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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats Représentatifs
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons ici un test interne d’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires. Des tests basés sur l’activité et des tests basés sur l’antigène ont été utilisés pour mesurer le facteur tissulaire dans les vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de plasma humain. Les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène.

Résumé

Le facteur tissulaire (TF) est un récepteur transmembranaire du facteur (F) VII et FVIIa. Le complexe TF/FVIIa initie la cascade de coagulation en activant à la fois FIX et FX. Le TF est libéré des cellules dans la circulation sous forme de vésicules extracellulaires (VE). Le niveau de VE TF-positif (+) est augmenté dans diverses maladies, y compris le cancer, les infections bactériennes et virales et la cirrhose, et est associé à la thrombose, à la coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité. Il existe deux façons de mesurer les VE TF+ dans le plasma : les tests basés sur l’antigène et l’activité. Les données indiquent que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène. Cet article décrit notre test d’activité EVTF interne basé sur un test de génération FXa en deux étapes. FVIIa, FX et calcium sont ajoutés aux échantillons contenant de l’EV TF+ pour générer de l’FXa en présence ou en l’absence d’anticorps anti-TF afin de distinguer la génération de FXa dépendante de la TF de la génération de FXa indépendante de la TF. Un substrat chromogène clivé par FXa est utilisé pour déterminer le niveau de FXa, tandis qu’une courbe standard générée avec un TF recombinant relipidé est utilisée pour la détermination de la concentration de TF. Ce test d’activité EVTF interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité TF commercial.

Introduction

La coagulation sanguine est initiée par la liaison du facteur (F) VII/VIIa au facteur tissulaire (TF)1. Le complexe TF/FVIIa active à la fois FIX et FX pour activer la coagulation sanguine1. Il existe deux formes de TF pleine longueur, liée à une membrane : cryptée et active. De plus, il existe une forme alternative d’épissage de TF (asTF). La sphingomyéline et la phosphatidylcholine dans le feuillet externe de la membrane cellulaire maintiennent la TF dans un état crypté 2,3,4. Lorsque les cellules sont activées ou endommagées,....

Protocole

La recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (numéro de protocole : 14-2108).

1. Collecte de sang auprès des donneurs

  1. Prélever du sang total à l’aide d’une ponction veineuse propre dans la veine antécubitale à l’aide d’une aiguille de 21 G. Jetez les 3 premiers mL de sang, car cette portion de sang peut contenir de l’acide folique provenant de cellules périvasculaires.
  2. Prélever 2,7 ou 1,8 mL (selon la taille des tubes) de sang dans un vacutainer contenant 3,2 % de citrate de sodium (0,109 mol/L). Ne remplissez pas trop ou pas assez les tu....

Résultats Représentatifs

Un résultat positif donne une valeur de contrôle positive de ≥0,5 pg/mL et une valeur de contrôle négative de <0,5 pg/mL. Il est préférable de trouver un répondeur LPS élevé avec une activité EVTF de >1,0 pg/mL pour un contrôle positif. Le résultat représentatif montre l’activité EVTF des VE isolés du plasma du sang total de 11 donneurs sains, avec et sans activation du LPS (Figure 4). Six donneurs sur onze (donneurs 2, 4, 5, 8, 10, 11) répondaient moyennement à haut au .......

Discussion

Ici, le protocole de notre test d’activité EVTF interne est présenté. Il y a trois étapes critiques dans le protocole. Lors de la reconstitution de la pastille EV, il est important de pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV, même si elle n’est pas visible. Une reconstitution incomplète de la pastille EV entraînera un faux négatif ou une sous-estimation des valeurs d’activité EVTF des échantillons. Deuxièmement, l’utilisation de HBSA-Ca(+) est essentielle à l’étape 6.5 du protoco.......

Déclarations de divulgation

Il n’y a pas d’intérêts concurrents à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) et la chaire John C. Parker (N.M.). Nous tenons à remercier Mme Sierra J. Archibald pour ses commentaires utiles

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifugeany companyN/AWe use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifugeany companyN/AWe use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tubeany companyN/AWe use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapterBD367281
96-well plateany companyN/AWe use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate TubesBD363083
Bovine serum albuminSigma AldrichA9418
Calcium chlorideFisher ScientificC69-500
Centrifuge for 1.5 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrateSigma AldrichE6511
HepesSigma AldrichH4034
Human FVIIaEnzyme Research LaboratoryHFVIIaThe solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FXEnzyme Research LaboratoryHFX1010The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1Fisher Scientific550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4Sigma AldrichL2630There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgGSigma AldrichI5381
Pefachrome FXa 8595Enzyme Research Laboratory085-27
Plate readerany companyN/AWe use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade InnovinSiemens10873566
Sodium chloride Fisher ScientificS271-500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima TLX
Ultracentrifuge rotorBeckman CoulterTLA-55

Références

  1. Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
  2. Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.

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