Développement et optimisation d’un modèle organoïde dérivé d’un patient atteint d’un carcinome hépatocellulaire humain pour l’identification de cibles potentielles et la découverte de médicaments

Résumé

Nous fournissons une vue d’ensemble complète et affinons les protocoles existants pour la formation d’organoïdes du carcinome hépatocellulaire (CHC), englobant toutes les étapes de la culture des organoïdes. Ce système sert de modèle précieux pour l’identification de cibles thérapeutiques potentielles et l’évaluation de l’efficacité des candidats-médicaments.

Résumé

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une tumeur très répandue et mortelle dans le monde entier et sa découverte tardive et l’absence d’agents thérapeutiques spécifiques efficaces nécessitent des recherches supplémentaires sur sa pathogenèse et son traitement. Les organoïdes, un nouveau modèle qui ressemble beaucoup au tissu tumoral natif et qui peut être cultivé in vitro, ont suscité un intérêt considérable ces dernières années, avec de nombreux rapports sur le développement de modèles organoïdes pour le cancer du foie. Dans cette étude, nous avons réussi à optimiser la procédure et à établir un protocole de culture qui permet la formation d’organoïdes de CHC de plus grande taille avec des conditions de passage et de culture stables. Nous avons décrit de manière exhaustive chaque étape de la procédure, couvrant l’ensemble du processus de dissociation des tissus CHC, de placage d’organoïdes, de culture, de passage, de cryoconservation et de réanimation, et fourni des précautions détaillées dans cet article. Ces organoïdes présentent une similitude génétique avec les tissus CHC d’origine et peuvent être utilisés pour diverses applications, y compris l’identification de cibles thérapeutiques potentielles pour les tumeurs et le développement ultérieur de médicaments.

Introduction

Le carcinome hépatocellulaire (CHC), une tumeur¹ répandue et très diversifiée, a suscité une attention considérable au sein de la communauté médicale. La présence d’une plasticité de lignée et d’une hétérogénéité substantielle dans le CHC suggère que les cellules tumorales provenant de différents patients et même de lésions distinctes chez le même patient peuvent présenter des traits moléculaires et phénotypiques dissemblables, présentant ainsi des obstacles redoutables à l’avancement d’approches thérapeutiques innovantes 2,3,4,5 . Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les caractéristiques biologiques et les mécanismes de la résistance aux médicaments dans le CHC afin d’éclairer la formulation de stratégies de traitement plus efficaces.

Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont consacré leurs efforts au développement de modèles in vitro dans le but d’étudier le CHC ^3,4. Malgré certaines avancées, des limites persistent. Ces modèles englobent une gamme de techniques, telles que l’utilisation de lignées cellulaires, de cellules primaires et de xénogreffes dérivées de patients (PDX). Les lignées cellulaires servent de modèles in vitro pour la culture à long terme de cellules tumorales obtenues à partir de patients atteints de CHC, offrant les avantages de la commodité et de la facilité d’expansion. Les modèles cellulaires primaires impliquent l’isolement direct et la culture de cellules tumorales primaires à partir de tissus tumoraux de patients, fournissant ainsi une représentation des caractéristiques biologiques qui ressemblent beaucoup à celles des patients eux-mêmes. Les modèles PDX impliquent la transplantation de tissus tumoraux de patients chez la souris, dans le but de simuler plus fidèlement la croissance et la réponse tumorales. Ces modèles ont joué un rôle déterminant dans la recherche sur le CHC, mais ils présentent certaines limites, notamment l’hétérogénéité des lignées cellulaires et l’incapacité de se répliquer complètement dans des conditions in vivo. De plus, une culture in vitro prolongée peut entraîner une détérioration des caractéristiques et des fonctionnalités d’origine des cellules, ce qui pose des problèmes pour représenter avec précision les propriétés biologiques du CHC. De plus, l’utilisation des modèles PDX est à la fois longue et coûteuse³.

Pour remédier à ces limites et reproduire plus précisément les attributs physiologiques du CHC, l’utilisation de la technologie des organoïdes a été introduite comme une plate-forme de recherche prometteuse capable de dépasser les contraintes précédentes. Les organoïdes, qui sont des modèles cellulaires tridimensionnels cultivés in vitro, ont la capacité de reproduire la structure et la fonctionnalité d’organes réels. Cependant, dans le contexte du CHC, il existe certains défis dans l’établissement de modèles organoïdes. Ces défis comprennent des descriptions insuffisamment détaillées des procédures de construction des organoïdes CHC, l’absence de protocoles complets pour l’ensemble du processus de construction des organoïdes CHC et la petite taille typique des organoïdes cultivés ^6,7,8. À la lumière des dimensions généralement limitées des organoïdes cultivés, nous nous sommes efforcés de relever ces défis par le développement d’un protocole complet englobant l’ensemble de la construction des organoïdes CHC⁶. Ce protocole englobe la dissociation tissulaire, le placage d’organoïdes, la culture, le passage, la cryoconservation et la réanimation. En optimisant les étapes procédurales et en affinant la composition du milieu de culture, nous avons réussi à établir des modèles organoïdes de CHC capables d’une croissance soutenue et d’un passage à long terme ^6,8. Dans les sections suivantes, un compte rendu complet des subtilités opérationnelles et des facteurs pertinents impliqués dans la construction des organoïdes HCC sera présenté.

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Protocole

Des tissus biopsiés chez l’homme ont été prélevés sur le patient concerné à l’hôpital et à l’institut de cancérologie affiliés de l’Université médicale de Guangzhou, et le consentement éclairé des patients a été obtenu. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Établissement d’organoïdes de CHC dérivés de patients à partir d’échantillons chirurgicaux

REMARQUE : La mise en place d’organoïdes CHC comprend différentes étapes, à savoir la dissociation des tissus, le placage des organoïdes, la culture, le passage, la cryoconservation et la réanimation. Le processus de dissociation tissulaire nécessite une durée de 2 h, tandis que l’ensemencement des organoïdes sur une plaque prend environ 40 min. Par la suite, la première génération d’organoïdes de CHC subit une période de culture de 10 à 14 jours en utilisant un milieu d’isolement de CHC. Une fois qu’une densité satisfaisante est atteinte, des passages d’organoïdes sont effectués, ce qui nécessite 1 h. Les cultures subséquentes des organoïdes sont ensuite maintenues à l’aide d’un milieu d’expansion HCC pendant 7 à 10 jours, ce qui peut varier en fonction du taux de croissance et de l’état des organoïdes.

1. Dissociation tissulaire
   1. Préparation des fournitures et du matériel
      1. Prélever 1 à 2 cm³ de tissu CHC chez des patients qui n’ont pas reçu de traitement local ou systémique antérieur avant l’opération. Après la résection chirurgicale, maintenir le tissu à 4 °C dans une solution de conservation tissulaire (tableau 1) jusqu’au traitement.
         REMARQUE : Des échantillons de tissus frais de haute qualité sont essentiels à l’établissement réussi des organoïdes. Il est important de traiter les échantillons rapidement, idéalement dans les 1 à 4 heures suivant la résection chirurgicale pour maintenir la viabilité des tissus. Effectuer toutes les procédures subséquentes dans un environnement aseptique en utilisant des matériaux et des réactifs stériles.
      2. Préchauffer des plaques de culture cellulaire de surface à fixation ultra-basse (24 puits) pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C. Décongelez l’extrait de membrane basale (BME) congelé pendant la nuit à 4 °C jusqu’à juste avant utilisation.
         REMARQUE : Pour assurer une décongélation complète du BME, il doit être placé sur de la glace pendant au moins 3 h. La fusion complète du BME est essentielle pour une culture d’organoïdes réussie dans les étapes suivantes.
      3. Avant utilisation, s’assurer que la solution de digestion (tableau 1) est réchauffée à une température de 37 °C.
         REMARQUE : Préparez la solution de digestion fraîche dans un environnement aseptique et utilisez-la rapidement.
   2. Flux de traitement organisationnel
      1. Dans une armoire à flux laminaire, coupez le tissu tumoral en petits morceaux (0,5-1 mm³) à l’aide de ciseaux chirurgicaux sur une boîte de Pétri. Transférez le tissu coupé dans un tube conique de 15 mL et ajoutez 5 à 10 mL de milieu basal (tableau 1).
         REMARQUE : Le milieu basal (tableau 1) peut être conservé à 4 °C jusqu’à 1 mois.
      2. Utilisez une pipette barotropique pour éliminer autant de sang que possible et laissez-la reposer pendant 1 à 2 minutes pour éliminer une partie du surnageant, y compris les cellules sanguines et les caillots de graisse flottants. Répétez cette procédure deux fois.
      3. Centrifuger le mélange à 300 × g pendant 5 min à température ambiante, et retirer délicatement le surnageant. Ajouter 5 mL de la solution de digestion préchauffée (tableau 1) au tissu paré.
      4. Faites tourner le tube à 37 °C pour la digestion.
      5. Après 30 minutes de digestion initiale, recherchez de petits amas de cellules au microscope. Vérifiez toutes les 5 à 10 minutes pour éviter la surdigestion.
         REMARQUE : Le temps nécessaire à la digestion des tissus dépendra de la taille et du type de tissu. La digestion des tissus ne doit pas dépasser 90 min. Les tissus trop digérés apparaîtront au microscope sous la forme d’une grande feuille de cellules individuelles. Le niveau approprié de digestion est indiqué par le fait que la plupart d’entre eux sont des amas de cellules et ont une apparence semblable à celle du raisin.
      6. Arrêtez la digestion en ajoutant un milieu basal froid (tableau 1) et filtrez dans un nouveau tube de 50 ml muni d’un filtre cellulaire de 100 μm. Ajouter le milieu basal froid jusqu’à un volume de 50 ml.
      7. Centrifuger les cellules à 2 × g pendant 10 min à 8 °C. Retirez délicatement le surnageant et remettez la pastille en suspension en ajoutant 50 mL supplémentaires de milieu basal froid (tableau 1). Répétez cette étape deux fois.
         REMARQUE : La centrifugation à basse vitesse est utilisée pour permettre aux petits amas de cellules de se déposer, tandis que les cellules sanguines et les débris cellulaires sont toujours en suspension dans le surnageant ; Le processus est répété plusieurs fois pour obtenir une masse cellulaire tissulaire relativement pure.
2. Placage organoïde
   1. Après le deuxième lavage, retirez autant de surnageant que possible et remettez en suspension le nombre souhaité de cellules (1 000 à 5 000 cellules par puits d’une plaque à 24 puits) dans le BME approprié pour le placage.
      REMARQUE : Maintenez toujours le BME à 4 °C avant utilisation.
   2. Ajoutez du BME et suspendez les petits clusters de cellules dans Advanced DMEM/F-12 en ajoutant du BME et en pipetant doucement de haut en bas jusqu’à ce que les agrégats de cellules soient complètement suspendus. Contrôlez la concentration de BME entre 30% et 50%.
   3. Semez des gouttelettes de BME de 50 μL mélangées à des amas de cellules au centre de plaques de culture à 24 puits.
      REMARQUE : Dans la mesure du possible, ne laissez pas les gouttelettes se propager à la paroi latérale de la plaque du puits. La paroi latérale de la plaque à faible adsorption n’est pas dans un état à faible adsorption, et le contact entre les gouttelettes et la paroi latérale entraînera une adhérence, ce qui n’est pas propice à l’incubation ultérieure.
   4. Laisser les plaques avec les gouttelettes ajoutées se solidifier à 37 °C pendant 20 min. À la fin de l’incubation, ajouter 500 μL de milieu préchauffé (tableau 1) dans chaque puits et incuber dans un incubateur cellulaire à 37 °C.
3. Culture d’organoïdes
   1. Rafraîchir le milieu de culture (tableau 1) une fois tous les 2-3 jours. Au début de la culture, cultiver les organoïdes de CHC dans un milieu d’isolement de CHC (Tableau 1) pendant 2 semaines.
   2. Après 2 semaines d’incubation avec un milieu d’isolement du CHC, remplacer le milieu par un milieu d’expansion organoïde du CHC (tableau 1) (conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines).
   3. Rafraîchir le milieu de culture une fois tous les 3 jours.
   4. Après 7 à 10 jours de culture avec un milieu d’expansion HCC, lorsque l’organoïde a atteint la densité ou la taille appropriée, initier les interventions expérimentales ou le passage ou lyophiliser les organoïdes au besoin.
4. Passage d’organoïdes
   1. Préparation des fournitures et du matériel
      1. Préchauffer des plaques de culture cellulaire de surface à fixation ultra-basse (24 puits) pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C. Décongelez le BME congelé pendant la nuit à 4 °C jusqu’à juste avant utilisation.
      2. Préchauffer la solution de récolte d’organoïdes et le substitut de trypsine à 37 °C pendant 30 min.
   2. Processus de passage
      1. Après avoir retiré le milieu de culture de la plaque du puits, transférer la suspension organoïde dans un tube de 15 ml.
      2. Ajouter la solution de récolte d’organoïdes en fonction de la quantité de BME (500 μL de solution de récolte d’organoïdes pour 50 μL de BME) en raclant et en pipetant de haut en bas à l’aide d’un pistolet à pipette de 1 000 μL.
         REMARQUE : Évitez les bulles d’air tout au long du processus pour éviter la perte d’organoïdes, car la présence de bulles d’air indique une pression de pipetage plus élevée.
      3. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
      4. Aspirez doucement le BME à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et observez que le BME est complètement dissous. Observer toutes les 10 min jusqu’à ce qu’un amas de cellules organoïdes claires soit observé, puis centrifuger à 400 × g pendant 5 min à température ambiante et retirer autant de surnageant que possible.
         REMARQUE : À ce stade, l’organoïde peut être congelé et conservé.
      5. Pour la digestion enzymatique des organoïdes, ajouter 1 à 5 mL de substitut de trypsine (selon le nombre d’organoïdes) et incuber à 37 °C pendant 2 min. Observer au microscope le degré de digestion enzymatique pour déterminer si les organoïdes se dissocient en petits amas de 2 à 10 cellules ; Si ce n’est pas le cas, continuez la digestion enzymatique.
         REMARQUE : La surdigestion entraînera la lyse des amas de cellules organoïdes en cellules individuelles, ce qui diminuera leur viabilité et prolongera le temps de culture ultérieur.
      6. Ajouter le volume approprié de milieu basal froid (tableau 1) pour arrêter la digestion.
      7. Centrifuger les organoïdes à 400 × g pendant 5 min à 8 °C ; Retirez le surnageant autant que possible.
      8. Remettre en suspension le nombre souhaité d’organoïdes (1 000 à 5 000 organoïdes par puits d’une plaque à 24 puits) dans la matrice appropriée pour le placage. Suivez les mêmes étapes qu’à la section 1.2.
         REMARQUE : La densité de placage doit être optimisée en fonction du taux de croissance et de la taille des organoïdes.
      9. Faire passer les organoïdes tous les 10 jours dans un rapport de 1 :3 ou 1 :4 selon la densité de croissance des organoïdes.
5. Cryoconservation et réanimation d’organoïdes
   1. Cryoconservation d’organoïdes
      1. Préparer des tubes de lyophilisation, chaque tube confluent avec deux puits d’une plaque à 24 puits contenant des organoïdes.
      2. Suivez les étapes 1.4.2.1 à 1.4.2.4 pour le passage des organoïdes afin d’obtenir des organoïdes sans BME, et remettez doucement les organoïdes en suspension en ajoutant 500 μL/puits de solution de lyophilisation organoïde à une plaque à 24 puits.
         REMARQUE : En fonction de l’état de croissance et de la taille des organoïdes, il est recommandé de cryoconserver les organoïdes en culture jusqu’à la troisième génération.
      3. Transvaser la suspension dans des tubes de lyophilisation et la placer dans une boîte refroidie à gradient à -80 °C. Après un refroidissement en gradient à -80 °C pendant au moins 24 h, transférer les tubes dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
   2. Réanimation d’organoïdes
      1. Incuber les tubes lyophilisés dans un bain-marie à 37 °C et arrêter l’incubation lorsqu’il ne reste plus qu’un petit bloc de glace.
      2. Centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 8 °C pour éliminer complètement le surnageant.
      3. Suivre les sections 1.2 et 1.3 pour les opérations ultérieures.

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Résultats

Lors de la mise en œuvre de la procédure susmentionnée, l’émergence de sphéroïdes organoïdes CHC est généralement observable en l’espace de 3 jours (Figure 1). Les figures 1A et B montrent l’organoïde établi du CHC, qui développe rapidement des sphéroïdes compacts caractérisés par des bords arrondis et un cytosol perméable le premier jour de l’établissement. Au cours de la croissance des organoïdes CHC, l’utilisation...

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Discussion

L’un des avantages notables des modèles organoïdes dérivés des patients réside dans leur capacité à reproduire fidèlement les caractéristiques biologiques des tumeurs, englobant la structure tissulaire et le paysage génomique. Ces modèles font preuve d’un niveau de précision remarquable et reflètent efficacement l’hétérogénéité et la progression des tumeurs, même sur de longues périodes de culture ^6,8,9...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines