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Nous décrivons ici un test interne d’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires. Des tests basés sur l’activité et des tests basés sur l’antigène ont été utilisés pour mesurer le facteur tissulaire dans les vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de plasma humain. Les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène.
Le facteur tissulaire (TF) est un récepteur transmembranaire du facteur (F) VII et FVIIa. Le complexe TF/FVIIa initie la cascade de coagulation en activant à la fois FIX et FX. Le TF est libéré des cellules dans la circulation sous forme de vésicules extracellulaires (VE). Le niveau de VE TF-positif (+) est augmenté dans diverses maladies, y compris le cancer, les infections bactériennes et virales et la cirrhose, et est associé à la thrombose, à la coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité. Il existe deux façons de mesurer les VE TF+ dans le plasma : les tests basés sur l’antigène et l’activité. Les données indiquent que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène. Cet article décrit notre test d’activité EVTF interne basé sur un test de génération FXa en deux étapes. FVIIa, FX et calcium sont ajoutés aux échantillons contenant de l’EV TF+ pour générer de l’FXa en présence ou en l’absence d’anticorps anti-TF afin de distinguer la génération de FXa dépendante de la TF de la génération de FXa indépendante de la TF. Un substrat chromogène clivé par FXa est utilisé pour déterminer le niveau de FXa, tandis qu’une courbe standard générée avec un TF recombinant relipidé est utilisée pour la détermination de la concentration de TF. Ce test d’activité EVTF interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité TF commercial.
La coagulation sanguine est initiée par la liaison du facteur (F) VII/VIIa au facteur tissulaire (TF)1. Le complexe TF/FVIIa active à la fois FIX et FX pour activer la coagulation sanguine1. Il existe deux formes de TF pleine longueur, liée à une membrane : cryptée et active. De plus, il existe une forme alternative d’épissage de TF (asTF). La sphingomyéline et la phosphatidylcholine dans le feuillet externe de la membrane cellulaire maintiennent la TF dans un état crypté 2,3,4. Lorsque les cellules sont activées ou endommagées,....
La recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (numéro de protocole : 14-2108).
1. Collecte de sang auprès des donneurs
Un résultat positif donne une valeur de contrôle positive de ≥0,5 pg/mL et une valeur de contrôle négative de <0,5 pg/mL. Il est préférable de trouver un répondeur LPS élevé avec une activité EVTF de >1,0 pg/mL pour un contrôle positif. Le résultat représentatif montre l’activité EVTF des VE isolés du plasma du sang total de 11 donneurs sains, avec et sans activation du LPS (Figure 4). Six donneurs sur onze (donneurs 2, 4, 5, 8, 10, 11) répondaient moyennement à haut au .......
Ici, le protocole de notre test d’activité EVTF interne est présenté. Il y a trois étapes critiques dans le protocole. Lors de la reconstitution de la pastille EV, il est important de pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV, même si elle n’est pas visible. Une reconstitution incomplète de la pastille EV entraînera un faux négatif ou une sous-estimation des valeurs d’activité EVTF des échantillons. Deuxièmement, l’utilisation de HBSA-Ca(+) est essentielle à l’étape 6.5 du protoco.......
Il n’y a pas d’intérêts concurrents à divulguer.
Ce travail a été soutenu par le NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) et la chaire John C. Parker (N.M.). Nous tenons à remercier Mme Sierra J. Archibald pour ses commentaires utiles
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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