Développement de tests RT-qPCR multiplex en temps réel pour la détection du SRAS-CoV-2, de la grippe A/B et du MERS-CoV

Résumé

Nous présentons deux kits de RT-qPCR en une étape basés sur des sondes pour les virus respiratoires courants. Le premier test concerne le SRAS-CoV-2 (N), la grippe A (H1N1 et H3N2) et la grippe B. Le second concerne le SARS-Cov-2 (N) et le MERS (UpE et ORF1a). Ces tests peuvent être mis en œuvre avec succès dans n’importe quel laboratoire spécialisé.

Résumé

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui cause la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) constitue une menace sérieuse pour la santé du grand public. Pendant les saisons grippales, la propagation du SRAS-CoV-2 et d’autres virus respiratoires peut entraîner un fardeau de maladies respiratoires difficile à gérer à l’échelle de la population. Pour cela, les virus respiratoires SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B et syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) devront être surveillés de près au cours des prochaines saisons d’automne et d’hiver, en particulier dans le cas du SRAS-CoV-2, de la grippe A et de la grippe B, qui partagent des facteurs épidémiologiques similaires tels que les populations sensibles, le mode de transmission et les syndromes cliniques. En l’absence de tests spécifiques à la cible, il peut être difficile de différencier les cas de ces virus en raison de leurs similitudes. Par conséquent, un test multiplex sensible et ciblé qui peut facilement différencier ces cibles virales sera utile pour les professionnels de la santé. Dans cette étude, nous avons développé un test en temps réel basé sur la transcriptase inverse et la PCR à l’aide d’un kit RT-qPCR en une étape R3T développé en interne pour la détection simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV. Avec aussi peu que 10 copies de leurs ARN synthétiques, nous pouvons identifier avec succès les cibles du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV simultanément avec une spécificité de 100 %. Ce test s’avère précis, fiable, simple, sensible et spécifique. La méthode développée peut être utilisée comme test de diagnostic optimisé du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV dans les hôpitaux, les centres médicaux et les laboratoires de diagnostic, ainsi qu’à des fins de recherche.

Introduction

La pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en cours est causée par le nouveau coronavirus connu sous le nom de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)¹. En raison de la forte contagiosité du SAR-CoV-2 et de sa capacité de transmission rapide, la pandémie de COVID-19 est apparue dans la ville de Wuhan, en Chine, et s’est propagée rapidement dans le monde entier. Cela a finalement conduit à l’apparition de signes de détresse respiratoire et même à la mort ^2,3,4. La COVID-19 a été déclarée pandémie dans plus de 213 pay....

Protocole

1. Expression et purification de la Taq polymérase

1. Construire un plasmide avec un marqueur d’hexa-histidine clivable à l’extrémité C de l’enzyme.
2. Transformer 50 ng du vecteur d’expression en souche E. coli BL21-(DE3) en suivant le protocole standard³⁸.
3. Inoculer les cellules transformées dans quatre flacons de 6 L contenant chacun 2 L de bouillon de milieu 2YT à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 de 0,8 ou le numéro de cellule 6,4 x 10⁸ soit atteint.
4. Induire l’expression de la Taq polymérase avec 0,5 mM d’isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) et....

Discussion

Le système de santé du monde entier est lourdement chargé de l’économie en raison des taux élevés d’infection et de mortalité dus à la propagation de virus respiratoires courants tels que le SRAS-CoV-2, la grippe A/B et les variants MERS-CoV 12,19,20. Motivés par le sens des responsabilités vis-à-vis de l’allègement de ce fardeau, nous avons réalisé la nécessité d’un test de diagnostic rapide, précis et .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter cups	Thermo Scientific	291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer	Novex	LC2675
6-well tissue culturing plates	Corning	353046
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	A701-3
Ampicillin	Corning	61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL	Cytiva	17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%	Thermo Scientific	A14207.60
DH10Bac competent cells	Fisher Scientific	10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)	Thermo Scientific	68100
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water	Ambion	AM9930
dNTPs	Thermo Scientific	R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells	Invitrogen	C600003
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Elution Buffer	Qiagen	19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)	Expression Systems	96-001-01
FBS Solution	Gibco	A38400-01
Fugene (transfection reagent)	Promega	E2311
Gentamicin	Fisher Scientific	15750060
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-500
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896-100ml
Imidazole	Sigma Aldrich	56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA	Twist Bioscience	103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA	Twist Bioscience	103002
Influenza B synthetic RNA	Twist Bioscience	103003
IPTG	Gold Biotechnology	I3481C100
Kanamycin	Gibco	11815-032
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB Broth media	Fisher Scientific	BP1426-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-10G
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA	Twist Bioscience	103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1093
Miniprep kit	Qiagen	27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL	Cytiva	17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL	Cytiva	17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free	Applied Biosystems	4311971
Potassium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-1
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein marker	Fermentas	26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)	Applied Biosystems
S.O.C medium	Fisher Scientific	15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA	Twist Bioscience	102024
Sf9 insect cells	Gibco	A35243
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL	Cytiva	29401323
Tetracycline	IBI Scientific	IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris-HCl	Affymetrix	22676
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379-100ml
X-Gal	Invitrogen	B1690