Une approche globale pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux

Résumé

Cette étude décrit une méthode rapide et efficace pour l’analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux par la dissolution des caillots, la coloration cellulaire et l’examen sanguin de routine.

Résumé

La thrombose cérébrale, un caillot sanguin dans une artère ou une veine cérébrale, est le type d’infarctus cérébral le plus courant. L’étude des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux est importante pour le diagnostic, le traitement et le pronostic. Cependant, les approches actuelles pour étudier les composants cellulaires des caillots sont principalement basées sur la coloration in situ , ce qui ne convient pas à l’étude complète des composants cellulaires car les cellules sont étroitement enveloppées dans les caillots. Des études antérieures ont réussi à isoler une enzyme fibrinolytique (sFE) de Sipunculus nudus, qui peut dégrader directement la fibrine réticulée, libérant les composants cellulaires. Cette étude a permis d’établir une méthode complète basée sur la sFE pour étudier les composants cellulaires du thrombus cérébral. Ce protocole comprend la dissolution du caillot, la libération des cellules, la coloration des cellules et l’examen sanguin de routine. Selon cette méthode, les composants cellulaires pourraient être étudiés quantitativement et qualitativement. Les résultats représentatifs des expériences utilisant cette méthode sont présentés.

Introduction

Les maladies cérébrovasculaires sont l’une des trois principales maladies qui peuvent menacer la santé humaine, parmi lesquelles les maladies cérébrovasculaires ischémiques représentent plus de 80%. La thrombose cérébrale et la thrombose veineuse cérébrale sont les maladies cérébrovasculaires ischémiques les plus concernées aujourd’hui, principalement causées par des caillots sanguins cérébraux ^1,2. Si le traitement n’est pas effectué correctement, il aura des taux élevés d’invalidité et de mortalité et un taux de récidive élevé après la sortie³.

Récemment, un nombre croissant d’études ont montré que les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux sont étroitement corrélés au diagnostic, au traitement et au pronostic de la thrombose cérébrale ^4,5,6. Par conséquent, la disponibilité de données sur la composition du thrombus, en particulier les composants cellulaires, est importante pour le diagnostic clinique et le traitement. Malheureusement, les méthodes actuellement disponibles ne permettent pas d’analyser de manière exhaustive le composant du caillot sanguin quantitativement et qualitativement. Par exemple, la coloration in situ basée sur Martius Scarlett Blue ne peut étudier que les globules rouges/blancs de certaines tranches du caillot⁷. La coloration in situ basée sur l’immunohistochimie (IHC) ne permet d’étudier que des composants sanguins limités de certaines tranches du caillot à l’aide de leurs anticorps⁸. Les méthodes basées sur l’imagerie microscopique ne s’intéressent qu’à la structure spécifique du caillot⁹. De plus, toutes ces méthodes sont laborieuses et chronophages¹⁰. À ce jour, les procédures permettant d’étudier quantitativement et qualitativement les composants des cellules des thrombus cérébraux n’ont pas été rapportées. Il est largement reconnu que la fibrine réticulée enveloppe étroitement les cellules sanguines dans les caillots¹¹. Par conséquent, la dégradation spécifique de la fibrine réticulée et la libération des cellules intactes sont essentielles pour l’analyse précise des composants cellulaires.

Des travaux antérieurs ont isolé une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE), qui peut dégrader la fibrine de manière spécifique et rapide¹². Ici, une méthode d’analyse des composants cellulaires des thrombus cérébraux basée sur l’activité unique de la sFE a été proposée. Ce protocole a utilisé la sFE pour dégrader d’abord la fibrine des caillots, puis a analysé les composants cellulaires par coloration de Wright et examen sanguin de routine^13,14. Selon cette méthode, les composants cellulaires des thrombus cérébraux peuvent être étudiés quantitativement et qualitativement. Ce protocole simple et efficace pourrait être appliqué pour l’analyse des composants cellulaires d’autres caillots sanguins.

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Protocole

La recherche a été réalisée conformément aux directives institutionnelles du Comité d’éthique médicale de l’Université Huaqiao. Les caillots sanguins cérébraux ont été retirés chirurgicalement et prélevés au premier hôpital de Quanzhou, affilié à l’Université médicale du Fujian, avec le consentement éclairé des patients.

1. Prétraitement des caillots sanguins

1. Placez les caillots sur un plat propre, ajoutez 5 mL de sérum physiologique à l’aide d’une pince à épiler, secouez doucement le plat et retirez le sérum physiologique à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois.
2. Coupez les caillots en petits morceaux (moins de 5 mm x 5 mm x 5 mm) avec des ciseaux. Ajouter 5 mL de sérum physiologique, agiter doucement le plat et retirer le sérum physiologique à l’aide d’une pipette.
   REMARQUE : Répétez le rinçage trois fois. Assurez-vous qu’aucun caillot n’est aspiré pendant le rinçage.
3. Transférez les caillots sur une autre plaque en U propre.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici (stocker la plaque entre 2 et 8 °C) et redémarré plus tard.

2. Thrombolyse

1. Préparer la solution de travail de sFE en ajustant la concentration de sFE à 2000 U/mL avec une solution saline physiologique.
   REMARQUE : Le sFE a été préparé selon les protocoles bien établis du Tang Lab¹⁵.
2. Ajouter 300 μL de solution de travail sFE dans les caillots prétraités.
3. Effectuez le premier cycle de dégradation.
   1. Incuber le mélange de sFE et de caillots à 37 °C pendant 0,5 h.
      REMARQUE : Le transfert traité avec une solution saline physiologique a été défini comme témoin négatif. Ne faites pas pivoter l’échantillon sur l’agitateur.
   2. Mélangez délicatement l’échantillon. Transférez la partie liquide dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette propre.
      REMARQUE : Les caillots restants ont été utilisés pour une autre série de dégradations.
   3. Centrifuger la partie liquide à 200 × g pendant 5 min à 4 °C.
   4. Transférez le surnageant dans un autre tube propre à l’aide d’une pipette pour obtenir la solution de sFE récupérée.
   5. Mélangez délicatement la précipitation cellulaire avec 50 μL de solution saline physiologique.
      REMARQUE : Le mélange cellulaire a été stocké entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure.
4. Effectuez une dégradation ultérieure.
   1. Dégrader les caillots restants (étape 2.3.2) avec la solution de sFE récupérée (étape 2.3.4) à 37 °C pendant 0,5 h.
      REMARQUE : Les étapes de repos étaient les mêmes que celles du premier cycle de dégradation. Le processus de dégradation a été terminé jusqu’à ce que l’ensemble des caillots soit dégradé.
5. Effectuez la collecte de cellules.
   1. Préparez l’échantillon de cellules sanguines en recueillant le mélange cellulaire de chaque cycle de dégradation.

3. La coloration de Wright

1. Effectuer un frottis cellulaire.
   1. Ajustez les cellules à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL.
   2. Ajoutez 5 μL de cellules sur la lame de verre enduite de poly-L lysine, puis étalez-les à l’aide de la lamelle.
   3. Évaporez le liquide à température ambiante.
2. Effectuez la coloration.
   1. Ajouter doucement 200 μL de colorant de Wright (voir le tableau des matériaux) au frottis cellulaire et ajouter 600 μL de colorant B de Wright pour mélanger uniformément.  Colorer pendant 10 min à température ambiante.
   2. Rincez délicatement la teinture à l’eau claire.
      REMARQUE : Le frottis cellulaire coloré peut être conservé à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
3. Effectuer de l’imagerie microscopique.
   1. Examinez les cellules colorées à l’aide d’un microscope optique (voir le tableau des matériaux).

4. Examen sanguin de routine

1. Ajustez les cellules à une densité de 1 x 10⁶ cellules/mL.
2. Analysez les composants cellulaires tels que les plaquettes, les érythrocytes, les globules blancs, les lymphocytes, les neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles, les basophiles et les granulocytes immatures à l’aide d’un analyseur d’autohématologie selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

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Résultats

Au stade initial du processus de dégradation, il a été constaté que les caillots sanguins avaient une structure compacte rouge et que la solution de travail était incolore. Après une incubation de 30 minutes, la solution de travail est devenue rouge clair, ce qui indique que les cellules sanguines croisées ont été libérées dans la solution de travail. La plupart des caillots ont été dissous lors de l’allongement du temps d’incubation à 5 h, et la solution de travail est devenue rouge clair. Au contraire...

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Discussion

La sFE est un agent fibrinolytique qui peut dégrader la fibrine directement et efficacement^12,16. Ici, la sFE a été utilisée pour dégrader la fibrine réticulée des caillots sanguins cérébraux, libérer les cellules enfermées dans les caillots et analyser qualitativement et quantitativement les composants cellulaires des caillots. Les données microscopiques et l’examen sanguin de routine ont indiqué que les cellules enfermées avaient été libérée...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agglutination Reaction Plate	ROTEST	RTB-4003
Auto Hematology Analyzer	SYSMEX	XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer	SANYO	MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Clean bench	AIRTECH	BLB-1600
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Culture Dish (100 mm)	NEST	704001
DHG Series Heating and Drying Oven	SENXIN	DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Filter Membrane (0.22 µm)	Millex GP	SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge	Cence	H1650-W
Microscope Slides	CITOGLAS	01-30253-50
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Normal Saline	CISEN	H37022337
Optical Microscope	Nikon	ECLIPSE E100
Parafilm	Bemis	PM-996
Phosphate-Buffered Saline	Beyotime	C0221A
Pipette Tip (1 mL )	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Scalpel	MARTOR	23111
Small-sized Vortex Oscillator	Kylin-Bell	VORTEX KB3
Tweezer	Hystic	HKQS-180
Wright Staining Solution	Beyotime	C0135-500ml