Ex Vivo Imagerie calcique pour le modèle d’épilepsie de la drosophile

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 pour surveiller les activités épileptiformes. Le protocole fournit un outil précieux pour étudier les événements ictaux chez la drosophile adulte par imagerie calcique ex vivo , permettant d’explorer les mécanismes potentiels de l’épilepsie au niveau cellulaire.

Résumé

L’épilepsie est un trouble neurologique caractérisé par des crises récurrentes, partiellement corrélées à l’origine génétique, affectant plus de 70 millions de personnes dans le monde. Malgré l’importance clinique de l’épilepsie, l’analyse fonctionnelle de l’activité neuronale dans le système nerveux central reste à développer. Les progrès récents de la technologie d’imagerie, combinés à l’expression stable d’indicateurs calciques génétiquement codés, tels que GCaMP6, ont révolutionné l’étude de l’épilepsie à l’échelle du cerveau et à l’échelle d’une cellule. Drosophila melanogaster est apparu comme un outil pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’épilepsie en raison de sa génétique moléculaire sophistiquée et de ses tests comportementaux. Dans cette étude, nous présentons un protocole novateur et efficace pour l’imagerie calcique ex vivo chez la drosophile adulte exprimant GCaMP6 afin de surveiller les activités épileptiformes. Le cerveau entier est préparé à partir de cac, un gène bien connu de l’épilepsie, pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal afin d’identifier l’activité neuronale à la suite du test de comportement de type crise sensible à la bang. Les mouches knockdown cac ont montré un taux plus élevé de comportement convulsif et d’activités calciques anormales, y compris plus de gros pics et moins de petits pics que les mouches de type sauvage. Les activités calciques étaient corrélées à un comportement semblable à celui des crises. Cette méthodologie est une méthodologie efficace pour le criblage des gènes pathogènes de l’épilepsie et l’exploration du mécanisme potentiel de l’épilepsie au niveau cellulaire.

Introduction

L’épilepsie, un trouble neurologique chronique complexe caractérisé par la récurrence de crises spontanées et non provoquées et une activité aberrante des réseaux neuronaux, a touché plus de 70 millions de personnes dans le monde, ce qui en fait l’une^{des maladies} neurologiques les plus courantes 1 et entraîne le lourd fardeau des familles et de la société. Compte tenu de l’impact de l’épilepsie, de nombreuses études ont été menées pour identifier l’étiologie des crises, dont la génétique a été approuvée comme cause principale de nombreux types d’épilepsies ou de syndromes épileptiques². Au cours des dernières décennies, ....

Protocole

1. Protocole pour l’essai sensible à la bang

1. Établir les mouches expérimentales en croisant la lignée de conducteur tub-Gal4 avec la lignée UAS-cac-RNAi via le système Gal4/UAS²¹. Collecter les mouches vierges de la lignée tub-Gal4 et les mouches mâles de la lignée UAS-cac-RNAi . Ensuite, transférez les mouches vierges et mâles dans le même flacon pour récolter la progéniture.
   REMARQUE : La ligne de pilote tub-Gal4 permettra d’obtenir un knockdown global du gène cac . Utilisez la lignée UAS-cac-RNAi comme groupe témoin.
2. Après 3 à 5 jours d’écl....

Discussion

L’ion calcium sert de deuxième messager crucial, jouant un rôle central dans une gamme de réponses physiologiques et physiopathologiques aux perturbations chimiques et électriques. De plus, l’élément topologique des canaux P/Q présynaptiques, codé par le gène CACNA1A humain, a été identifié comme responsable de la médiation de la décharge de divers neurotransmetteurs, dont le glutamate 30,31,32, et est étroitement lié à l’épilepsie

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background