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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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Résumé

Présentation d’un protocole de criblage de médicaments à haut débit pour améliorer le sommeil en surveillant le comportement de sommeil des mouches des fruits dans un modèle de drosophile âgée.

Résumé

Le sommeil, une composante essentielle de la santé et du bien-être général, présente souvent des défis pour les personnes âgées qui souffrent fréquemment de troubles du sommeil caractérisés par une durée de sommeil raccourcie et des schémas fragmentés. Ces perturbations du sommeil sont également corrélées à un risque accru de diverses maladies chez les personnes âgées, notamment le diabète, les maladies cardiovasculaires et les troubles psychologiques. Malheureusement, les médicaments existants pour les troubles du sommeil sont associés à des effets secondaires importants tels que des troubles cognitifs et une dépendance. Par conséquent, il est urgent de mettre au point de nouveaux médicaments plus sûrs et plus efficaces contre les troubles du sommeil. Cependant, le coût élevé et la longue durée expérimentale des méthodes actuelles de dépistage des drogues restent des facteurs limitatifs.

Ce protocole décrit une méthode de criblage rentable et à haut débit qui utilise Drosophila melanogaster, une espèce dont le mécanisme de régulation du sommeil est très conservé par rapport aux mammifères, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les troubles du sommeil chez les personnes âgées. En administrant divers petits composés à des mouches âgées, nous pouvons évaluer leurs effets sur les troubles du sommeil. Les comportements de sommeil de ces mouches sont enregistrés à l’aide d’un dispositif de surveillance infrarouge et analysés à l’aide du package de données open source Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Ce protocole offre une approche de dépistage peu coûteuse, reproductible et efficace pour la régulation du sommeil. Les mouches des fruits, en raison de leur cycle de vie court, de leur faible coût d’élevage et de leur facilité de manipulation, constituent d’excellents sujets pour cette méthode. À titre d’illustration, la réserpine, l’un des médicaments testés, a démontré sa capacité à favoriser la durée du sommeil chez les mouches âgées, soulignant l’efficacité de ce protocole.

Introduction

Le sommeil, l’un des comportements essentiels à la survie humaine, est caractérisé par deux états principaux : le sommeil paradoxal (REM) et le sommeil non rapide (NREM)1. Le sommeil NREM comprend trois stades : N1 (la transition entre l’éveil et le sommeil), N2 (sommeil léger) et N3 (sommeil profond, sommeil à ondes lentes), représentant la progression de l’éveil au sommeil profond1. Le sommeil joue un rôle crucial dans la santé physique et mentale2. Cependant, le vieillissement réduit la durée totale du sommeil, l’efficacité du sommeil, le pourcentage de sommeil à ondes lentes et le pourcentage de sommeil paradoxal chez les adultes3. Les personnes âgées ont tendance à passer plus de temps en sommeil léger qu’en sommeil à ondes lentes, ce qui les rend plus sensibles aux réveils nocturnes. Au fur et à mesure que le nombre de réveils augmente, le temps de sommeil moyen diminue, ce qui entraîne un rythme de sommeil fragmenté chez les personnes âgées, ce qui peut être associé à une excitation excessive des neurones Hcrt chez la souris4. De plus, les déclins des mécanismes circadiens liés à l’âge contribuent à un décalage plus précoce de la durée du sommeil 5,6. En combinaison avec la maladie physique, le stress psychologique, les facteurs environnementaux et l’utilisation de médicaments, ces facteurs rendent les personnes âgées plus sensibles aux troubles du sommeil, tels que l’insomnie, le trouble du comportement en sommeil paradoxal, la narcolepsie, les mouvements périodiques des jambes, le syndrome des jambes sans repos et les troubles respiratoires du sommeil 7,8.

Des études épidémiologiques ont montré que les troubles du sommeil sont étroitement liés aux maladies chroniques chez les personnes âgées9, notamment la dépression 10, les maladies cardiovasculaires11 et la démence12. La prise en charge des troubles du sommeil joue un rôle crucial dans l’amélioration et le traitement des maladies chroniques et l’amélioration de la qualité de vie des personnes âgées. À l’heure actuelle, les patients s’appuient principalement sur des médicaments tels que les benzodiazépines, les non-benzodiazépines et les agonistes des récepteurs de la mélatonine pour améliorer la qualité du sommeil13. Cependant, les benzodiazépines peuvent entraîner une régulation négative des récepteurs et une dépendance après une utilisation à long terme, provoquant de graves symptômes de sevrage lors de l’arrêtdu traitement. Les médicaments autres que les benzodiazépines comportent également des risques, notamment la démence16, les fractures 17 et le cancer18. L’agoniste des récepteurs de la mélatonine couramment utilisé, le ramelteon, réduit la latence du sommeil mais n’augmente pas la durée du sommeil et présente des problèmes liés à la fonction hépatique en raison de l’élimination importante du premier passage19. L’agomélatine, un agoniste des récepteurs de la mélatonine et un antagoniste des récepteurs de la sérotonine, améliore l’insomnie liée à la dépression, mais présente également un risque de lésions hépatiques20. Par conséquent, il y a un besoin urgent de médicaments plus sûrs pour traiter ou soulager les troubles du sommeil. Cependant, les stratégies actuelles de criblage des drogues, basées sur des expériences moléculaires et cellulaires combinées à des systèmes automatisés et à des analyses informatiques, sont coûteuses et prennent beaucoup de temps21. Les stratégies de conception de médicaments basées sur la structure, qui s’appuient sur la structure et les propriétés des récepteurs, nécessitent une compréhension claire de la structure tridimensionnelle des récepteurs et manquent de capacités prédictives pour les effets des médicaments22.

En 2000, sur la base des critères de sommeil proposés par Campbell et Tobler en 198423, les chercheurs ont établi des modèles animaux simples pour étudier le sommeil 24, y compris Drosophila melanogaster, qui présentait des états de sommeil25,26. Malgré les différences anatomiques entre la drosophile et l’homme, de nombreux composants neurochimiques et voies de signalisation régulant le sommeil chez la drosophile sont conservés dans le sommeil des mammifères, ce qui facilite l’étude des maladies neurologiques humaines27,28. La drosophile est également largement utilisée dans les études sur le rythme circadien, malgré les différences d’oscillateurs de base entre les mouches et les mammifères 29,30,31. Par conséquent, la drosophile sert d’organisme modèle précieux pour l’étude du comportement du sommeil et le dépistage des drogues liées au sommeil.

Cette étude propose une approche rentable et simple basée sur le phénotype pour le criblage de médicaments à petites molécules pour traiter les troubles du sommeil à l’aide de mouches âgées. La régulation du sommeil chez la drosophile est très conservée25, et le déclin du sommeil observé avec l’âge peut être réversible par l’administration de médicaments. Ainsi, cette méthode de dépistage basée sur le phénotype du sommeil peut intuitivement refléter l’efficacité du médicament. Nous nourrissons les mouches avec un mélange du médicament à l’étude et de la nourriture, surveillons et enregistrons le comportement de sommeil à l’aide du moniteur d’activité de la drosophile (DAM)32 et analysons les données acquises à l’aide du package de données SCAMP2020 open source de MATLAB (Figure 1). L’analyse statistique est effectuée à l’aide d’un logiciel de statistiques et de graphiques (voir le tableau des matériaux). À titre d’exemple, nous démontrons l’efficacité de ce protocole en présentant des données expérimentales sur la réserpine, une petite molécule inhibitrice du transporteur vésiculaire de la monoamine qui augmenterait le sommeil33. Ce protocole fournit une approche précieuse pour identifier les médicaments pour traiter les problèmes de sommeil liés à l’âge.

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Protocole

Ce protocole utilise les mouches w1118 âgées de 30 jours du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, voir le tableau des matériaux).

1. Préparation des mouches des fruits âgées

  1. Préparation des aliments
    1. Préparez le milieu de culture standard de l’amidon de maïs en mélangeant 50 g/L de flocons de maïs, 110 g/L de sucre, 5 g/L de gélose et 25 g/L de levure. Faites chauffer les cornflakes et la levure avec de l’eau pour gélatiniser, puis dissolvez complètement toutes les substances.
    2. Lorsque le milieu refroidit à 50-60 °C, ajoutez 6 mL/L d’acide propionique et emballez-les rapidement dans des flacons de culture.
  2. Élevage de mouches et préparation de mouches âgées
    1. Élevez la souche de mouche w1118dans des bouteilles contenant un milieu de culture standard d’amidon de maïs et placez les bouteilles dans un incubateur à température constante à 25 ° C, 68 % d’humidité relative, des conditions d’éclairage de 500 à 1000 lux et un cycle lumière : obscurité de 12 h : 12 h.
    2. Transférez les mouches dans une nouvelle bouteille tous les 7 jours en fonction du cycle de croissance des mouches, en gardant l’âge des individus dans la même bouteille constant.
    3. Récupérez le nouveau lot de mouches qui éclosent de la bouteille d’origine 3 jours après leur transfert et mettez-les dans une nouvelle bouteille. Suivant le principe de changer le biberon tous les 7 jours, ils seront cultivés jusqu’à l’âge de 30 jours environ.

2. Préparation d’aliments médicinaux et de tubes en verre pour la surveillance

NOTE : La procédure de préparation des tubes de verre suit les travaux de Jin et al. avec les modifications34.

  1. Nettoyage et séchage de tubes en verre
    1. Placez le tube de verre (5 mm de diamètre x 65 mm de longueur, voir tableau des matériaux) dans un grand bécher, faites-le tremper et faites-le bouillir avec de l’eau distillée pendant 20 min. Répétez 3 fois.
    2. Retirez et regroupez le tube en verre, rincez l’intérieur avec de l’eau distillée double 3 à 5 fois et placez-le dans un four pour le séchage.
  2. Préparation d’un milieu de culture simple (100 mL)
    1. Dissoudre 1,5 g d’agar-agar et 5 g de saccharose dans de l’eau distillée double, chauffer et concentrer jusqu’à 100 ml.
    2. Ajouter 600 μL d’acide propionique lorsque le milieu refroidit à environ 70 °C, ce qui l’empêche de se solidifier à l’aide d’un bain-marie à température constante.
    3. Ajouter environ 4 mL de milieu simple et de réserpine (voir le tableau des matériaux) dans un petit bécher de 10 mL jusqu’à ce que le médicament atteigne 20 μM ou 50 μM. Ajouter le diméthylsulfoxyde (DMSO) à la concentration de 0,2 % dans le groupe témoin négatif.
  3. Préparation des tubes de verre contenant les médicaments
    1. Pour faciliter l’écoulement du milieu, insérez soigneusement une longueur appropriée de tube de verre dans un petit bécher. Le milieu entrera naturellement dans le tube de verre en raison de la pression atmosphérique.
    2. Retirez le tube de verre lorsque le milieu de culture est complètement solidifié et essuyez la paroi extérieure pour obtenir un tube de verre de surveillance avec un milieu de culture contenant des médicaments à une extrémité.
    3. Chauffez la paraffine solide dans un bécher jusqu’à ce qu’elle fonde à 70 °C, placez l’extrémité du tube de verre près de l’aliment dans le liquide de paraffine sur environ 5 mm et retirez-la rapidement. Attendez que la paraffine se solidifie pour sceller l’extrémité alimentaire du tube en verre.

3. Conception expérimentale et traitement des mouches

  1. Concevez l’expérience pour le traitement des mouches en suivant le tableau 1.

4. Assemblage de la drosophile et surveillance du sommeil

NOTE : La procédure d’assemblage de la drosophile suit les travaux de Jin et al.34 avec des modifications.

  1. Anesthésiez les mouches avec du gaz CO2 , mettez-les dans des tubes en verre scellés à la paraffine (un par tube) et bloquez l’extrémité non alimentaire avec une boule de coton absorbante pour empêcher les mouches de s’échapper et assurer la circulation de l’air.
  2. Chargez les tubes sur le moniteur infrarouge pour les surveiller.
    1. Assemblez les tubes de verre contenant les mouches sur un moniteur infrarouge dans la même direction, et notez le numéro du moniteur et le numéro de trou correspondant à chaque médicament.
    2. Ajustez l’alignement de chaque tube et faites passer les rayons infrarouges verticalement à travers le centre de la plage d’activité de la mouche.
    3. Placez le moniteur à l’intérieur d’un incubateur à 25 °C situé dans la chambre noire du sommeil des mouches, en suivant les paramètres spécifiés : température de 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (équivalent à l’heure locale de 20h00) et ZT24 (équivalent à l’heure locale de 08h00). Cette configuration garantit que les mouches connaissent des périodes alternées de 12 h de lumière et d’obscurité.
      REMARQUE : Essayez de ne pas ouvrir la porte tant que la collecte des données de surveillance n’est pas terminée afin de maintenir un environnement stable dans l’incubateur pendant la surveillance.
    4. Démarrez la surveillance à l’aide du système DAM2 (voir le tableau des matériaux).
    5. Une fois la surveillance terminée, téléchargez les données collectées au format .txt à partir du système.

5. Traitement des données

REMARQUE : Le traitement des données à l’aide du système DAM, DAMFileScan107 et SCAMP a été effectué conformément aux instructions figurant sur leurs sites Web officiels (voir le tableau des matériaux).

  1. Importez le fichier txt ci-dessus dans le logiciel DAMFileScan107 pour le numériser et divisez-le au besoin pour obtenir des données de sommeil.
    1. Définissez l’heure de début des données de segmentation sur 8 h 01 (segmentation de 1 min) ou 8 h 00 (segmentation de 30 min) le troisième matin suivant le démarrage des moniteurs, et l’heure de fin est de 8 h 00 trois jours après l’heure de début (Figure 2A1).
      REMARQUE : Les mouches doivent s’adapter à l’environnement de surveillance pendant au moins une journée. Ainsi, on peut régler l’heure de début des données fractionnées à 8 heures du matin le troisième jour après le démarrage du moniteur.
    2. Divisez les données à des intervalles de 1 min et 30 min. Changez l’option « Bin Length » sur 1 minute, changez l’option « Output File Type » en Channel files, renommez et sortez. La méthode de segmentation des données en 30 minutes est la même que ci-dessus (Figure 2A2-5).
      REMARQUE : Lors de la segmentation des données à des intervalles de 1 min et 30 min, le renommage final des deux fichiers doit être cohérent ; sinon, il risque d’être illisible lors d’un traitement Matlab ultérieur. Si nécessaire, le nom du fichier peut être modifié après la sortie pour faciliter la différenciation.
  2. Traitement des données à l’aide de SCAMP2020
    1. Ouvrez le package de programmes SCAMP2020 dans Matlab, puis double-cliquez sur Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figure 2B).
    2. Ajoutez son sous-dossier « Vecsey SCAMP Scripts » au chemin d’accès, recherchez le fichier « scamp.m » dans ce dossier et exécutez-le. Dans la fenêtre contextuelle suivante, sélectionnez les dossiers de processus 1 min et 30 min dans l’ordre (Figure 2C,D).
    3. Sélectionnez un moniteur, cliquez sur Charger les tracés individuels à prévisualiser (Figure 3A1) et vérifiez l’image qui s’affiche. Décochez le canal correspondant des mouches mortes (Figure 3A2, Figure 3B).
    4. Répétez les étapes ci-dessus pour vérifier tous les moniteurs.
    5. Renommez chaque canal de chaque moniteur en fonction de la drogue correspondante à tester (Figure 3A3), sélectionnez tous les moniteurs et cliquez sur ANALYSER les données sélectionnées pour l’analyse (Figure 3A4).
    6. Par défaut, choisissez l’option sélectionnée, cliquez sur Analyser pour le groupe choisi, cochez la case Exporter les données, et enfin cliquez sur GRAPHIQUE 30 min Types de données pour tous les jours pour les groupes sélectionnés et EXPORTER toutes les données pour afficher les résultats (Figure 3C).
  3. Sélectionnez le fichier nommé s30 dans le fichier CSV, recherchez la valeur moyenne et les données d’erreur standard correspondantes pour chaque moniteur, sauvegardez-le dans Excel pour le modifier et l’ajuster, puis collez-le dans GraphPad Prism (voir la table des matériaux) pour dessiner un diagramme d’état de veille (Figure 4A,B).
  4. Recherchez le fichier nommé « stdur » et calculez les valeurs moyennes du sommeil diurne, nocturne et total pour chaque mouche dans les trois jours (Figure 4A,C). Collez les données dans le logiciel Prism pour effectuer le test de différence et dessiner un graphique.

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Résultats

La réserpine est une petite molécule inhibitrice du transporteur vésiculaire de la monoamine (VMAT), qui inhibe la recapture des monoamines dans les vésicules présynaptiques, ce qui entraîne une augmentation du sommeil33. Les effets favorisant le sommeil de la réserpine ont été examinés chez des mouches âgées de 30 jours, le groupe témoin étant nourri uniquement avec le solvant diméthylsulfoxyde (DMSO). Dans le groupe Réserpine, les mouches plus âgées ont montré une augmentation...

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Discussion

La méthode décrite est adaptée au dépistage rapide des somnifères de petite et moyenne taille. À l’heure actuelle, la plupart des méthodes courantes de criblage de médicaments à haut débit sont basées sur des niveaux biochimiques et cellulaires. Par exemple, la structure et les propriétés du récepteur sont examinées pour rechercher des ligands spécifiques qui peuvent s’y lier22. Une autre approche consiste à analyser le mode de liaison et la force des fragments moléculaires d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire du professeur Junhai Han pour leurs discussions et leurs commentaires. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 32170970 à Y.T et le « Cyanine Blue Project » de la province du Jiangsu à Z.C.Z.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AgerBIOFROXX8211KG001
Artificial Climate BoxPRANDTPRX-1000Aofficial website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity MonitorTriKineicsDAM2official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2systemTriKineicsversion:v3.03official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScanTriKineicsversion:1.0.7.0official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl SulfoxideSIGMA276855
Drosophila Activity Monitoring IncubatorTritech ResearchDT2-CIRC-TKofficial website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila BottlesBiologix51-17720official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118Bloomington Drosophila Stock Center BDSC_3605
ExcelMicrosoftversion:Excel 2016official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubesTriKineticsPPT5x65official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022bMathWorksversion:9.13.0.2049777official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
PrismGraphPadVersion:Prism 8.0.1official website:https://www.graphpad.com/features
ReserpineMACKLINR817202-1g
SaccharoseSIGMA1245GR500
SCAMPVecsey LabN/Aofficial website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

Références

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