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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons deux kits de RT-qPCR en une étape basés sur des sondes pour les virus respiratoires courants. Le premier test concerne le SRAS-CoV-2 (N), la grippe A (H1N1 et H3N2) et la grippe B. Le second concerne le SARS-Cov-2 (N) et le MERS (UpE et ORF1a). Ces tests peuvent être mis en œuvre avec succès dans n’importe quel laboratoire spécialisé.

Résumé

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui cause la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) constitue une menace sérieuse pour la santé du grand public. Pendant les saisons grippales, la propagation du SRAS-CoV-2 et d’autres virus respiratoires peut entraîner un fardeau de maladies respiratoires difficile à gérer à l’échelle de la population. Pour cela, les virus respiratoires SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B et syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) devront être surveillés de près au cours des prochaines saisons d’automne et d’hiver, en particulier dans le cas du SRAS-CoV-2, de la grippe A et de la grippe B, qui partagent des facteurs épidémiologiques similaires tels que les populations sensibles, le mode de transmission et les syndromes cliniques. En l’absence de tests spécifiques à la cible, il peut être difficile de différencier les cas de ces virus en raison de leurs similitudes. Par conséquent, un test multiplex sensible et ciblé qui peut facilement différencier ces cibles virales sera utile pour les professionnels de la santé. Dans cette étude, nous avons développé un test en temps réel basé sur la transcriptase inverse et la PCR à l’aide d’un kit RT-qPCR en une étape R3T développé en interne pour la détection simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV. Avec aussi peu que 10 copies de leurs ARN synthétiques, nous pouvons identifier avec succès les cibles du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV simultanément avec une spécificité de 100 %. Ce test s’avère précis, fiable, simple, sensible et spécifique. La méthode développée peut être utilisée comme test de diagnostic optimisé du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV dans les hôpitaux, les centres médicaux et les laboratoires de diagnostic, ainsi qu’à des fins de recherche.

Introduction

La pandémie de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en cours est causée par le nouveau coronavirus connu sous le nom de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)1. En raison de la forte contagiosité du SAR-CoV-2 et de sa capacité de transmission rapide, la pandémie de COVID-19 est apparue dans la ville de Wuhan, en Chine, et s’est propagée rapidement dans le monde entier. Cela a finalement conduit à l’apparition de signes de détresse respiratoire et même à la mort 2,3,4. La COVID-19 a été déclarée pandémie dans plus de 213 pays, ce qui devrait entraîner une forte augmentation du nombre de cas confirmés, comme en témoignent les articles publiés par différentes études de recherche 3,5. La COVID-19 se transmet principalement par de petites gouttelettes respiratoires que les personnes infectées libèrent dans l’environnement, puis sont exposées aux personnes vulnérables par inhalation ou par contact étroit avec des surfaces contaminées. Lorsque ces gouttelettes entrent en contact avec la muqueuse des yeux, de la bouche ou du nez, une personne peut être infectée6. Les statistiques publiées par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) montrent qu’il y a eu plus de 76 millions de cas confirmés de la pandémie dans le monde, avec un nombre stupéfiant de 7 millions de décès7. Ainsi, les Nations Unies ont classé la pandémie causée par la maladie COVID-19 comme une catastrophe en raison de son impact direct sur la vie de milliards de personnes dans le monde et de ses effets économiques, environnementaux et sociaux de grande portée.

Les initiatives de santé publique, y compris les tests approfondis, la détection précoce, la recherche des contacts et l’isolement des cas, se sont toutes avérées cruciales pour garder cette pandémie sous contrôle 8,9,10,11. Les mois d’hiver augmenteront la circulation d’autres virus respiratoires comme la grippe A et B avec des symptômes semblables à ceux de la COVID-19, ce qui rendra difficile l’identification, le suivi et l’isolement précoces des cas de COVID-19. Chaque année, les éclosions de grippe A et B commencent à la fin de l’automne ou au début de janvier avec une saisonnalité prévisible12. De nombreux traits épidémiologiques sont communs aux virus SARS-CoV-2 et grippal. En outre, partageant des similitudes dans les populations sensibles qui comprennent les enfants, les personnes âgées, les immunodéprimés et les personnes souffrant de comorbidités chroniques telles que l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive, l’insuffisance cardiaque et rénale ou le diabète12,13. Ces virus partagent non seulement des populations vulnérables, mais aussi des voies de transmission de contact et de gouttelettes respiratoires14. On s’attend à ce que les patients contractent plus d’un de ces virus respiratoires àl’approche de la saison de la grippe. Pour cela, le dépistage du SARS-CoV-2 et des virus de la grippe doit être effectué sur les patients symptomatiques avant qu’ils ne soient isolés. Il n’est pas possible d’effectuer des tests séparés pour les trois virus (SRAS-CoV-2, grippe A et grippe B) en raison du manque mondial de ressources pour l’extraction et le diagnostic des acides nucléiques. Afin de les dépister tous en une seule réaction, une méthode ou un test doit être développé.

Le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV est un membre de la famille des coronavirus humains (CoV). Les premiers isolats du virus MERS-CoV provenaient d’un patient hospitalisé en Arabie saoudite qui était décédé en septembre 2012 des suites de problèmes respiratoires aigus15. Il existe des preuves qui suggèrent que les dromadaires sont un hôte de réservoir important pour le MERS-CoV. Il a été prouvé que les virus des dromadaires infectés sont zoonotiques et peuvent donc infecter les humains16,17. Les humains infectés par ce virus peuvent le transmettre à d’autres personnes par contact étroit18. Au 26 janvier 2018, il y avait eu 2143 cas confirmés en laboratoire d’infection par le MERS-CoV, dont 750 décès dans lemonde. Les symptômes les plus typiques du MERS-CoV sont la toux, la fièvre et l’essoufflement. Des infections par le MERS-CoV ont également été signalées comme présentant des symptômes de pneumonie, de diarrhée et de maladies gastro-intestinales20. À l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin commercial ou de traitement spécifique contre le MERS-CoV. Par conséquent, un diagnostic rapide et précis est essentiel pour prévenir les épidémies généralisées de MERS-CoV et différencier le MERS-CoV de la maladie SARS-CoV-2.

À ce jour, de nombreuses approches ont été proposées pour détecter ces virus telles que la RT-PCR multiplex 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 et CRISPR/Cas329, le dosage immunologique à flux latéral30, les capteurs biomoléculaires à base de papier31, le test SHERLOCK dans un pot32, l’aptamère d’ADN33, l’isotherme médié par boucle amplification (LAMP)19,34, etc. Chacune des méthodes susmentionnées présente des avantages et des inconvénients uniques en termes de sensibilité et de spécificité. Parmi ces méthodes, le test basé sur l’amplification des acides nucléiques : qRT-PCR multiplex, est la plus courante et est considérée comme l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du MERS-CoV.

Dans cette étude, nous avons conçu et évalué diverses combinaisons d’amorces et de sondes pour la détection efficace, précise et simultanée du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, du MERS-CoV à l’aide d’ARN viraux synthétiques à torsion standard. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande les tests multiplexés développés pour les gènes cibles du MERS-CoV ou du SRAS-CoV-2. Ces gènes codent généralement pour des protéines et des complexes qui contribuent à la formation d’un complexe de réplication/transcription (RTC)35, comme la région du cadre de lecture ouvert 1a (ORF1a) utilisée pour le dosage du MERS-CoV. De plus, les protéines structurales sont codées par les gènes utilisés dans les tests diagnostiques tels que le gène de la région amont de l’enveloppe (upE) et le gène de la nucléocapside (N) qui sont utilisés pour les tests MERS-CoV et SARS-Cov-2, respectivement35,36. Nous avons utilisé le kit RT-qPCR en une étape R3T en interne pour établir la RT-qPCR pour la détection des virus37. La détection des virus, la sensibilité, la spécificité et la plage dynamique de notre kit RT-qPCR en une étape R3T et de nos ensembles d’amorces ont été testés et évalués à l’aide de dilutions en série 10 fois des ARN synthétiques à torsion standard. La limite pratique de détection la plus basse était d’environ 10 copies de transcription par réaction. En conséquence, le kit RT-qPCR en une étape R3T interne et les ensembles d’amorces/sondes peuvent être utilisés et mis en œuvre avec succès pour le diagnostic simultané de routine du SRAS-CoV-2, de la grippe A, de la grippe B et du SRAS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocole

1. Expression et purification de la Taq polymérase

  1. Construire un plasmide avec un marqueur d’hexa-histidine clivable à l’extrémité C de l’enzyme.
  2. Transformer 50 ng du vecteur d’expression en souche E. coli BL21-(DE3) en suivant le protocole standard38.
  3. Inoculer les cellules transformées dans quatre flacons de 6 L contenant chacun 2 L de bouillon de milieu 2YT à 37 °C en agitant à 170 tr/min jusqu’à ce que la DO 600 de 0,8 ou le numéro de cellule 6,4 x 108 soit atteint.
  4. Induire l’expression de la Taq polymérase avec 0,5 mM d’isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) et poursuivre l’incubation à 16 °C pendant 18 h avec agitation.
  5. Récoltez les cellules en les faisant tourner vers le bas à 4 °C à 7808 x g pendant 10 min. Remettre les pastilles en suspension dans 200 mL d’un tampon de lyse par polymérase Taq glacé (tableau 1) dans 5 mL/g de pastille cellulaire.
  6. Incuber les cellules avec du lysozyme (2 mg/mL de tampon de lyse) et des inhibiteurs de protéase pendant 45 minutes, puis passer le lysat à travers un perturbateur cellulaire à 30 kPsi et centrifuger à 22 040 x g pendant 30 minutes à 4 °C pour séparer les débris cellulaires.
  7. Faites chauffer le surnageant pendant 15 min à 85 °C. Essorage à 95 834 x g pendant 1 h à 4 °C. Récupérez le surnageant et filtrez-le sur de la glace à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
  8. Effectuer la purification des protéines à l’aide de la chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) en faisant d’abord passer l’échantillon dans une colonne Ni-NTA HP de 5 mL à un débit de 4 mL/min à l’aide du tampon polymérase A Taq (Tableau 2 ; Graphique 1A).
  9. Laver avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon polymérase Taq A et 4 % de tampon polymérase Taq B (tableau 2). Éluer la protéine liée avec un gradient linéaire à l’aide du tampon polymérase B Taq sur 20 CV dans un flacon de 100 ml.
  10. Faire passer l’éluant dans le flacon de 100 mL à travers une colonne échangeuse cationique de 5 mL à 4 mL/min à l’aide du tampon polymérase Taq C (Tableau 2 ; Graphique 1A).
  11. Laver avec 20 CV de tampon polymérase C à 100 % Taq et de tampon polymérase D à 5 % Taq (tableau 2).
  12. Élue avec un gradient linéaire à l’aide du tampon polymérase Taq D (tableau 2) à partir de 5 % à 100 %.
  13. Vérifier les fractions éluées en effectuant l’électrophorèse sur gel SDS-PAGE 39 suivie d’une coloration sur gel 40 comme décrit précédemment. Brièvement, prenez 10 μL de chaque fraction et ajoutez un volume égal de 2x le colorant de chargement SDS. Dénaturer l’échantillon à 90°C pendant 10 min. Chargez les échantillons sur du gel SDS-PAGE à 10 % et faites couler le gel pendant 25 min à 200 V. Colorez le gel avec Coomassie Brilliant Blue, puis détachez-le.
  14. Prélever toutes les fractions qui contiennent de la Taq polymérase purifiée et les dialyser contre le tampon de stockage de la taq polymérase (tableau 3) à 4 °C. Préparez brièvement 2 L du tampon de stockage et plongez la cassette de dialyse dans le tampon pendant 2 min pour l’hydrater. Injectez les fractions prélevées à l’aide d’une aiguille dans la cassette de dialyse et laissez-la toute la nuit dans le tampon de dialyse à 200 tr/min sur l’agitateur.
  15. Après la dialyse, mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre, faire 10 μL d’aliquotes, congeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
    REMARQUE : Filtrez tous les tampons pour la purification à l’aide d’un filtre de 0,45 μm avant de les charger dans le système FPLC.

2. Expression de MMLV-RT dans le système d’expression et de purification des cellules d’insectes

  1. Génération et isolement de l’ADN Bacmid
    1. Clonez la séquence de MMLV-RT avec une balise TEV-8xHis-Strep clivable en C-terminale comme décrit précédemment41.
    2. Mélangez 100 ng du vecteur d’expression dans 50 μL de cellules DH10Bac et mélangez doucement en tapotant le tube.
    3. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min. Choc thermique des cellules pendant 1 min à 42 °C.
    4. Transférer immédiatement sur de la glace et ajouter 400 μL de milieu S.O.C. Incuber à 37 °C en agitant pendant 4 h.
    5. Plaquer 10 μL et 15 μL du mélange sur des plaques de gélose LB contenant trois antibiotiques ; 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline et 7 μg/mL de gentamicine ainsi que 40 μg/mL d’IPTG et 100 μg/mL de X-Gal pour la sélection bleu-blanc.
    6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 48 h. Choisissez plusieurs colonies blanches et une colonie bleue comme témoin, et remettez-les sur des plaques de gélose LB fraîches contenant les antibiotiques ci-dessus. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 °C.
    7. Après avoir confirmé le phénotype blanc, prélevez quelques colonies et inoculez-les dans 10 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine, 10 μg/mL de tétracycline et 7 μg/mL de gentamicine dans des tubes de 50 mL.
    8. Incuber la culture à 37 °C en agitant à 170 tr/min pendant la nuit. Abaissez les cellules en les faisant tourner à 22 040 x g pendant 10 minutes.
    9. Décanter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 250 μL de solution de remise en suspension à partir d’un kit de minipréparation (cette solution doit être manipulée conformément aux instructions du fabricant), puis transférer la solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
    10. Ajouter 250 μL de solution de lyse, mélanger délicatement et incuber pendant 3 min. Ajouter 350 μL de solution neutralisante, inverser 2x-3x et centrifuger à 22 040 x g pendant 10 min.
    11. Transférez le surnageant dans un tube frais et ajoutez un volume égal d’isopropanol glacé et incubez pendant 30 min à -20 °C.
    12. Descendez l’ADN précipité en le faisant tourner à 22 040 x g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec 700 μL d’éthanol glacé à 70 %, 2x.
    13. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette sans toucher la pastille. Laissez les granulés sécher à l’air libre dans la hotte à flux laminaire pendant 5 à 10 minutes ou jusqu’à ce qu’aucun liquide ne soit visible dans le tube. Dissoudre la pastille dans 100 μL de tampon EB.
  2. Transfection de bacmides et amplification virale
    1. Préparation du virus P1
      1. Dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits, semer ~ 9 x 105 cellules/puits dans 2 mL de milieu de culture de cellules d’insectes.
      2. Incubez la plaque pendant ~30 min à température ambiante pour permettre aux cellules de se fixer.
      3. Préparer le mélange Bacmid/Fugene comme suit : mélanger 1 μg d’ADN Bacmid et 300 μL de milieu de cellules d’insectes dans un tube. Dans un autre tube, mélanger 8 μL de réactif de transfection et 300 μL de milieu de cellules d’insectes. Mélangez les deux mélanges par pipetage doux et laissez agir ~30 min à température ambiante pour que le complexe bacmide/réactif de transfection se forme.
      4. Ajouter le mélange complexe bacmide (~210 μL) dans chaque puits goutte à goutte et sceller la plaque avec un film transparent.
      5. Incuber l’assiette à 27 °C pendant 3-4 jours.
      6. Prenez le milieu qui contient le virus, ajoutez le FBS (concentration finale de 2 %), filtrez à l’aide d’un filtre de 0,45 μm et conservez-le à 4 °C dans l’obscurité comme stock de virus P1.
    2. Préparation du virus P2
      1. Transfecter 50 mL de cellules d’insectes à 2 x 106 cellules/mL avec 3 mL de virus P1 dans une fiole de culture.
      2. Incuber à 27 °C en agitant à 100 tr/min pendant 4 à 6 jours jusqu’à ce que le pourcentage de cellules mortes atteigne 25 à 30 %.
      3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min et recueillir le surnageant qui contient le virus.
      4. Ajouter le FBS jusqu’à une concentration finale de 2 %, filtrer à travers un filtre de 0,45 μm et aliquote 1 mL chacun et conserver à -80 °C comme bouillon de virus P2.
    3. Préparation du virus P3
      1. Transfecter 100 mL de cellules d’insectes à raison de 2 x 106 cellules/mL avec les 2 mL de virus P2 dans une fiole de culture.
      2. Incuber à 27 °C en agitant à 100 tr/min pendant 3-4 jours jusqu’à ce que le pourcentage de cellules mortes atteigne 15%-20%.
      3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et recueillir le surnageant qui contient le virus.
      4. Ajouter le FBS jusqu’à l’obtention d’une concentration finale de 2 %. Filtrez à travers un filtre de 0,45 μm. Il peut être conservé à l’obscurité à 4 °C pendant 1 mois.
  3. Expression et purification du MMLV-RT dans les cellules d’insectes
    1. Ajouter 5 mL de virus P3 à des cellules d’insectes fraîches à une densité de 2 x 106 cellules/mL (flacon de 700 mL/2L) dans un total de 6 flacons.
    2. Récoltez les cellules après 55-60 h de post-transfection en les faisant tourner à 7808 x g pendant 10 min.
    3. Remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 200 mL de tampon de lyse MMLV-RT (tableau 4). Faire passer le lysat dans un perturbateur cellulaire à 15 kPsi et centrifuger à 22 040 x g pendant 30 min à 4 °C.
    4. Transvaser le surnageant dans de nouveaux tubes et faire tourner à nouveau à 95 834 x g à 4 °C pendant 1 h. Récupérez le surnageant et filtrez-le sur de la glace à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
    5. Commencer la purification des protéines à l’aide de la FPLC en faisant d’abord passer l’échantillon dans une colonne Ni-NTA Excel de 5 mL (Figure 1B) à un débit de 4 mL/min à l’aide du tampon MMLV-RT A (Tableau 5).
    6. Laver la colonne avec 10 CV de tampon MMLV-RT A et 4 % de tampon MMLV-RT B (tableau 5) et éluer la protéine avec le gradient linéaire de tampon MMLV-RT B sur 20 CV dans un flacon de 100 mL.
    7. Faire passer l’échantillon élué dans la colonne de 5 mL de streptocoque (figure 1B) équilibrée avec le tampon MMLV-RT C (tableau 5).
    8. Laver la colonne avec 10 CV de tampon C MMLV-RT à 100 % et éluer la protéine avec un gradient linéaire avec 20 CV de tampon D (tableau 5).
    9. Vérifiez les fractions éluées en exécutant SDS-PAGE comme indiqué aux étapes 1.13.-1.14. et recueillir les fractions qui contiennent du MMLV-RT purifié pour les dialyser dans le tampon de stockage du MMLV-RT (tableau 6) à 4 °C.
    10. Mesurer la concentration en protéines à l’aide de Nanodrop, aliquote, surgeler dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C.
      REMARQUE : Filtrez tous les tampons pour la purification à l’aide d’un filtre de 0,45 μm avant de les charger dans le système FPLC.

3. Préparation des composants du kit RT-qPCR en une étape R3T multiplex en interne

  1. Préparation du mélange tampon
    1. Préparez le tampon 2x pour la réaction RT-qPCR qui contient les réactifs précédemment illustrés en37. Préparez tous les réactifs dans de l’eau sans DNase/RNase et le mélange tampon conservé dans un congélateur à -20 °C.
  2. Préparation des ensembles d’amorces et des sondes et des mélanges d’apprêts
    REMARQUE : Les sondes et les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau 7. Le kit multiplexé Influenza et SARS-CoV-2 contient 3 sondes et 4 jeux d’amorces directes et inverses. Les sondes sont marquées aux extrémités 5′ à l’aide de rapporteurs 6-carboxyfluorescéine (FAM) pour InfA, Texas Red-XN pour le SARS-CoV-2 (gène N) et Yakima Yellow pour InfB. Le kit multiplexé MERS-CoV et SARS-CoV-2 contient 3 sondes et 3 jeux d’amorces directes et inverses. Les sondes sont également marquées aux extrémités 5′ à l’aide de rapporteurs Texas Red-XN pour le MERS-CoV (gène ORF1a), VIC pour le MERS-CoV (gène UpE) et 6-carboxyfluorescéine (FAM) SARS-CoV-2 (gène N).
    1. Préparer un mélange d’amorces contenant toutes les amorces et sondes énumérées dans le tableau 7 avec une concentration finale de 6,7 μM pour chaque amorce directe et inverse et de 1,25 μM pour chaque sonde dans un tube de 1,5 mL. Conservez le mélange d’apprêt au congélateur à -20 °C. Utilisez le tampon d’élution pour constituer le volume requis.
  3. Préparation d’un mélange enzymatique
    1. Préparer le mélange d’enzymes Taq polymérase (30 U/μL) et MMLV-RT (60 ng/μL) dans le tampon de stockage de la polymérase Taq, comme indiqué dans le tableau 3 , pour obtenir le volume requis. Effectuez cette étape sur de la glace et conservez le mélange enzymatique à -20 °C.
  4. Modèle d’ARN
    1. Remettre en suspension les ARN synthétiques du SRAS-CoV-2, de la grippe A H1N1, de la grippe A, du H3N2, de la grippe B et du MERS-CoV séparément dans 100 μL de tampon 1x Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl et 1 mM EDTA (pH 8,0) pour obtenir un stock de 1 x 106 copies d’ARN/μL.
    2. Mélanger les ARN synthétiques pour la RT-qPCR dans les configurations suivantes : 1) SARS-CoV-2, Influenza A et Influenza B en ajoutant 5 μL de chaque souche virale à un volume de 50 μL pour obtenir 1 x 10copies d’ARN de 5 cm/μL ; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV en ajoutant 5 μL de chaque souche virale à un volume de 50 μL pour obtenir 1 x 105 copies d’ARN/μL. Effectuer des dilutions en série 10 fois de chaque mélange d’ARN synthétique allant de 1 x 105 copies d’ARN/μL à 10 copies d’ARN/μL.
      REMARQUE : Assurez-vous d’utiliser de l’eau glacée sans DNase/RNase pour préparer la dilution en série des modèles.

4. Test RT-qPCR en une étape multiplexé en interne pour le SRAS-CoV-2, la grippe A, la grippe B et le SRAS-CoV-2, le MERS-CoV

REMARQUE : Désinfectez les surfaces du poste de travail et utilisez un gabarit de plaque à 96 puits pour planifier la disposition des plaques PCR.

  1. Préparation d’une plaque à 96 puits
    1. Décongeler 2x tampon et mélange d’apprêt. Conservez le mélange d’enzymes sur de la glace.
    2. Dans chaque puits, ajoutez 10 μL de mélange tampon 2x, 1,5 μL de mélange d’amorce, 1 μL de mélange enzymatique, 6,5 μL d’eau exempte de DNase/RNase et 1 μL du mélange d’ARN correspondant qui doit être testé. Le volume final dans chaque puits est de 20 μL. Veuillez vous référer à la mise en page préparée pour obtenir de l’aide sur cette étape.
      REMARQUE : Il est recommandé de faire un mélange maître basé sur le nombre de réactions qui contiennent tous les réactifs à l’exception de l’échantillon d’ARN pour éviter le biais de pipetage. De plus, effectuez les réactions en double ou en triple exemplaire pour éviter les erreurs techniques.
    3. Scellez la plaque avec un joint adhésif de plaque PCR et centrifugez brièvement pendant 1 min pour recueillir tout le liquide au fond de la plaque. Assurez-vous que chaque puits a le même volume de liquide et qu’il est exempt de bulles avant de transférer les échantillons vers la machine qPCR.
      REMARQUE : Toutes les réactions PCR doivent être configurées sur de la glace.
  2. Programme de PCR
    1. Ouvrez le programme de la machine qPCR en temps réel et choisissez les propriétés expérimentales suivantes :
      Le type de bloc : Rapide à 96 puits (0,1 ml)
      Configuration de l’expérience : Courbe standard
      Réactifs : Réactifs TaqMan
      Propriétés d’exécution : Standard.
    2. Définissez toutes les cibles génétiques et leur colorant rapporteur comme présenté dans le tableau 7. De plus, définissez des noms d’échantillons pour chaque réaction à tester afin de faciliter l’analyse des courbes d’amplification.
    3. Affectez des cibles et des échantillons à la disposition des plaques du programme en fonction de la plaque à 96 puits.
    4. Réglez le programme de cycle suivant dans l’instrument PCR comme suit :
      55 °C pendant 10 min
      40 cycles : 94 °C pendant 1 min
      94 °C pendant 10 s
      68 °C pendant 10 s
      68 °C pendant 20 s ; ici acquièrent de la fluorescence.
    5. Transférez la plaque sur la machine qPCR en temps réel et placez-la dans le support en veillant à l’orientation correcte de la plaque et commencez le cycle.
    6. Choisissez l’emplacement du fichier pour enregistrer les données expérimentales.
  3. Analyse des données
    1. Il est essentiel d’examiner d’abord les diagrammes d’amplification produits par le programme qPCR. Analysez la limite de détection pour évaluer la concentration minimale d’ARN qui peut être détectée.
    2. Tracez le logarithme du nombre de copies d’ARN sur l’axe des abscisses et la valeur moyenne de Ct correspondante sur l’axe des ordonnées pour évaluer la sensibilité du dosage. La pente et le R2 indiquent la fiabilité et l’efficacité de la réaction.

Résultats

Au cours des dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans l’approche diagnostique pour la détection des virus respiratoires courants à l’aide des approches PCR 21,22,23,24,25. Cependant, malgré ces avancées, l’approche multiplexée, qui permet de détecter plusieurs virus en un seul test, n’a pas été largement mise en ...

Discussion

Le système de santé du monde entier est lourdement chargé de l’économie en raison des taux élevés d’infection et de mortalité dus à la propagation de virus respiratoires courants tels que le SRAS-CoV-2, la grippe A/B et les variants MERS-CoV 12,19,20. Motivés par le sens des responsabilités vis-à-vis de l’allègement de ce fardeau, nous avons réalisé la nécessité d’un test de diagnostic rapide, précis et ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Université des sciences et technologies du roi Abdallah par le biais d’un financement de base et du National Term Grand Challenge (NTGC) à S.M.H.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

Références

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