ont été obtenus d’un abattoir local et transportés dans un récipient en plastique scellé sur de la glace jusqu’au laboratoire. Le sacrifice d’animaux est effectué pour la consommation générale de viande (poumons jetés comme déchets) et n’est pas lié ou dû à l’étude. Nous confirmons que l’abattoir respecte les lois et réglementations nationales en matière de sacrifice d’animaux. De plus, nous confirmons que nous n’avons utilisé que des déchets et que le projet de recherche n’a pas eu d’effet sur le nombre d’animaux sacrifiés.

1. Prélèvement d’organes et préparation des tissus

1. Conserver les tissus pulmonaires bovins fraîchement obtenus à -80 °C jusqu’à l’expérience.
2. Le jour de l’expérience, attendez que les tissus pulmonaires congelés décongèlent à température ambiante.
3. Disséquer les tissus avec des scalpels stériles et des ciseaux pour enlever la trachée et les voies respiratoires cartilagineuses, puis les émincer en petits morceaux (5 mm³).
4. Laver soigneusement avec de l’eau ultrapure contenant 2 % de pénicilline/streptomycine (P/S) au moins 3 fois.

2. Décellularisation des tissus

REMARQUE : Les tissus pulmonaires natifs de bovins ont été décellularisés à l’aide de deux protocoles distincts.

1. Méthode de congélation-décongélation
   1. Préparez les échantillons de tissus conformément à l’étape 1. Immerger les mouchoirs hachés dans une solution d’iode à 2 % dans de l’eau distillée stérile (dH₂O) pendant 1 min. Effectuer deux lavages consécutifs dans un dH₂O stérile.
   2. Transférez les morceaux de tissu hachés dans un tube de 50 mL jusqu’au niveau de 15 mL et mettez en œuvre cinq cycles manuels de congélation-décongélation à l’aide d’un récipient d’azote liquide portable. Remplissez les tubes jusqu’en haut avec du dH₂O stérile et congelez les tubes pendant 2 min dans de l’azote liquide. Après 2 min, transférez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 min. Cela constitue 1 cycle de gel-dégel.
   3. Incuber les échantillons avec 30 mL de solution de DNase (10 U/mL) dans un tampon MgCl₂ de 10 mM (pH 7,5) pendant 1 h à 37 °C en agitant constamment à 100 tr/min.
   4. Continuez avec un lavage approfondi avec du dH₂O stérile pendant 3 jours en secouant constamment à 100 tr/min, avec un réapprovisionnement en solution toutes les 24 h.
   5. Effectuer la lyophilisation et la cryobroyation comme suit²⁰ : Congeler les échantillons de dECM humides à -80 °C pendant 24 h. Transférez les échantillons congelés dans un lyophilisateur et faites-les fonctionner en mode séchage sous vide pendant 3 à 4 jours jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs. Une fois la lyophilisation terminée, broyer les échantillons en poudre fine à l’aide d’un appareil de broyage et de glace sèche.
      REMARQUE : Cet état de poudre fine est jugé nécessaire en raison de ses propriétés de solubilité améliorées au cours des étapes ultérieures du processus de digestion.
2. Méthode Triton-X-100
   1. Préparez les échantillons de tissus conformément à l’étape 1. Traiter les tissus pulmonaires avec 1% de Triton-X-100 pendant 3 jours sous rotation douce à 4 °C. Échange de solution toutes les 24 h.
   2. Incuber les échantillons avec une solution de DNase (10U/mL) dans un tampon MgCl₂ de 10 mM (pH 7,5) pendant 1 h à 37 °C sous agitation constante.
   3. Continuez avec un lavage approfondi avec du dH₂O stérile pendant 3 jours sous rotation douce, avec un réapprovisionnement en solution toutes les 24 h.
   4. Effectuer une lyophilisation suivie d’un cryobroyage comme décrit à l’étape 2.1.

3. Digestion de la pepsine

1. Digestion d’échantillons de dECM en poudre à une concentration de 15 mg/mL (p/v) dans une solution de pepsine (1 mg/mL de pepsine dans 0,01 M de HCl, pH 2). Effectuer le processus de digestion de l’échantillon à température ambiante en remuant constamment pendant 48 h et maintenir fréquemment le pH de la solution pour une digestion efficace.
2. Transvaser les digestions dans un tube et centrifuger à 5000 x g pendant 10 min.
3. Recueillir le surnageant, le neutraliser et le tamponner aux conditions physiologiques (pH 7, 1x solution saline tampon phosphate (PBS)) par l’ajout de 5M NaOH et 10x PBS.
   REMARQUE : Il est suggéré d’utiliser des solutions alcalines concentrées pour ajuster le pH de la digestion acide, car cette approche évite une expansion volumique indésirable qui pourrait avoir un impact négatif sur la gélification dans les étapes suivantes.
4. Conservez les digestions pré-gel à −20 °C pour des études ultérieures.

4. Coloration histologique

1. Fixer une petite portion (5 mm³) d’échantillon de tissu décellularisé dans 1 mL de solution de formaldéhyde à 3,7 % à 4 °C pendant la nuit.
2. Incuber les tissus dans des tubes contenant 1 ml de solution de saccharose à 30 % dans du PBS pendant 12 h à 4 °C sur un rocher stable.
3. Pour enrober les tissus dans un composé à température de coupe optimale (OCT), versez 1 mL d’OCT dans un cryomoule, placez le tissu au milieu du cryomoule, puis versez 2 mL d’OCT sur le tissu.
4. Placez les cryomoules contenant des tissus sur de la glace sèche et congelez-les à l’aide d’azote liquide. Les échantillons sont prêts lorsque l’OCT devient tout blanc, ce qui prend généralement 3 min. Conserver les mouchoirs en papier enrobés d’OCT à -20 °C jusqu’à utilisation.
5. Obtenir des coupes de 10 μm dans le cryostat à -25 °C sur une lame de verre recouverte de poly-L-lysine et transférer la lame à température ambiante pour permettre à la section de tissu de fondre sur la lame. Conservez les lames à -20 °C jusqu’à utilisation.
6. Afin de confirmer l’absence de noyaux après décellularisation, effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) comme décrit ci-dessous.
   1. Incuber les lames à température ambiante pendant 10 min. Immerger les lames dans du PBS et les colorer avec 50 ml de solution d’hématoxyline prête à l’emploi dans un bocal de coloration pendant 3 minutes, puis les laver pendant 3 minutes à l’eau du robinet.
   2. Immerger les lames dans de l’éthanol à 95 % et les colorer avec 50 mL de solution d’éosine alcoolique à 0,5 % dans un bocal de coloration pendant 45 s.
7. Effectuez une coloration rouge Sirius pour montrer la rétention de la teneur en collagène après la décellularisation.
   1. Hydrater les lames avec du PBS et les immerger dans 50 mL de rouge de Sirius à 0,1 % dans une solution aqueuse saturée d’acide picrique dans un bocal de coloration pendant 1 h.
   2. Rincer les lames dans une solution d’acide acétique à 0,5 % pendant 5 s et déshydrater toutes les lames en les trempant dans de l’éthanol à 70 %, 95 % et 100 % séquentiellement pendant 1 min chacune.
8. Pour analyser la teneur en sGAG dans les échantillons de tissus, effectuez une coloration au bleu d’Alcian comme décrit ci-dessous.
   1. Immerger les lames dans 50 mL de bleu d’Alcian à 1 % dans une solution d’acide acétique à 3 % (pH 2,5) dans un bocal colorant pendant 30 min. Lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant 2 min.
   2. Déshydratez toutes les lames en les trempant dans de l’éthanol à 70 %, 95 % et 100 % séquentiellement pendant 1 min chacune.
9. Ajouter 0,1 mL de milieu de montage sur les échantillons et visualiser en microscopie optique avec un grossissement de 10x.

5. Caractérisation mécanique

1. Mettre en œuvre des mesures de rhéologie oscillatoire à l’aide d’un rhéomètre à géométrie de plaque parallèle.
2. Verser 250 μL de solution de prégel conservée sur de la glace sur une plaque inférieure prérefroidie (4 °C) pour éviter une gélification rapide.
3. Abaissez la plaque parallèle de 20 mm jusqu’à ce que la solution de prégel forme un disque avec une largeur d’espace de 1 mm entre les deux plaques.
4. Commencez la mesure immédiatement. Mesurez les modules de stockage et de perte dans le temps avec une fréquence et une déformation fixes tout en chauffant la plaque inférieure à 37 °C pendant 30 min pour observer la cinétique de gélification. Utilisez une fréquence fixe de 0,5 Hz et une déformation de 0,1 %.
5. Effectuez un test de récupération par fluage après que la valeur du module de stockage cesse d’augmenter et atteint un plateau.
6. Appliquez une contrainte de cisaillement de 1 Pa à l’hydrogel pendant 15 min, mesurez la déformation, déchargez l’échantillon de la contrainte et enregistrez le changement de valeur de déformation pendant 15 min.
7. Dessinez un graphique de tension en fonction du temps pour montrer le comportement de relaxation du stress. Répéter les mesures pour trois résumés dECM différents sous forme de répétitions.

Résultats

Décellularisation
La décellularisation du tissu pulmonaire bovin pour produire des hydrogels dECM qui récapituleraient le microenvironnement pulmonaire natif a été réalisée par des méthodes physiques (gel-dégel) et chimiques (Triton-X-100). Après la dissection, des morceaux de tissu ont été lavés avec des antibiotiques contenant du dH₂O pour éliminer les agents pathogènes qui peuvent ensuite affecter la stérilité des hydrogels dECM. Au total, cinq cycles alternant entre l?...

Discussion

Les hydrogels dérivés d’organes sont devenus des modèles prometteurs qui récapitulent la MEC des tissus natifs et imitent la fonction cellulaire organotypique. Bien que la MEC pulmonaire décellularisée ait souvent été utilisée en ingénierie tissulaire, une caractérisation approfondie de la composition et des propriétés mécaniques des biomatériaux permettra de mieux comprendre comment les interactions entre les cellules et la MEC peuvent être modulées pour modéliser les processus biologiques pendant l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298